Drosophila 애벌레 NMJ의 해부

이 절차는 3령 유충을 해부 접시 위에 올려놓는 것으로 시작합니다. 유충의 후단과 전단에 핀을 고정합니다. 가위로 유충을 절개하여 열고, 핀셋을 사용하여 내부 장기를 제거합니다.

마지막으로, 고정 과정 동안 몸체가 팽팽하게 유지되도록 유충의 몸벽 각 모서리에 핀 4개를 더 꽂습니다. 안녕하세요, 저는 컬럼비아 대학교 의과대학 생리학 및 사회 생물물리학과 Brian McCabe 연구실의 Jonathan Brent입니다. 오늘은 초파리 유충 및 MJ 해부 절차를 보여드리겠습니다.

본 실험실에서는 신경근 접합부의 시냅스 발달을 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다. 그럼 시작하겠습니다. 초파리 유충의 반분절(hemi segment)당에는 30개의 근육이 있으며, 말초 체벽 내의 배열 상태가 이미 알려져 있습니다.

총 35개의 운동 뉴런이 매우 정형화된 패턴으로 이 근육들에 분포합니다. 신경근 접합부(NMJ)에 접근하려면 적절한 해부법을 통해 각 유충을 세밀하게 해부해야 합니다. NMJ는 면역 조직 화학 염색 이미징이나 전기 생리학 연구에 활용될 수 있습니다.

해부 플레이트에 HL 3.1 버퍼 한 방울을 떨어뜨려 절차를 시작합니다. 버퍼는 사전에 제조하여 얼음 위에서 냉각시킨 상태여야 합니다. 대형 SS 포셉을 사용하여 바이알 측면에서 움직이는 3차 말단 별 모양 유생(third end star larvae)을 조심스럽게 집어 올립니다.

이러한 움직임은 유충이 아직 번데기 단계에 진입하지 않았음을 나타냅니다. 해부판 위의 버퍼 방울에 유충의 등쪽이 위로 향하게 놓으십시오. 차가운 버퍼는 유충을 마취시켜 움직이지 않게 합니다. 핀셋을 사용하여 후방 구형 돌기 사이에 민우친 핀(mnuchin pin)을 꽂은 다음, 유충이 팽팽하게 펴져 벌릴 준비가 되도록 어두운 색의 구강 갈고리 근처에 두 번째 핀을 꽂으십시오.

스프링 가위를 사용하여 유충의 후단 방향으로 작은 수평 절개를 가합니다. 가위 날 하나를 절개 부위에 삽입하고 유충의 전단 방향으로 세로 방향으로 절개합니다. 그 다음, 핀의 좌우 전단 부위에 수평 절개를 가합니다.

장과 같은 기관을 제거하려면, 동물에 HL 3.1 버퍼를 몇 방울 가합니다. 그러면 장과 다른 기관들이 용액 위로 떠오르며, 이때 핀셋을 사용하여 몸체에서 떼어낼 수 있습니다. 또한, 다른 기관들과 함께 기관계를 제거하십시오. 이제 절개하여 만든 플랩을 핀으로 고정하여 뒤로 젖힘으로써 내부 체근을 노출시킵니다.

체벽을 가로와 세로 방향으로 충분히 펼쳐주십시오. 플랩(flap)을 핀으로 고정할 때, 남아 있는 장기 조각들을 제거하고 한 번 세척하십시오.

신선한 HL 3.1 버퍼를 추가하면, 이제 1XPBS에 3.5%로 희석하여 갓 제조한 포름알데히드로 유충을 고정할 준비가 된 것입니다. 유충을 고정액에 완전히 담그고 25분 동안 기다립니다. 고정 시간이 지나면 HL 3.1 버퍼로 유충을 3분 동안 두 번 세척합니다. 핀을 조심스럽게 제거한 후, 필요한 경우 1XPBS가 들어 있는 1.5 mL 튜브로 유충을 옮깁니다.

유충은 4°C에서 최대 이틀 동안 보관할 수 있습니다. 최적의 결과를 얻으려면 해부한 유충을 즉시 사용하십시오. 적절하게 해부된 초파리 유충에는 몇 가지 핵심 구성 요소가 있습니다.

첫째, 근육, 특히 6번, 7번 및 4번 근육이 손상되지 않도록 주의하십시오. 둘째, 동물을 적절하게 신전시켜야 합니다. 그렇지 않으면 신경근 접합부에 접근할 수 없거나 이를 구분하기 어려울 수 있습니다.

여기 적절하게 해부된 유충을 볼 수 있습니다. NMJ가 명확하게 보이며, 이제 실험 준비가 완료되었습니다. 지금까지 신경근 접합부를 연구하기 위해 식도 유충을 해부하는 방법을 보여드렸습니다.

이 절차를 수행할 때 근육을 손상되지 않은 상태로 유지하는 것이 중요합니다. 근육이 손상되면 연구할 신경근 접합부가 사라지게 됩니다. 이상입니다.

시청해 주셔서 감사드리며, 귀하의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.