Name: Drosophila 애벌레 NMJ Immunohistochemistry (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-03-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: 학습하세요 Drosophila 애벌레 NMJ 면역조직화학을 통해 시냅스 발달 관련 단백질을 시각화하는 방법을. 1차 및 2차 항체 처리와 세척 단계를 포함한 이 기법은 신경발달 연구에 필수적인 유전자 조절 메커니즘을 규명하는 데 활용됩니다.

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당신이 시작하기 전에 <ol><li> 다음과 같은 솔루션을 준비 : PBT (1X PBS에 0.​​1 %의 트리톤의 X100), PBTB (0.2 % PBT에서 BSA) 및 PBTN (PBTB에서 2 % NGS)을. </li><li> Drosophila의 유충을 해부하다. Drosophila 애벌레 NMJ의 절개를 참조하십시오. </li></ol> Immunohistochemistry <ol><li> PBT를 포함하는 1.5 ML 튜브에 애벌레로 이동합니다. PBT에서 15 분 동안 두 번 애벌레를 씻으십시오. 참고 : 세척하는 nutator 믹서에 1.5 ML 튜브를 놓습니다. pippetor와 액체를 제거하고 신선한 액체로 대체합니다. </li><li> PBT를 제거합니다. 30 분 두 번 PBTB로 씻으십시오. </li><li> PBTB를 제거합니다. 15 분 동안 두 번 PBTN로 씻으십시오. </li><li> 1 시간 또는 밤새 4 º C에서 온도는 실온에서 PBTN에 희석 일차 항체에 품어. </li><li> PBTB로 두 번 씻어. 참고 : 추가적인 솔루션을 씻어 신속하게 제거하실 수 있습니다. </li><li> PBTB에서 1​​5 분 동안 두 번 씻으십시오. </li><li> 30 분 PBTN로 씻으십시오. </li><li> PBTN에 희석 보조 항체 (그리고 하나를 사용하는 경우에는 복합 기본 항체)에 품어. </li><li> 상온에서 1.5 시간 동안 석박과 부화에 커버. </li><li> PBTB로 두 번 씻어. </li><li> PBTB와 함께 15 분 동안 두 번 씻으십시오. </li><li> 설치를 진행합니다. </li></ol> 설치 참고 : 샘플은 즉시 몇 군데가 될 수 글리세롤에 마운트합니다. 샘플 이미징 전에 저장됩니다 경우 (일주일 이상) 또는 시료가 여러 번 몇 군데해야하는 경우 골드 연장에 탑재합니다. 사용하려면, 2-3 분 동안 65 º C의 물을 욕조에 연장의 병을 넣으십시오. 골드 연장의 나누어지는를 타고 45-50 º C.에 열을 블록에 유의 <ol><li> 시계 유리에 PBT의 스테인드 preps 하거라. </li><li> 처리를위한 깨끗한 유리 슬라이드에 일부 글리세롤 놔. </li><li> 포셉을 사용하여 모서리로 시계 유리의 그들을 채취하여 처리 슬라이드로 동물을 이동합니다. 그들은 아래 표피 사이드 있도록. </li><li> 가공 유리 슬라이드에 신선한 면도날로 머리와 꼬리를 제거합니다. 블레이드 # 16과 함께 exacto - 칼로이 일을 잘 작동합니다. </li><li> 다른 슬라이드에 (슬라이드를 장착), 글리세롤의 작은 방울을 넣어 / 청소 집게로 연장하고 확산. </li><li> 그들을 반대로하지 돌보는 그들의 가장자리에 의해 장착 슬라이드를 해부 동물을 이동합니다. 같은 방향으로 행에서 그들을 탑재하려고. 슬라이드마다 6-8 동물을 탑재합니다. </li><li> 연장 / 글리세롤에 우위를 넣어 천천히 그것을 출시하여 표지 용지를 놓습니다. </li><li> 손톱 광택과 슬라이드를 밀봉합니다. 참고 [니스가 마른 때까지 이미지를하지 마십시오. 이것은 일반적으로 10 분 걸립니다. 연장 황금 장착 샘플, 밀폐 또는 영상 이전에 최소한 세 시간은 슬라이드를 건조하게.] </li></ol>

<ol><li>Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+the+larval+neuromuscular+junction+in+Drosophila+Melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila Melanogaster.</a> J. Physiol. 262, 189-214 (1976).</li>
<li>Johansen, J., Halpern, M. E., Johansen, K. M., Keshishian, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereotypic+morphology+of+glutamatergic+synapses+on+identified+muscle+cells+of+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Stereotypic morphology of glutamatergic synapses on identified muscle cells of Drosophila larvae.</a> J Neurosci. 9, 710-725 (1989).</li>
<li>Kesheshian, H., Broadie, K., Chiba, A., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+neuromuscular+junction%3A+a+model+system+for+studying+synaptic+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The Drosophila neuromuscular junction: a model system for studying synaptic development and function.</a> Annu Rev Neurosci. 19, 545-575 (1996).</li>
<li>Collins, C. A., DiAntonio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+development%3A+insights+from+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Synaptic development: insights from Drosophila.</a> Curr Opin Neurobiol. 17 (1), 35-42 (2007).</li>
</ol>

그것은 NMJ의 시각화를 가능하게하기 때문에 Immunohistochemistry (IHC)는 NMJ 생물학 연구를위한 중요합니다. 이것은의 연결 멤브레인 (예 : HRP), presynapse (예 : CSP, SYT), 및 / 또는 postsynapse (예 : DLG)를 인식 항체를 사용하여 수행됩니다. 신호 분자, 구조 단백질, 또는 관심있는 소설 단백질도 얼룩 수 있습니다. 그렇다면 유전자가 변이된 또는 missexpressed하고, IHC는 시냅스 구조 및 / 또는의 연결 신호의 섭동를 검색할 수 있습니다. Drosophila의 NMJ는 기본 구조와 기능을 조명 초기 연구부터 큰 인기를 얻고있다. 1-4은 Drosophila NMJ 연구에서 확인된 분자의 대부분은 척추 동물에 보존되어있다. 4 따라서, 통찰력이 연구를 통해 배운 Drosophila NMJ 많은 시스템에서 신경 생물학에 적용됩니다...

<table><tbody><tr><td>실체현미경 &amp;#8220;Stemi&amp;#8221; 2000</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>495101-9804-000</td><td></td></tr><tr><td>광원 KL 1500 LCD</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>000000-1063-181</td><td></td></tr><tr><td>Dumont SS 핀셋</td><td>Fine Science Tools</td><td>11200-33</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 핀셋</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Adams&amp;#8482; 뉴테이터 믹서</td><td>BD Biosciences</td><td>421105</td><td></td></tr><tr><td>1번 정밀 칼</td><td>X-Acto</td><td>3201</td><td></td></tr><tr><td>16번 칼날</td><td>X-Acto</td><td>216</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold 항퇴색 시약</td><td>Invitrogen</td><td>36930</td><td></td></tr></tbody></table>

drosophila 애벌레 nmj immunohistochemistry

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

<em&gt; Drosophila</em&gt; 신경근육학 교차점 (NMJ)은 시냅스 개발 및 소성 연구에 사용되는 기존 모델 시스템입니다. 의 널리 사용<em&gt; Drosophila</em&gt; 모터 시스템은 높은 접근성 때문입니다. 이것은 단일 셀 해상도 분석하실 수 있습니다. 그의 배열 주변 본문 벽 내에 알려져 있습니다 hemisegment 30 근육이 있습니다. 31 모터 뉴런의 총 높은 충실도를 가진 패턴 이러한 근육을 첨부합니다. 분자 생물학과 유전학을 사용, 하나는 유전자 변형 동물이나 돌연변이를 만들 수 있습니다. 그런 다음, 하나는 NMJ의 형태와 기능의 발달 결과를 공부할 수 있습니다. Immunohistochemistry 분명 이미지 NMJ의 구성 요소를 사용할 수 있습니다. 이 문서에서는, 우리는을 시각화하기 위해 항체 염색법을 사용하는 방법<em&gt; Drosophila</em&gt; 애벌레 NMJ.

이 프로토콜은 해부 Drosophila의 유충에 immunohistochemistry을 수행하는 방법을 보여줍니다.

Drosophila 애벌레 NMJ Immunohistochemistry

초파리(Drosophila)의 신경근 접합부(NMJ)는 시냅스 발달과 가소성 연구에 사용되는 확립된 모델 시스템입니다. 광범위한 사용...

본 프로토콜은 시냅스 발달에 관여하는 단백질을 시각화하기 위해 해부된 gsof 유충에서 면역조직화학 염색을 수행하는 방법을 설명합니다. 1차 및 2차 항체 배양과 세척 단계를 위해 전 과정에서 1.7 ml 튜브를 사용합니다. 이후 유충을 처리 슬라이드로 옮겨 액토 나이프로 다듬은 후, 시료 관찰을 위해 항퇴색제 한 방울 위로 이동시킵니다.마운팅 슬라이드 위에 커버 슬립을 올린 후, 마지막으로 매니큐어를 사용하여 슬라이드에 밀봉합니다. 안녕하세요, 저는 컬럼비아 대학교 의과대학 생리학 및 세포 생물물리학과의 Brian McCade 연구실 소속 Jonathan Brent입니다. 저희는 신경근 접합부와 발달 중인 마디(node)에서 시냅스 형성의 유전적 조절을 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다.그럼 시작하겠습니다. gsof 유충 n MJ에 대해 면역조직화학 염색을 수행하기 전에, 먼저 유충을 적절히 해부하십시오. 이 절차를 배우려면, Drosophila Larva N MJ Dissection이라는 제목의 동반 비디오 기사를 시청하시기 바랍니다.절차를 시작하려면, 세 가지의 신선한 용액을 준비하십시오. 첫째, 갓 제조한 PBS에 계면활성제를 첨가하여 PBT 용액을 만듭니다. 둘째, 소 혈청 알부민의 분취액을 취해 PBT 용액에 첨가합니다.PBTB를 만들기 위해, 일반 염소 혈청(aqua normal goat serum)을 PB TB 용액에 첨가하여 PBTN 용액을 제조합니다. 이 용액들을 준비한 후, 유충을 1 mL의 PBT가 들어 있는 1.5 mL 튜브로 옮깁니다. 이것이 1차 세척 단계입니다.모든 세척 과정은 유충이 담겨 있는 용액을 교체한 후, 천천히 회전하는 뮤테이터 믹서(mutator mixer)에서 유충을 배양하는 방식으로 진행됩니다. 유충이 손상될 수 있으므로 튜브 간에 유충을 옮기지 마십시오. 첫 번째 세척은 실온에서 15분 동안 수행합니다.15분 동안 혼합한 후, 피펫을 사용하여 PBT를 새 PBT로 교체하고 유충을 15분 더 세척합니다. 세척액을 교체할 때는 항상 유충이 손상되지 않도록 주의하십시오. PBT 세척이 완료되면, PBTB에서 유충을 30분 동안 세척합니다.새로운 용액으로 이 세척 과정을 30분 더 반복합니다. 이로써 PBTB 세척이 완료됩니다. PBTN으로 1회당 15분씩 2회 세척합니다.두 번째 세척 단계 동안, 1차 항체를 원하는 작동 농도로 PBTN에 희석할 수 있습니다. 세척 후, 유충을 이 항체 혼합액에 넣고 실온에서 부드럽게 혼합하며 1시간 동안 또는 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 배양이 완료되면 1차 항체 용액을 사이펀으로 제거하고, 남아 있는 항체를 제거하기 위해 PBTB로 유충을 빠르게 여러 번 헹굽니다.다음 항체 배양을 위해 유충을 준비하려면, PBTB로 15분 동안 한 번 세척하고 PBTN으로 30분 동안 두 번 세척하십시오. 2차 항체를 원하는 작동 농도로 PBTN에 희석하고, 이 혼합액에서 유충을 1시간 30분 동안 배양하십시오. 상온에서 진행하며, 빛 노출을 방지하고 floor four 표백을 최소화하기 위해 반드시 유충을 덮어두십시오.1시간 30분 후, 2차 항체 용액을 제거하고 유충을 PBTB로 여러 번 더 헹굽니다. 그다음, 유충을 PBTV에서 15분 동안 두 번 세척합니다. 이후의 모든 세척 및 유충 보관 과정은 빛에 노출되는 것을 최소화해야 하므로, 반드시 덮개를 덮어 보관하십시오.1.5 mil 튜브에서 유충을 꺼내 유리 처리 슬라이드의 PBT로 옮깁니다. 이제 유충을 마운팅할 준비가 되었습니다. 염색된 유충을 마운팅하기 위해 65 °C의 워터배스에서 gold solution을 2~3분 동안 가열합니다. 그 후 Eloqua를 꺼내 50 °C로 설정된 히트 블록 위에 둡니다.프로세싱 슬라이드에 PB TB를 도포합니다. 유충을 PB TB로 옮깁니다. 16번 날이 달린 엑자크토 나이프(exacto knife)를 사용하여 유충의 큐티클 면이 아래로 향하도록 회전시킨 후, 유충의 머리와 꼬리 부분을 다듬어 제거합니다.이 단계에서 면도날을 사용할 수도 있습니다. 이제 가열된 분주액에서 40 µL의 prolonged gold를 깨끗한 슬라이드 위에 준비하고, 깨끗한 핀셋을 사용하여 주변으로 넓게 펴줍니다. 핀셋을 사용하십시오.준비된 유충 6~8마리를 처리 슬라이드에서 마운팅 슬라이드로 조심스럽게 옮깁니다. 유충을 마운팅할 때는 방향을 일정하게 유지하고 큐티클 쪽이 아래로 향하게 하십시오. 연장 용액 위에 커버슬립을 덮습니다.연장된 풀(pool)의 주변부 가장자리 한쪽에 배치하고, 샘플이 덮이도록 커버슬립을 조심스럽게 떨어뜨립니다. 두껍고 저렴한 원하는 색상의 매니큐어를 사용하여 커버슬립의 가장자리를 슬라이드에 밀봉합니다. 슬라이드를 최소 3시간 동안 건조시킵니다.슬라이드를 준비 직후 단 한 번만 이미징할 경우에는 금 용액으로 장시간 처리하는 대신 글리세롤을 사용할 수 있습니다. 이 경우 네일 폴리시와 글리세롤의 건조 시간은 모든 염색 프로토콜에서 소요되는 3시간에 비해 약 10분 정도로 단축됩니다. 목표는 낮은 배경 신호와 결합된 높은 특이적 신호를 얻는 것입니다.이는 고품질 항체를 사용하고 블로킹 및 세척 단계를 철저히 수행함으로써 달성됩니다. 이 이미지들은 야생형 시냅스뿐만 아니라, wishful thinking 또는 witch 돌연변이로 알려진 변이형 2형 BMP 수용체를 발현하는 초파리 계통의 시냅스들을 보여줍니다. 신경세포막은 horse radish peroxidase에 대한 항체를 사용하여 파란색으로 염색되었습니다.빨간색으로 표시된 시냅스 소포는 항시냅스 항체로 염색되었습니다. 초록색으로 표시된 시냅스 후단은 discs large에 대한 항체로 염색되었습니다. 이러한 결과는 type two BMP receptor를 돌연변이시키면 시냅스 성장 저하 표현형이 나타남을 보여주었습니다.이 돌연변이체는 BMP가 시냅스 말단 버튼 수를 조절하는 역행성 신호임을 규명하는 데 핵심적인 역할을 했습니다. 지금까지 식도 유충 신경근 접합부에서 면역조직화학 염색을 수행하는 방법을 살펴보았습니다. 이 실험 절차를 수행할 때.최대 재현성을 확보하고 배경 신호를 낮추기 위해서는 적절한 타이밍에 맞춰 절차를 수행하는 것이 중요합니다. 이것으로 모든 설명을 마치겠습니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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초파리 신경근 접합부(NMJ)는 시냅스의 형태와 기능을 연구하기 위한 모델로 사용됩니다. 이 비디오는 연구자들이 NMJ를 특성화하기 위해 정량화하는 중요한 특징에 대해 설명합니다. 예제 프로토콜은 정량화를 자동으로 수행할 수 있는 소프트웨어를 보여줍니다.

초파리 신경근접합부(NMJ) 정량화: 시냅스 형태 및 기능을 평가하는 방법

이 프로토콜은 근접 내고 분석은 초파리 애벌레 신경 근육 접합부에서 현장 단백질 - 단백질 상호 작용을 검출 할 수있는 방법을 보여줍니다. 이 기술, 디스크 크고 후진타오 - 리 타이 샤오는 시냅스 지역에서 복잡한, 이전에 공동 면역 통해 식별 관계를 형성하기 위해 표시됩니다.

검출 현장에서 단백질 - 단백질 복합체 초파리 애벌레 신경 근육 접합부

세포 내 소기관의 형태, 크기 및 위치는 진화적으로 보존되어 있으며 그 기능에 직접적인 영향을 미치는 것으로 보입니다. 이러한 과정의 기저에 있는 분자 메커니즘을 이해하는 것은 현대 생물학의 중요한 목표가 되었습니다. 여기에서 우리는 정량적 기술을 적용하여 이러한 연구를 촉진할 수 있는 방법을 보여줍니다.

상기 표현형의 특성을 : 정량이 중요한 이유<em&gt; 초파리</em&gt; 애벌레 신경 근육 학 분기점

이 보고서는 Drosophila Larvae의 신경근 접합부를 시각화하기 위한 새로운 샘플 준비 절차를 제공합니다. 이 방법은 기존 방법에 비해 샘플의 말림을 방지하는 데 더 효과적이며 초파리 신경근 접합부 초구조 분석에 특히 유용합니다.

Drosophila 유충의 신경근 접합부의 투과 전자 현미경을 위한 시료 전처리 공정 최적화

여기에서는 신경근 접합부와 근육 세포의 미세소관 네트워크를 시각화하기 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다. Drosophila melanogaster의 강력한 유전 도구와 결합된 이 프로토콜은 신경계에서 미세소관 네트워크 조절 단백질의 역할에 대한 유전자 스크리닝 및 미세소관 역학 분석을 크게 용이하게 합니다.

초파리 유충 신경근 접합부 및 근육 세포를 사용하여 미세소관 네트워크 시각화

학습하세요 Drosophila 애벌레 NMJ 면역조직화학을 통해 시냅스 발달 관련 단백질을 시각화하는 방법을. 1차 및 2차 항체 처리와 세척 단계를 포함한 이 기법은 신경발달 연구에 필수적인 유전자 조절 메커니즘을 규명하는 데 활용됩니다.

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