Name: Drosophila 애벌레 NMJ의 해부 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-02-04T00:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 42 s
Description: 배우세요 Drosophila 애벌레 해부법을 통해 신경근육접합부(NMJ)를 면역조직화학 및 영상 분석에 활용하는 방법을 익히세요. 이 표준화된 기술은 시냅스 전달 및 발달 연구에 필수적입니다.

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당신이 시작하기 전에 <ol><li> 모든 문화가 25 ° C.에 성장한다 </li><li> HL3.1 해부 버퍼는 사전에 준비 수 있습니다. HL3.1 50 ML의 나누어지는을 가지고하고 얼음에 보관하십시오. </li><li> HL3.1에 ​​신선한 3.5 %의 포름 알데히드의 15 ML을 준비합니다. 그 얼음 보관하십시오. </li></ol> 애벌레 해부 <ol><li> 해부 접시에 감기 HL3.1 한 방울을 넣어. 이것은 쉽게 사용할 수 있도록 동물을 건조하고 기절에서 동물을 유지합니다. </li><li> 긴 집게를 사용하여 떠도는 셋째 instar의 유충을 선택하고 HL3.1의 드롭에 놓으십시오. </li><li> 첫째, minutien 핀을 파악하기 위해 짧은 집게를 사용합니다. 뒷부분 spiracles 사이에 핀을 놓습니다. 동물은 보통 자체를 스트레칭하고 입 후크 근처 유충의 머리에 정면 핀 배치하는 것이 쉽게 핀 멀리 크롤 링을 시도합니다. 길이 동물 내밀 어라. 이것은 당신이 절삭하는 동안 얻을 수 있습니다 노출된 신체 벽의 양을 최대화하는 데 도움이됩니다. 참고 : 먼저 머리를 핀을 선택하면, 동물은 핀 주위의 시신을 포장하거나 어려운 핀 수 있도록 앞뒤로 그 몸에 채찍 수 있습니다. 당신은 일반적으로 HL3.1를 제거하고 다시 멋진 새로운 감기 드롭 동물을 넣어 이것을 카운터 수 있습니다. 양손 잡이 과학자는 단지 동물을 잡고 제자리에 고정하실 수 있습니다. </li><li> 를 사용하여 스프링 가위는 유충의 등의 측면에서 사후 핀 단 앞쪽에 수평 절개를합니다. 절개에 가위 중 하나 블레이드를 삽입하고 유충의 주동이의 끝을 향해 등의 정중선을 따라 수직으로 절단합니다. 동물의 연단에서 오른쪽 핀의 왼쪽 및 수평 incisions는합니다. 참고 : 완성된 결과가 rostrocaudal 축을 따라 유충의 지느러미 측면에 나처럼 보이게한다. </li><li> 장기를 제거합니다. 유충에 HL3.1 여러 추가 방울을 넣어 시작합니다. 이것은 장기가 더 쉽게 제거할 수 있도록 신체의 밖으로 최대 부동 수 있도록합니다. 첫째, tracheal 시스템을 제거합니다. 둘째, 장기의 나머지 부분을 움켜 포셉를 사용하여 그들을 제거합니다. </li><li> 3 단계 동안 시체는 벽에서 왼쪽 및 오른쪽 플랩 플랩을했다. 모두 수직 및 수평 몸을 벽을 스트레칭해야하고 시계 방향 순서로 펄럭를 핀. </li></ol> 정치 25 분 HL3.1에서 3.5 %의 포름 알데히드의 각 동물을 수정. 5 분 두 번 HL3.1에있는 동물을 씻으십시오. 저장 핀을 제거하고 1X PBS를 포함하는 1.5 ML 튜브에 애벌레를 전송할 수 있습니다. 이 이미지를 융합 형광 태그를 사용하여 NMJ를 계획하는 경우 이틀 이내에 이미지가 동물을해야합니다. 당신은 4 ° C. 한 주일에 대한 해부 애벌레를 저장할 수 있습니다 대표 결과 제대로 해부 Drosophila의 유충 몇 가지 주요 구성 요소가 있습니다. 첫째, 하나는 특히 근육, 근육 4, 6, 7을 손상하지 않도록 여분의 처리한다. 이러한 연구에 가장 인기있는 근육이며, 그들이 손상된 경우 등심 준비를 버리고 다른 동물을 해부하다. 둘째, 하나는 동물 maximally 각 근육 NMJ가 구분할 수 있도록 뻗어 있는지 확인합니다.

<ol><li>Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+the+larval+neuromuscular+junction+in+Drosophila+Melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila Melanogaster.</a> J. Physiol. 262, 189-214 (1976).</li>
<li>Johansen, J., Halpern, M. E., Johansen, K. M., Keshishian, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereotypic+morphology+of+glutamatergic+synapses+on+identified+muscle+cells+of+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Stereotypic morphology of glutamatergic synapses on identified muscle cells of Drosophila larvae.</a> J Neurosci. 9, 710-725 (1989).</li>
<li>Kesheshian, H., Broadie, K., Chiba, A., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+neuromuscular+junction%3A+a+model+system+for+studying+synaptic+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The Drosophila neuromuscular junction: a model system for studying synaptic development and function.</a> Annu Rev Neurosci. 19, 545-575 (1996).</li>
<li>Vactor, D. V., Sink, H., Fambrough, D., Tsoo, R., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+that+control+neuromuscular+specificity+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Genes that control neuromuscular specificity in Drosophila.</a> Cell. , 73-1137 (1993).</li>
<li>Feng, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+minimal+hemolymph-like+solution%2C+HL3.1%2C+for+physiological+recordings+at+the+neuromuscular+junctions+of+normal+and+mutant+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurogenet%22%5BJournal%5D)">A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae.</a> J Neurogenet. 18 (2), 377-402 (2004).</li>
</ol>

이 동영상에서 보여주 절개 기법은 실험 기법의 다양한 Drosophila의 애벌레를 준비하는 데 사용할 수 있습니다. 형광 단백질 태그가 존재하는 경우, 애벌레가 탑재 바로 몇 군데 있습니다. 그렇지 않으면, immunostaining는 특정 신경 구획을 표시하기 위해 수행할 수 있습니다. 또한, 전기 생리학 쉽게 neurotransmission의 기능을 평가할 수있는 해부 애벌레에서 수행할 수 있습니다. Drosophila의 NMJ의 기본 구조와 기능을 조명 초기 연구부터 큰 인기를 얻고있다. 1-4은 Drosophila NMJ의 개발 연구에 확인된 분자의 대부분은 척추 동물에 보존되어있다. 4 따라서, 많은 Drosophila NMJ 연구를 통해 배운 지식은 모든 생명체의 신경 생물학에 적용됩니다. 몇 가지 응용 프로그램은 축삭지도에 관련된 분자의 연구, 모터 신경 질환...

HL3 해부 버퍼 : (MM)를 70 NaCl, 5 KCl, CaCl2 0.2, 20 MgCl2, 10 NaHCO3, 5 trehalose, 115 자당, 5 HEPES, pH를 7.3.<br /<br /&gt; Sylgard 분석 해 봅시다 플레이트 : 부드럽게 혼합 (거품을 피하기 위해) 비커에 10시 1분. 페트리 접시 (모든 크기)로 혼합 하거라. SylGard은 37C 배양기에서 하룻밤 치료 수 있습니다.

drosophila 애벌레 nmj의 해부

Drosophila Larval NMJ Dissection

<em&gt; Drosophila</em&gt; 신경근육학 교차점 (NMJ)은 시냅스 개발 및 소성 연구에 사용되는 기존 모델 시스템입니다. 의 널리 사용<em&gt; Drosophila</em&gt; 모터 시스템은 높은 접근성 때문입니다. 이것은 단일 셀 해상도 분석하실 수 있습니다. 그의 배열 주변 본문 벽 내에 알려져 있습니다 hemisegment 30 근육이 있습니다. 35 모터 뉴런의 총 높은 충실도를 가진 패턴 이러한 근육을 첨부합니다. 분자 생물학과 유전학을 사용, 하나는 유전자 변형 동물이나 돌연변이를 만들 수 있습니다. 그런 다음, 하나는 NMJ의 형태와 기능의 발달 결과를 공부할 수 있습니다. 연구 NMJ에 액세스하려면, 그것은 신중하게 각각의 유충을 해부하다하는 것이 필요합니다. 이 문서에서 우리는 제대로 해부하다하는 방법을 보여줍니다<em&gt; Drosophila</em신체 벽은 그대로 둔 동안 모든 내장을 제거하여 NMJ의 연구&gt; 애벌레. 이 기술은 이미징, immunohistochemistry, 또는 전기 생리학에 대한 유충을 준비하기 위해 적합합니다.

이 프로토콜은 해부하다하는 방법을 보여줍니다<em&gt; Drosophila</emimmunohistochemistry 및 / 또는 신경근육학 교차점의 이미징을위한 준비&gt; 애벌레.

Drosophila 애벌레 NMJ의 해부

초파리(Drosophila)의 신경근 접합부(neuromuscular junction, NMJ)는 시냅스 발달 및 가소성 연구에 사용되는 확립된 모델 시스템입니다. 광범위한 사용...

본 과정은 3령 유충을 해부 접시에 올려두는 것으로 시작합니다. 유충의 후단과 전단에 핀을 고정합니다. 가위를 사용하여 유충의 외피를 절개하고, 핀셋을 이용해 내부 기관을 제거합니다.마지막으로, 고정하는 동안 유충의 체벽을 팽팽하게 유지하기 위해 몸체 각 모서리에 핀 4개를 더 꽂습니다. 안녕하세요, 저는 컬럼비아 대학교 의과대학 생리학 및 솔로 생물물리학과의 Brian McCabe 연구실 소속 Jonathan Brent입니다. 오늘은 초파리 유충의 해부 및 MJ 해부 절차를 보여드리겠습니다.저희 실험실에서는 신경근 접합부의 시냅스 발달을 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다. 그럼 시작하겠습니다. 초파리 유충의 반분절(hemi segment)당 30개의 근육이 있으며, 말초 체벽 내에서의 배열이 알려져 있습니다.총 35개의 운동 뉴런이 매우 정형화된 패턴으로 이 근육들에 분포합니다. 신경근 접합부(NMJ)에 접근하려면 적절한 해부법을 통해 각 유충을 세심하게 해부해야 합니다. NMJ는 면역 조직 화학적 이미징이나 전기 생리학 연구에 활용될 수 있습니다.해부 플레이트에 HL 3.1 버퍼 한 방울을 떨어뜨려 절차를 시작합니다. 버퍼는 미리 준비하여 얼음 위에서 냉각해 둡니다. 큰 스테인리스스틸 핀셋을 사용하여 바이알 측면에서 이동 중인 제3 말단 성형 유생(third end star larvae)을 조심스럽게 집어 올립니다.해당 움직임은 유충이 아직 번데기 단계로 진입하지 않았음을 나타냅니다. 유충의 등 쪽이 위로 향하도록 해부판 위의 버퍼 방울 속에 놓습니다. 차가운 버퍼는 유충을 마취시켜 정지 상태로 유지합니다. 핀셋을 사용하여 후방 구형부 사이에 곤충 핀 하나를 꽂은 다음, 유충이 펴져서 개방 준비가 되도록 어두운 색의 구강 갈고리 근처에 두 번째 핀을 꽂습니다.스프링 가위를 사용하여 유충의 후단 방향으로 작은 수평 절개를 만듭니다. 가위 날 하나를 절개 부위에 삽입하고 유충의 전단 방향으로 세로 절개를 합니다. 그 다음, 핀의 좌우 양측 전단 부위에 수평 절개를 만듭니다.장과 같은 기관을 제거하려면 동물에 HL 3.1 완충액을 몇 방울 가합니다. 그러면 장과 다른 기관들이 용액 위로 떠오르며, 이때 포셉을 사용하여 체내에서 분리해 낼 수 있습니다. 또한, 다른 기관들과 함께 기관계를 제거합니다. 이제 절개 부위에 생긴 플랩을 핀으로 고정하여 내부 체근을 노출시킵니다.체벽을 수평 및 수직 방향으로 충분히 펼쳐 주십시오. 플랩을 핀으로 고정할 때, 남아 있는 장기 조각들을 모두 제거하고 한 번 세척하십시오.신선한 HL 3.1 버퍼를 추가하면, 이제 1x PBS에 3.5%로 희석하여 새로 제조한 포름알데히드로 유충을 고정할 준비가 된 것입니다. 유충을 고정액에 완전히 침전시킨 후 25분 동안 기다립니다. 고정 시간이 지나면, HL 3.1 버퍼로 유충을 3분 동안 두 번 세척합니다. 핀을 조심스럽게 제거하고, 필요한 경우 1x PBS가 들어 있는 1.5 mL 튜브로 유충을 옮깁니다.유충은 4°C에서 최대 이틀 동안 보관할 수 있습니다. 최적의 결과를 위해 해부한 유충은 즉시 사용하십시오. 적절하게 해부된 초파리 유충에는 몇 가지 핵심 구성 요소가 있습니다.첫째, 근육, 특히 6번, 7번, 4번 근육이 손상되지 않도록 주의하십시오. 둘째, 동물을 적절하게 신전시켜야 합니다. 그렇지 않으면 신경근 접합부(neuromuscular junction)에 접근하기 어렵거나 이를 구분하기 어려울 수 있습니다.여기서 적절하게 해부된 유충을 확인할 수 있습니다. NMJ가 명확하게 보이며 이제 실험을 위한 준비가 완료되었습니다. 지금까지 신경근 접합부를 연구하기 위해 식도 유충을 해부하는 방법을 살펴보았습니다.이 절차를 수행할 때 근육을 손상 없이 보존하는 것이 중요합니다. 근육이 손상되면 연구할 신경근 접합부가 사라지기 때문입니다. 이것으로 모든 과정을 마칩니다.시청해주셔서 감사하며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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연구

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생물학

이 문서에서 우리는 세번째 instar Drosophila의 유충에서 중추 신경계를 해부하다하는 방법을 보여줍니다.

Drosophila Melanogaster에서 애벌레 CNS의 해부

이 프로토콜은 해부 Drosophila의 유충에 immunohistochemistry을 수행하는 방법을 보여줍니다.

Drosophila 애벌레 NMJ Immunohistochemistry

Drosophila melanogaster의 애벌레가 애벌레 segmental 신경 이내 axonal 수송의 메커니즘을 조사하기 위해 이상적인 모델 시스템을 제공합니다. 이 절차를 사용하여 다양한 변이를 갖고 제 3 instar의 애벌레는 야생 타입 애벌레 비교할 수 있습니다.

3 애벌레 Segmental 신경의 시각화 차 Instar Drosophila 애벌레 준비

이 프로토콜은 그대로의 anesthetization 및 이미징을위한 신뢰할 수있는 방법을...

서브 세포 해상도 손상 Drosophila의 애벌레의 생체내 이미징에서

의 활성 영역의 해부 및 이미징 Drosophila 신경근육학 융티온

현장 패치에 클램프 녹음은 그대로 회로의 뉴런의 electrophysiological 특성에 사용됩니다. CNS는 작고 강력한 피복에 둘러싸여 있기 때문에 Drosophila 유전자 모델 패치를 고정으로 어렵습니다. 이 문서는 이후의 패치 클램프 녹음의 집과 깨끗한 뉴런을 제거 할 수있는 절차에 대해 설명합니다.

의 작성<em&gt; Drosophila</em에 대한&gt; 중부 뉴런<em&gt; 현장에서</em&gt; 패치 클램핑

이 비디오에서 초파리 유충 신경 섬유는 세포막 지질에 결합하는 FM 염료에 잠겨 있습니다. 흡입 미세전극 및 전기 펄스는 세포내이입 과정을 자극하여 FM 염료를 새로 형성된 세포내포에 통합합니다. 신경 전달의 시냅스 전 단계를 시각화하는 이 방법은 시냅스 기능과 신경전달물질 방출을 연구하는 데 유용합니다.

Microelectrode-Mediated FM Dye loading and unloading in Drosophila 유충 신경 세포의 검출기

세포 내 소기관의 형태, 크기 및 위치는 진화적으로 보존되어 있으며 그 기능에 직접적인 영향을 미치는 것으로 보입니다. 이러한 과정의 기저에 있는 분자 메커니즘을 이해하는 것은 현대 생물학의 중요한 목표가 되었습니다. 여기에서 우리는 정량적 기술을 적용하여 이러한 연구를 촉진할 수 있는 방법을 보여줍니다.

상기 표현형의 특성을 : 정량이 중요한 이유<em&gt; 초파리</em&gt; 애벌레 신경 근육 학 분기점

여기에 우리는 세 번째 instar 애벌레의 neuromuscular 접합 (NMJ)에서 모터 뉴런의 신경 퇴화를 시각화하고 계량하기 위해 초파리 유충의 분절 신경을 손상시키는 간단하고 널리 액세스 할 수있는 방법을 설명합니다.

학습 할 간단한 신경계 상해 방법론<em&gt; Drosophila</em&gt; 모터 뉴런 변성

우리는 신경 근육 접합의 건축을 보존하고 성인 Drosophila 다리에 있는 운동 신경의 상세한 면역 세포화학 연구 를 가능하게 하는 해부 기술을 기술합니다.

확인된 모터 뉴런을 위한 신경근육 정션에서 변경을 검출하기 위하여 Drosophila 성인 다리의 해부 및 면역 조직 화학

여기에서는 신경근 접합부와 근육 세포의 미세소관 네트워크를 시각화하기 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다. Drosophila melanogaster의 강력한 유전 도구와 결합된 이 프로토콜은 신경계에서 미세소관 네트워크 조절 단백질의 역할에 대한 유전자 스크리닝 및 미세소관 역학 분석을 크게 용이하게 합니다.

초파리 유충 신경근 접합부 및 근육 세포를 사용하여 미세소관 네트워크 시각화

배우세요 Drosophila 애벌레 해부법을 통해 신경근육접합부(NMJ)를 면역조직화학 및 영상 분석에 활용하는 방법을 익히세요. 이 표준화된 기술은 시냅스 전달 및 발달 연구에 필수적입니다.

Drosophila 애벌레 NMJ의 해부

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