Name: Nociceptive 및 염증성 중재자의 조직 특정 측정을위한 인간 - VIVO의 Bioassay (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-12-01T00:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: 배우세요 인간 피부에서 미세투석 카테터를 이용한 간질액 채취 방법을 통한 통각 및 염증성 매개체 분석 기법을. 이 방법은 통증 메커니즘 연구와 염증 치료 개발에 활용됩니다.

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실험 염증의 유도 : <ol><li> 첫 학위 햇볕은 보정, 자외선 B 소스 (Saalmann Multitester SBB LT 499, Saalmann GmbH를, 헤리퍼드, 독일)의 도움을 허벅지의 비 빠져있었단 피부에 유도합니다. 햇볕에 노출이 피부의 완전한 붉어지는 것, 또는 세 번 최소한의 선용 복용량 (MED)을 원인 UVB의 빛의 양을 필요로 세 번 적용하여 microdialysis 실험을 시작하기 전에 24 시간 유도합니다. MED는 연구 개시 전에 각 과목에서 결정됩니다. 에너지의 정확한 전달이 함께 보장되는 UV - m (RM 12, 박사 Grobel UV - 전자 GmbH를, Ettlingen, 독일). </li></ol> 카테 테르 배치 및 샘플 컬렉션 <ol><li> 멸균 장갑, 23 게이지 (G) 바늘, 30G의 바늘로 1cc 주사기, 1 % lidocaine 1 무균 바늘 홀더, 1cc luer 팁 주사기와 준비 영역 준비, 알코올 면봉, 2x2 멸균 거즈 패드, microdialysis의 카테터는 하나 첨부 4cm 23G 바늘 (피부 투석, 에를랑겐, 독일), 그리고 드라이 아이스에 100μl 샘플 당 4μl 테아제 억제제 솔루션 1.5 ML Microcent 수집 튜브 (E &amp; K 과학적, 산타 클라라, CA.) 최종. 프로 테아제 억제제 솔루션은 테아제 억제제 칵테일의 타블렛을 (로체 진단, GmbH를, 만하임, 독일)를 사용하여 제조 업체의 지시마다 이루어집니다. </li><li> lactated 링어의 용액에 1 %의 인간 알부민 솔루션을 준비하고 1cc luer 팁 주사기로 그려, 주사기에 남아 기포가가 없는지 만들기. </li><li> 고정밀 주입 펌프 (펌프 22, 하버드 장치, 사우스 내틱, MA에 장착 크래들 (microdialysis 멀티 주사기 랙, 하버드 장치, 사우스 내틱, MA)에 1% 인간 알부민 - 풍부한 대타의 락트 솔루션 주사기로드 ). 주사기를 운전 주입 펌프의 막대가 주사기의 플런저와 함께 전체 접촉에 있는지 확인하십시오. 주사기의 직경이 정확 펌프에 입력되었는지 확인 후 펌프 속도를 설정합니다. 일반적으로 사용되는 주입 속도는 2 사이 4μl/min까지 다양합니다. </li><li> 당신이에서 샘플을 수집하려는 영역을 정의합니다. 같은 햇볕 위에서 설명한, 햇볕의 가장자리에 카테터를 삽입 계획으로 인위적으로 만들어 염증 지역에서 샘플링 때. </li><li> 당신은 알코올에서 샘플을 수집하고자하는 작은 병변의 반대편 가장자리 영역 또는 사이트를 청소합니다. 이 청소 구역은 카테터를위한 목적으로 삽입하고 종료 지점 것입니다. 충분히 내부 cutaneously lidocaine 주입 (주입에있는 피부의 창백에 의해 입증)이 사이트에서 아주 작은 물집을 (2mm 최대) 만들 수 있습니다. microdialysis의 카테터의 입구와 출구 지점에서 내부 피부 lidocaine 이러한 한계의 주입은 bioassay 결과를 변경하지 말아야하지만, 학습 과목 훨씬 덜 괴롭 카테터의 삽입을 않습니다. </li><li> 무균 기법을 사용하여 탐구 피부 영역의 길이를 통해 첨부 23G 바늘의 도움으로 microdialysis의 카테터를 삽입합니다. 삽입의 깊이가 커티스와 subcutis 사이의 인터페이스에 있습니다. 적절한 깊이에 삽입 광학 확인할 수 있습니다. 바늘과 연결된 카테터가 앞으로 이동으로 바늘은 피부뿐만 아니라 피부의 일부 창백 약간 상향 폴딩을 일으킬 것입니다. 아무도 출혈이 발생해서는 안됩니다. 출혈이 발생하는 경우 이것은 바늘이 깊이 예정보다 있으며 삽입의 깊이가 조정할 수있다는 것을 나타냅니다. 바늘이 피부의 출구 지점을 통해 밀고있다 일단 당신이 카테 테르의 길이를 따라 방울을 볼 때까지, 1 % 알부민 풍부한 대타의 락트 솔루션 카테터를 플러시. 이것은주의 깊게 microdialysis의 카테터의 말초 끝에 주사기 (23G 바늘)의 바늘 끝을 삽입하고, 천천히 솔루션을 주사하여 이루어집니다. </li><li> 플러싱 후 카테터가 피부를 통해 연결된 카테터 먹이를 바늘에 부드럽게 당기십시오. 카테터는 작은 직경, 그리고 결과적으로되기 때문에 젠틀 처리가 필요합니다. 그것이 완전히 피부를 통해 스레드 때까지 카테터를 당겨 즉, 카테터의 말초 끝을 포함 큰 플라스틱 튜브의 기본은 진입 점에서 피부를 접​​촉. 위에서 언급한 바와 같이 프로 시저의 끝 부분에 출혈은 거의 최적의 카테 테르의 위치를​​ 확인합니다. </li><li> 주입 펌프의 선반에 휴식 주사기의 23G 바늘 끝에 카테터의 말초 끝을 연결합니다. 관리는 카테터의 벽을 통해 바늘을 펑쳐링 피하기 위해 필요합니다, 이것은 잠재적인 누수의 원인 것입니다. </li><li> 카테 테르의 근위 끝에서 바늘을 잘라요. </li><li> ¼ 인치 핑크색 테이프를 사용하여 카테터의 출구 사이트에 가까운 피부에있는 준비 1.5ml Microcent 수집 튜브를 연결합니다. microdialysate의 수집을 허용하도록 컬렉션 관에 카테 테르의 끝에 놓습니다. 예정된 R에서 재관류 펌프를 시작합니다먹고 간헐적으로 그 전달과 수집 량이 일치 확인합니다. 경우에는 볼륨은 피부 항목 사이트에서 누설 (때로는 더 단단히 피부 항목 사이트에 플라스틱 튜브가 내장된 카테터의 일부를 당기는 해결할 수 있습니다) 제외되어야를 일치하지 않습니다. 배달 및 수집 볼륨이 일치하지 않는 경우 또는 카테터를 교체해야 할 수도 있습니다. </li><li> 일단 샘플링이 완료되면 샘플은 -80 º C.에 보관까지 드라이 아이스에 표시됩니다 </li></ol>

<ol><li>Angst, M. S., Clark, J. D., Carvalho, B., Tingle, M., Schmelz, M., Yeomans, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine+profile+in+human+skin+in+response+to+experimental+inflammation%2C+noxious+stimulation+and+administration+of+a+COX-inhibitor%3A+A+microdialysis+study%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Cytokine profile in human skin in response to experimental inflammation, noxious stimulation and administration of a COX-inhibitor: A microdialysis study.</a> Pain. 139, 15-27 (2008).</li>
</ol>

저자들은 공개할 사항이 없습니다.

microdialysis 기법과 멀티 플렉스 면역 분석법 기술의 결합 사용은 관심의 조직에 생화 학적 사건에 대한 통찰력을 제공하는 귀중한 실시간에 - 생체내 인간 bioassay입니다. 이러한 통증 시험으로 행동 검사와 결합, 방법은 통증과 염증을 중재 biochemicals의 복잡한 상호 작용을 연구하고 있습니다. 방법은 주변 조직 병리학과 염증과 만성 통증 조건의 병리에 기계론의 통찰력을 제공 통증과 염증, 2) 중재 조직 구체적인 생체를 식별) 1 약속, 3)의 진통 / 안티 hyperalgesic 및 안티 - 염증성 행동을 탐험입니다 소설 약물 후보와 interventional 치료.

<table><tbody><tr><td>마이크로투석 카테터</td><td>도구</td><td>Dermal Dialysis</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Pump 22</td><td>도구</td><td>Harvard Apparatus</td><td>552219</td><td></td></tr><tr><td>Saalmann Multitester SBB LT 400</td><td>도구</td><td>Saalmann GmbH</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>RM-12 IP-65 Radiometer</td><td>도구</td><td>Dr. Grobel UV Elektronik GmbH</td><td>82120000/81112100</td><td></td></tr><tr><td>Complete Proteinase Inhibitor</td><td>시약</td><td>Roche Group</td><td>11836145001</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 원심분리 튜브</td><td>도구</td><td>E&amp;amp;K Scientific</td><td>380150-X</td><td></td></tr><tr><td>Albumin 5%</td><td>시약</td><td>ZLB Behring</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>젖산 링거액</td><td>시약</td><td>Hospira Inc.</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Xylocaine-MPF</td><td>기타</td><td>AstraZeneca</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>1mL 주사기</td><td>도구</td><td>BD Biosciences</td><td>309602</td><td></td></tr></tbody></table>

nociceptive 및 염증성 중재자의 조직 특정 측정을위한 인간 - vivo의 bioassay

Human In-Vivo Bioassay for the Tissue-Specific Measurement of Nociceptive and Inflammatory Mediators

이 - 생체내 인간 bioassay 인간 자원 봉사자와 환자를 공부하는 데 사용할 수 있습니다. 샘플은 같은 무균 삽입 microdialysis의 카테터 (피부 투석, 에를랑겐, 독일)를 통해 피부와 같은 조직 관련 사이트에서 수집하고 있습니다. 이 예제에서 설명된 인간 자원 봉사자에 실험적으로 염증이 피부의 침입형 유체의 컬렉션입니다. 샘플 수집은 다른 실험 테스트와 함께하실 수 있습니다. 예를 들어, 로컬 출시 biochemicals 및 실험적으로 염증이 피부에 아픈 자극에 주관적인 감성의 동시 평가는 통증과 염증의 생체를 식별하는 중요한 생화학 - 행동 링크를 제공합니다. 살아있는 인간 유기체로 표시 분석 고통 및 / 또는 염증을 기본 조직을 특정 프로세스에 기계론의 통찰력을 허용합니다. 이러한 신약 후보로 - - 통증 및 / 또는 염증성 조건의 치료를 타겟팅하는 방법은 또 기존 또는 소설 개입의 효과를 조사하기 위해 적합합니다. 이 문서는 인간의 학습 과목의 실험적 염증 피부 병변에서 중간 액체를 수집하기 위해 microdialysis 기법의 사용에 대한 자세한 설명을 제공합니다. 중간 유체 샘플은 일반적으로 50 microliters으로 볼륨에서와 같이 작은 샘플 100 analytes까지 시금 수 있도록 멀티 플렉스 비드 어레이 immunoassays의 도움으로 처리됩니다.

기술은 통증과 염증을 중재 biochemicals의 측정을위한 관련 조직 사이트 (여기서, 실험적으로 염증 피부)에서 중간 액체 샘플에서 - 생체내 수집 제공됩니다.

Nociceptive 및 염증성 중재자의 조직 특정 측정을위한 인간 - VIVO의 Bioassay

이 인비보(in-vivo) 인체 바이오어세이는 건강한 지원자 및 환자를 대상으로 한 연구에 활용될 수 있습니다. 샘플은 ...을 통해 피부와 같은 관련 조직 부위에서 채취합니다.

이 영상은 보정된 UV 광원을 사용하여 환자의 허벅지에 실험적 일광 화상을 유도한 지 24시간 후에 시작됩니다. 국소 마취제를 도포한 후, 마이크로디알리시스 카테터를 절개 부위와 피하 조직 사이에 삽입한 다음 피부를 통해 끌어당깁니다. 카테터의 근위단에 퍼퓨전 시린지를 연결하고, 퍼퓨전 펌프를 작동시켜 마이크로 용해물의 흐름을 유도하고 이를 수집합니다.수집 후 샘플은 통각 및 염증 매개체 분석 준비가 될 때까지 -80 °C에서 보관할 수 있습니다. 안녕하세요, 저는 스탠포드 대학교 마취과에서 온 마틴 앙스트(Martin Angst)입니다. 그리고 안녕하세요, 저는 1995년 이곳 스탠포드 대학교에서 앙스트 박사에 의해 설립된 통증 연구소의 수석 연구 간호사이자 관리자인 마사 팅글(Martha Tingle)입니다.오늘은 간질액 수집을 위해 인체 연구 대상자의 실험적 염증 피부에 마이크로다이알리시스(Microdialysis) 카테터를 삽입하는 절차를 보여드리겠습니다. 저희 연구실에서는 통증 및 염증 매개에 중요한 생화학 물질의 조직 특이적 방출을 연구하기 위해 이 기술을 사용합니다. 그럼 시작하겠습니다.실험적 피부 염증 모델 중 하나는 인공 일광화상입니다. 보정된 자외선 B(ultraviolet B) 광원을 이용하여 1도 일광화상을 유도합니다. UV 측정기를 통해 에너지의 정확한 전달을 보장합니다.일광화상은 일반적으로 홍반을 유발하는 데 필요한 UVB 광량의 2~3배를 조사하여 유도합니다. 검체를 수집하기 전, 멸균 장갑, 멸균 니들 홀더, 23 gauge 및 30 gauge 바늘이 장착된 1 CC 루어 팁 주사기를 준비하여 스테이징 구역을 마련하십시오. 또한 한쪽 끝에 4 cm 23 gauge 바늘이 연결된 미세투석 카테터가 필요합니다. 샘플은 샘플 100 µL당 4 µL의 프로테아제 억제제 용액이 들어 있는 1.5 mL 마이크로 센트 수집 튜브에 수집합니다. 프로테아제 억제제 용액은 제조사의 지침에 따라 프로테아제 억제제 칵테일 정제를 사용하여 제조합니다. 젖산 링거액에 1% human albumin 용액을 준비하고 이를 1 cc 루어 팁 주사기에 흡입하며, 주사기에 공기 방울이 남아 있지 않도록 확인하십시오. 1% human albumin이 강화된 링거 젖산 용액이 담긴 주사기를 고정밀 인퓨전 펌프에 장착된 크래들에 로드합니다. 여러 개의 주사기를 로드하여 다양한 부위에서 간질액 샘플을 동시에 얻을 수 있습니다.주사기를 구동하는 인퓨전 펌프의 바(bar)가 주사기 플런저에 완전히 밀착되었는지 확인하십시오. 펌프에 주사기 직경이 정확하게 입력되었는지 확인한 후 펌프 속도를 설정하십시오. 일반적으로 사용되는 주입 속도는 2~4 µL/min 범위입니다.이제 카테터를 삽입할 준비가 되었습니다. 실험적으로 유도된 일광 화상과 같이 인위적으로 생성된 염증 부위에서 샘플을 채취하는 경우, 샘플 채취 영역을 명확히 정의해야 합니다. 일광 화상 부위의 가장자리에 카테터를 삽입하도록 계획하십시오.샘플을 채취하려는 병변 또는 C 부위의 서로 반대편 가장자리에서 작은 영역을 알코올 솜으로 닦아냅니다. 이렇게 닦아낸 영역이 카테터의 삽입 지점과 진출 지점이 됩니다. 30게이지 바늘이 장착된 1 cc 주사기를 사용하여 1% Lidocaine을 주입합니다. 주입 시 피부가 팽팽해지는 것이 확인되면, 해당 부위에 최대 2 mm 크기의 매우 작은 수포(bleb)가 형성될 정도의 소량의 lidocaine만 주입합니다. 무균 조작법을 사용하여 마이크로다이알리시스 카테터의 진입 및 진출 지점에 소량의 lidocaine을 주입하면 피실험자의 카테터 삽입 통증을 줄일 수 있으며, 이는 바이오어세이 결과에 영향을 미치지 않습니다.부착된 23 gauge 바늘을 사용하여 탐색할 피부 영역의 길이를 따라 마이크로투석 카테터를 삽입합니다. 삽입 깊이는 피부 절개면과 피하 조직 사이의 경계면으로 합니다. 바늘과 부착된 카테터를 앞으로 밀어 넣으면서 적절하게 침투되었는지 시각적으로 확인합니다.바늘은 피부를 약간 위로 접히게 하며 피부의 일부가 창백해지게 해야 합니다. 출혈이 발생해서는 안 됩니다. 만약 출혈이 발생한다면 바늘이 의도한 것보다 더 깊게 위치한 것이므로 삽입 깊이를 조정해야 합니다.바늘이 피부의 출구 지점을 통해 밀려 나오면, 바늘을 부드럽게 당겨 연결된 카테터가 피부를 통해 통과하도록 합니다. 카테터의 직경이 작고 매우 취약하므로 조심스럽게 다루는 것이 중요합니다. 카테터가 피부를 완전히 통과하여 더 굵은 플라스틱 튜브의 기저부까지 도달할 때까지 당겨 줍니다.카테터의 원위단이 삽입 지점의 피부에 닿도록 고정해야 합니다. 다시 한번, 출혈이 거의 또는 전혀 없어야 하며 이는 카테터가 올바르게 배치되었음을 나타냅니다. 시료 수집을 시작하려면, 먼저 카테터를 1% albumin이 강화된 링거 젖산 용액으로 플러싱하십시오.이는 23 gauge 바늘이 장착된 주사기를 미세투석 카테터의 원위단에 조심스럽게 삽입하고 용액을 천천히 주입함으로써 수행됩니다. 카테터의 팁뿐만 아니라 전체 길이를 따라 액체 방울이 보일 때까지 카테터를 플러싱하십시오. 카테터 플러싱 후, 카테터의 원위단을 주입 펌프 랙에 거치된 주사기의 23 gauge 바늘 팁에 연결하십시오.1/4인치 분홍색 테이프를 사용하여 카테터 벽을 뚫지 않도록 주의하십시오. 벽을 뚫을 경우 누출이 발생할 수 있습니다. 준비된 1.5 milliliter 마이크로 원심분리 수집 튜브를 카테터 출구 쪽 피부 근처에 부착하십시오. 마이크로 용해물을 수집할 수 있도록 카테터 끝을 수집 튜브 안에 넣으십시오.미리 설정된 속도로 관류 펌프를 가동하고, 주입량과 수집량이 일치하지 않을 경우를 대비해 주기적으로 두 부피가 일치하는지 확인하십시오. 피부 진입 부위에 누출이 있는지 확인하십시오. 진입 부위의 누출은 플라스틱 튜브에 매립된 카테터 부분을 피부 진입 부위 쪽으로 더 단단히 당겨서 해결할 수 있는 경우가 있습니다.또는, 카테터를 통해 시료를 전달하고 수집한 경우 카테터를 교체해야 할 수도 있습니다. 샘플링이 완료된 후 부피가 일치하지 않는 경우가 발생합니다. 수집된 샘플은 -80 °C에서 보관하기 전까지 드라이아이스 위에 놓아 둡니다.지금까지 마이크로다이얼리시스 카테터를 사용하여 실험적으로 염증이 유도된 피부에서 간질액을 수집하는 방법을 살펴보았습니다. 이제 면역 분석법을 통해 수집된 샘플 내의 통증 및 염증 생화학적 마커를 분석할 준비가 되었습니다. 이 절차를 수행할 때는 카테터를 매우 조심스럽게 다루는 것이 중요하며, 튜빙에 장력이 가해지지 않도록 카테터를 천천히 삽입해야 합니다. 또한 삽입 전에 연구의 주입 단계에서 준비한 멸균 용액을 소량 사용하여 카테터를 윤활시키면 도움이 될 수 있습니다.이상입니다. 시청해 주셔서 감사하며, 여러분의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

특정 시간 지점에서 수술 상처를 생화 학적 중재자를 수집하고 측정하는 기술.

외과 듀엣으로 Nociceptive 및 염증성 중재자를 수집 및 측정

인간의 학습 과목의 실험적 염증 피부에 열 및 기계적 통증 임계값을 평가 알고리즘이 표시됩니다. 두 통증 테스트 패러다임이 독립적으로 통증을 전달하는 두 가지 주요 말초 신경 섬유 집단에 의해 nociceptive 처리를 검토, 즉 비 myelinated C 섬유와 작은 A - 델타 섬유를 myelinated.

열과 인간 주제에 염증이 피부에 기계적 통증 임계값 결정

이 비디오는 인간 폐 조직 유래 면역 세포를 헤모필루스 인플루엔자로 배양하여 감염 중 염증 매개체의 정량화를 보여줍니다. 유세포 분석법은 표지된 림프구에서 사이토카인 형광을 측정하는 데 사용되며, 이는 박테리아 감염에 대한 반응으로 전염증성 사이토카인 생성과 상관관계가 있습니다.

감염된 인간 조직 유래 세포에서 염증 매개체의 정량화

고통스러운 신경 병증 (PN)의 통각 intraepidermal 신경 섬유 (IENFs)의 변화를 연구하기 위해, 우리는 직접 통각 IENFs에서 관찰 입체 형태 변화를 검사 할 수 프로토콜을 개발했다. IENFs의 3 차원 분석은 PN에 IENF의 형태 학적 변화를 평가하는 잠재력을 가지고있다.

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열 및 기계를 침해 수용성 모달리티를 사용하여 마우스의 모르핀에 의한 통각 과민과 진통 공차의 평가

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비 침습적<em&gt; In Vivo</em&gt; 활성화 가능한 형광 이미징 에이전트를 사용한 염증성 MMP 활성의 형광 광학 이미징

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