Name: 라이브 zebrafish의 배아에서 두 광자의 axotomy하고 시간이 경과 공촛점 영상 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-02-16T00:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 21 s
Description: 배우세요 Danio rerio 배아에서 이광자 axotomy 및 공촛점 영상 기법을 활용한 신경축 동역학 연구 방법을. 장기간 실시간 관찰이 가능한 이 기술은 말초감각 신경의 퇴행과 재생 메커니즘 규명에 필수적입니다.

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우리는 현지 시간 저속 영상에 대한 장착에 대한 조언을 조직 손상, 캐시 Joubin 및 토론을위한 Sagasti 및 Portera - Cailliau 실험실을 생성하기 위해 두 광자 현미경을 사용하여 초기 조언 마크 데라 사키 감사합니다. 초기 실험은 우즈 홀, MA에있는 해양 생물 연구소에서 그라스 재단 연구원처럼 의해 수행되었다. Sagasti 실험실 작업은 화이트홀 재단 Klingenstein 재단, 그리고 생명 공학 버로우즈 웰컴 기금 경력 수상의 보조금에 의해 지원되었다.

1 부 : 장기 이미징 장착 zebrafish의 배아 <ol><li> 삽입을위한 1퍼센트 낮은 용해 아가로 오스 솔루션을 준비합니다. 작은 튜브와 섭씨 42 도에 가열 블록에 저장에 전자렌지, 나누어지는에서 가열하여 DI 물의 아가로 오스를 디졸브. </li><li> 이미징을위한 배아를 선택하고 부드럽게 집게로 분리 chorion를 당기는하여 chorions를 제거합니다. 배아는 색소의 형성을 억제하기 위해 22-24시간 포스트 수정 (HPF)에서 5 % PTU 링거스 솔루션에 삽입할 수 있습니다. 이것은 영상의 선명도를 향상시키고 감각 axons의 2 광자 axotomies를 수행하는 것이 필수적입니다. 자연 색소가 양식을 수있다면, autofluorescence는 두 광자 현미경에 axons를 가린다. zebrafish에 대한 솔루션은 116 MM NaCl, 2.9 KCl MM 1.8 MM CaCl 2, 5mM HEPES, pH를 7.2이 포함되어 있습니다 링거스. </li><li> PTU 링거스에 ~ 0.02 % tricaine을 추가하여 배아를 마취. 확실히 동물이 진행하기 전에 터치에 반응하지 않습니다하십시오. </li><li> 유리 또는 테플론 반지의 한쪽으로 진공 그리스를 적용하고 유리 커버 슬립에 그것을 고정하여 장기 이미징 챔버를 준비합니다. </li><li> 많은 PTU 링거스의를 전송하지를 돌보는 유리 pipet으로 42도 아가로 오스 솔루션을 하나의 배아를 전송, 다음 준비 커버 슬립에 아가로 오스 중 하나를 드롭으로 배아를 전송합니다. </li><li> 아가로 오스는 견고처럼 원하는 배아를 놓습니다. 작업이 완료되면 이미지 챔버가 커버 슬립이 상단 표면되도록 뒤집힌 것입 것을 명심하십시오. </li><li> 당신은 전동 무대를 한번에 이미지를 여러 위치에 수, 반복은 각 배아에 대한 1.4-1.6 단계를하십시오. </li><li> 아가로 오스가 완전히 응고 허용, 다음 0.02 % tricaine PTU 링거스와 함께 반지를 입력합니다. </li><li> 유리 슬라이드와 함께 반지 (들)을 커버 후, 링 (들)의 반대쪽에 진공 그리스를 적용합니다. 이상 밀봉된 챔버 (들)을 뒤집기. 이 챔버는 직립하거나 거꾸로 현미경에서 이미지 사용할 수 있습니다. </li></ol> 2 부 : 카멜레온 티 - 사파이어 레이저로 맞춤 내장된 두 광자 현미경을 사용하여 두 광자의 axotomy <ol><li> 이미지 준비. 현미경 슬라이드 홀더에 장착 배아 (들)을 놓으십시오. 40X (NA 0.8) 물 객관적인 하나의 배아에 중점을두고 있습니다. 레이저를 켭니다. 우리는 reproducibly 시각화 다음과 같은 매개 변수를 사용하여 뉴런을 표현하는 GFP를 손상 수있다. 비 피해 전력 axons을 시각화하기 위해 910 나노미터의 파장 (NM)와 30 전력 (MW가 나와있는 예제에서 권력의 금액) 밀리 와트로 레이저를 설정합니다. 이미징 소프트웨어를 엽니다. 우리는 카렐 스보보다의 연구실 2, 3에서 개발된 ScanImage 소프트웨어를 사용합니다. </li><li> 두 광자 레이저로 배아를 검색하도록 초점을 누르면, 당신이 axotomize하고자하는 축삭을 찾아,이 축삭의 이미지를 캡처합니다. 처음이자 마지막 Z 위치를 마크 이미지를 획득하고, Z 스택의 최대 투영합니다. </li><li> 당신이 스캔을 axotomize 및 중지하고자하는 축삭의 가지에 70X 확대. 180 MW의 손상 전원 샘플에서 MW를 증가하고, 레이저로 단일 스캔을 수행합니다. 우리는 1 Z의 조각의 개수를 설정하고 &quot;잡아&quot;를 눌러이 작업을 수행. 이것은 축삭을 도려 충분해야합니다. 당신의 현미경과 실험적인 목표에 대해이 절차를 최적화하는 방법에 대한 논의를 참조하십시오. </li><li> , 축소 30 MW로 전력을 줄이고 이미지를 가져가라. </li></ol> 파트 3 : 자이스 혈구에서 두 광자 axotomy 510 공촛점 / 두 광자 현미경 <ol><li> 장소는 무대에 배아를 탑재하고 25X 물이 목적 또는 기타 적합한 목표를 사용하여 초점에 그것을 가지고. </li><li> 그것은 하나에서 다른로 전환 가능 있도록 두 개의 광자 (9​​10 NM)와 아르곤 (488 NM) 멀티 - 트랙 설정에서 레이저를 켜십시오. 두 레이저가 GFP를 검색하는 데 사용되지만, 두 광자 방출 빨간색과 시각이며, 녹색과 아르곤 레이저 방출이 두 가지를 구별합니다. </li><li> 다치게하는 축삭을 확인하기 위해 아르곤 레이저를 사용합니다. Z 아래 설정은 처음이자 마지막 광학 섹션을 표시합니다. 공촛점 이미지를 가지고 Z 스택의 최대 투영을 만듭니다. </li><li> 부상으로 축삭의 지역을 선택과 집중에이 지역을 가​​지고. 아르곤 레이저를 끄고 두 광자 레이저를 켜십시오. 축삭 초점 아직 있는지 ~ 9 %의 전송의 레이저 강도에서 두 광자로 표본을 검사합니다. </li><li> 자르기 도구를 사용할 수 있도록 &quot;중지&quot;버튼을 클릭하십시오. 관심의 영역을 확대하기 위해 작물을 사용합니다. 보통 우리는 ~ 70X (확대가 &quot;모드&quot;탭에서 확인할 수 있습니다)로 확대할 수 있습니다. &quot;채널&quot;탭 아래 15~20%의 전송 ~ 9 %의 전송에서 두 광자의 강도를 변경합니다. </li><li> 축삭을 도려하면 여분의 손상을 방지하려면 정지 버튼을 누르면 약 1 초 후과에 대해 &quot;빠른 XY&quot;버튼을 활성화합니다. 프로 시저가 작동하는 경우 축삭은 흩어져 파편으로 간주되어야합니다. </li><li> 보장하기 위해 그 축삭488 nm의 아르곤 레이저로 다시 전환 손상되었다, 다른 공촛점 이미지를 가지고, 최대 프로젝션을 만듭니다. </li></ol> 4 부 : 자이스 혈구 LSM 510에 공촛점 시간 저속 영상 <ol><li> 이미지 준비. 당신은 열띤 무대를 사용하는 경우, 시간 경과 영화를 설정하기 전에 최소한 30 분 거리에 그것을 설정해야합니다. 현미경 슬라이드 홀더에 장착 배아 (들)을 놓으십시오. 원하는 공기 목적 하나의 배아에 중점을두고 있습니다. 우리는 20X, 0.5 NA 목표를 사용합니다. 오픈 자이스 혈구 LSM 510 이미징 소프트웨어. 적절한 레이저의 전원을 켜고 원하는 구성을 설정합니다. 우리는 지금 자이스 혈구 LSM 멀티 타임 소프트웨어와 함께 장기적인 이미지에 대한 자세한 프로토콜을 설명합니다. 이러한 방법은 이미징 소프트웨어를 자신의 현미경에 사용하기 위해 적용할 수 있습니다. </li><li> 멀티 타임 윈도우에서 처음으로 배아의 위치 및 구성을 정의합니다. 스캔, 무대, 그리고 멀티 시간 창을 엽니다. 빠른 검색 창에서 검색을 활성화합니다. 원하는 XY 위치로 무대를 이동합니다. 스캔 윈도우에서 처음이자 마지막 Z 위치를 표시합니다. 또한, 검색 창에서, 다음 중순 중지를 누르십시오. 완료 중간 Z 슬라이스의 스캔을 위해 잠깐, 다음 단계 창의 마크 위치를 누르십시오. 하나의 배아만을 이미징하는 경우, 다중 시간 창에서 &quot;단일 위치 &#39;탭을 클릭하십시오. &quot;교체 XYZ&quot;을 클릭 후 &quot;구성 저장&quot;. 이전 구성을 덮어쓸 것인지 물었을 때 동의합니다. 4.4 단계로 진행합니다. 당신이 기계 무대를 갖고있다면, 이미지 여러 배아 여러 위치를 설정할 수 있습니다. 이 경우, 당신은 첫 번째 위치를 XYZ 및 구성을 정의하기 전에 &quot;여러 위치 &#39;탭을 선택합니다. 또한, &quot;여러 위치 &#39;탭 아래의 풀다운 메뉴가 위치 1되었는지가, 그리고가 설정 저장을 클릭하기 전에 구성 섹션의 풀다운 메뉴, LOC 1 멀티 말하고. </li><li> 멀티 시간 윈도우에 남아있는 태아의 위치 및 구성을 정의합니다. 다음 배아를 찾은 후, 빠른 스캔을 눌러 원하는 위치에 XY 스테이지를 이동하고, 검사 창에서 처음이자 마지막 Z 위치를 표시합니다. 또한, 검색 창에서, 다음 중순 중지를 누르십시오. 완료 중간 Z 슬라이스의 스캔을 위해 잠깐, 다음 단계 창의 마크 위치를 누르십시오. &quot;교체 XYZ &#39;을 클릭하십시오. &quot;구성 저장&quot;을 누른 다음 구성 섹션의 풀다운 메뉴가 멀티 LOC이 말하는 것은 그저 &#39;여러 위치&#39;탭 아래의 풀다운 메뉴가 위치 2 있는지 확인합니다. 이전 구성을 덮어쓸 것인지 물었을 때 동의합니다. 남은 배아에 대해이 과정을 반복합니다. </li><li> 다중은 Loc 윈도우에서 이미지 수집을위한 매개 변수를 설정합니다. &quot;블록의 목록&quot;섹션에서 GR - GL 옵션을 선택한 다음, 그룹 반복의 원하는 번호를 입력합니다. 이것은 공촛점 각 위치에서 이미지를 획득됩니다 횟수입니다. 매개 변수 섹션에서 원하는 대기 간격을 입력합니다. 이것은 하나의 영상 반복의 시작에서 다음 반복의 시작 시간의 금액입니다. 구성 섹션의 &quot;ZStackXY&quot;를 선택하십시오. 당신에게 아래 섹션에서 기본 파일 이름을 입력합니다. &quot;을 선택 이미지 DB&quot;를 클릭하여 MDB를 선택하십시오. &#39;옵션&#39;버튼을 클릭하십시오. 임시 파일을 저장하여 MDB 폴더를 선택합니다. &quot;최종 이미지를 저장&quot;및 &quot;Z 스택의 중간&quot;, &quot;최종 이미지가 뜨고 &#39;확인하십시오. 간격을 기다 선택합니다. 옵션 창을 닫습니다. &quot;시작 시간&quot;을 클릭합니다. 이미지의 기간 동안 멀티 시간 창문을 열어 둡니다. </li><li> 데이터를 분석할 수 있습니다. 시간 경과 이미징가 완료되면, 멀티 시간 소프트웨어는 임시 파일의 각 위치에 대한 요약 파일에 모두 컴파일됩니다. 당신이 완료되기 전에 동영상을 막으려면 요약 파일이 생성됩니다 그래서, &quot;그만하세요&quot;대신 &quot;Finish&quot;를 누르십시오. 임시 파일 및 요약 파일은 자동으로 지정 MDB 폴더에 저장해야합니다. LSM 소프트웨어 메뉴에서 &quot;프로젝션&quot;다음 &quot;3D보기&quot;를 클릭하십시오. 풀다운 메뉴에서 선택한 요약 파일과 함께, &quot;적용&quot;을 클릭하십시오. 이것은 각각의 공촛점 이미지의 Z 스택의 최대 추정치를 생성합니다. LSM 소프트웨어 메뉴에서 &#39;내보내기&#39;, &#39;파일&#39;을 클릭하십시오. TIF 파일의 일련의 최대 예상을 저장합니다. 그런 다음 ImageJ 또는 QuickTime Pro를 사용 TIF 파일의 일련의 밖으로 영화를 만들 수 있습니다. LSM 이미지에 Axons은 축삭의 형태에 대한 자세한 양적 정보를 생성하는 이미지 분석 소프트웨어 (MicroBrightfield에서 예 NeuroLucida)를 사용하여 3 차원에 추적할 수 있습니다. </li></ol> 제 5 부 : 대표 결과 성공적인 실험은 세포 역동의 정확한 표현 발생합니다부상에서 축삭 복구의 S. 당신의 배아가 눈에 띄는 변성과 강한 심장 박동과 함께, 영상 후 건강한 것입니다. axotomy은 축삭의 정의 지점 severing, 정확한 손상을해야합니다. 주변 axons와 최소한의 세포 죽음에 아무런 부상이 없어야합니다. 우리는 직접 실험 ~ 50 % axotomy의 사이트에 단일 표피 세포의 죽음을 볼 수 믿습니다. 더 많은 손상을 관찰하면 토론에 설명한 바와 같이, 당신은 두 광자 프로토콜을 최적화해야합니다.

<ol><li>Sagasti, A., Guido, M. R., Raible, D. W., Schier, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repulsive+interactions+shape+the+morphologies+and+functional+arrangement+of+zebrafish+peripheral+sensory+arbors%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Repulsive interactions shape the morphologies and functional arrangement of zebrafish peripheral sensory arbors.</a> Curr Biol. 15, 804-814 (2005).</li>
<li>Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ScanImage%3A+flexible+software+for+operating+laser+scanning+microscopes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Eng+Online%22%5BJournal%5D)">ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes.</a> Biomed Eng Online. 2 (13), (2003).</li>
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</ol>

우리는 정확하게 주변 감각 axons을 axotomize하고 직접 생활 zebrafish 배아에서 재생을 관찰하는 설명 방법을 사용했습니다. zebrafish에서 장기 시간이 경과 공촛점 영상은 생체내 많은 발달 과정을 관찰하는 데 사용할 수 있습니다. 설명한 두 광자 axotomy 절차는 여러 실험 목표 수정할 수 있습니다. 우리는 휴대폰 본체보다는 주변 축삭의 가지에 확대하여 전체 삼차 신경 감각 세포의 시체를 ablate에 동일한 일반적인 절차를 사용합니다. 형광과 식별 모든 세포 유형은 정확하게 손상되거나 femtosecond 레이저의 초점을 맞춘 파워 ablated 수 있습니다. 우리는 펄스 레이저가 지역화된 손상을 만들거나 세포 4,5,6을 ablate하는 데 사용되었습니다 여러 다른 시스템에서 이전 연구하여 zebrafish 시스템에 이러한 기술을 완벽하게 맞출 수 있었다. 제어 실험에서 우리는 axotomy 매우 정확한 확인 : 우리는 그들이 같은 세포의 가지 경우에도, 가까운...

라이브 zebrafish의 배아에서 두 광자의 axotomy하고 시간이 경과 공촛점 영상

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zebrafish는 오래 살아있는 투명한 배의 시간이 경과 이미징에 의해 개발의 세포 및 분자 메커니즘을 연구하기 위해 이용되었다. 여기 우리는 장기 이미징을위한 zebrafish의 배아를 탑재하고 공촛점 현미경을 사용하여 시간 경과 이미지 캡처를 자동화하는 방법을 보여주는 방법을 설명합니다. 우리는 또한 두 개의 광자 현미경에 장착된 femtosecond 레이저의 초점을 맞춘 전력을 사용하여 zebrafish에 주변 감각 axons의 개별 지점 관리, 정확한 손상을 만드는 방법을 설명합니다. 성공적인 두 광자 axotomy 대한 매개 변수는 각 현미경에 최적화된해야합니다. 두 가지 예제를 제공하기 위해 사용자 정의 내장된 두 개의 광자 현미경 및 자이스 혈구 510 공촛점 / 두 광자 모두 두 광자 axotomy을 설명합니다. Zebrafish 삼차 감각 뉴런은 감각 뉴런 특정 발기인 1 구동 유전자 변형 라인 표현 GFP에 시각하실 수 있습니다. 우리는 직접 zebrafish 배아 생활 감각 축삭 재생을 관찰하기 위해이 zebrafish 삼차 모델을 적응있다. 배아는 tricaine와 anesthetized하고 그것이 굳은로 아가로 오스의 드롭 내에 위치. 고정 배아는 phenylthiourea (PTU) 링거스 가득 이미징 챔버 내에 봉인하고 있습니다. 우리는 배아가 지속적으로 12~48시간 이러한 실에서 몇 군데 수있는 것으로 나타났습니다. 하나 공촛점 이미지 다음 axotomy의 원하는 사이트를 결정하기 위해 캡처합니다. 관심 지역은 이미징 낮은 비 피해 전원에서 감각 axons하여 두 광자 현미경에 위치하고 있습니다. axotomy의 원하는 위치에 확대 후, 전원이 증가하고 정의된 지역의 한 검사는 축삭을 끊을 수있는 충분한입니다. 여러 장소 시간 저속 영상 그러면 바로 부상에서 axonal 회복을 관찰할 수 공촛점 현미경에 설정됩니다.

여기 우리는 장기적인 영상, 두 광자 이미징 및 조직 손상을 기술하고, 시간 경과 공촛점 이미징에 대한 zebrafish 배아를 장착하는 방법을 설명합니다.

제브라피시(Zebrafish)는 살아있는 투명한 배아의 타임랩스 이미징을 통해 발달의 세포 및 분자적 메커니즘을 연구하는 데 오랫동안 활용되어 왔습니다.

In vivo 이광자 이미징을 사용하여 축삭을 절단하려면, TEFLON 및 커버슬립으로 구성된 특수 챔버 내에서 아가로스(agarose)가 굳어지는 동안 마취된 제브라피시 배아를 방울 속에 배치하십시오. 챔버 상단에 유리 슬라이드를 놓은 후, 축삭 절단 전 단계에서 이를 거꾸로 뒤집습니다. 절단하려는 축삭의 사전 이미지를 40배 배율로 촬영한 후, 절단하려는 영역을 70배 배율로 확대하여 관찰하십시오.레이저를 끈 상태에서 레이저 출력을 높입니다. 레이저를 짧게 켭니다. 축삭의 잔상에서, 절단(exotomy)이 성공했다면 흩어진 축삭 파편들이 보일 것입니다.안녕하세요, 저는 Georgia O'Brien입니다. 안녕하세요, 저는 Sandra Rigo입니다. 그리고 저는 Shauna Martin입니다.저희는 캘리포니아 대학교 로스앤젤레스 캠퍼스(University of California Los Angeles) 분자 세포 및 발생 생물학과의 Alvarez TI 연구실 소속입니다. 오늘은 살아있는 제브라피시 배아에서 2광자 절단술(two photon ex sodomy) 및 타임랩스 공초점 이미징을 수행하는 절차를 보여드리겠습니다. 저희 연구실에서는 말초 체성 감각 축삭의 퇴행과 재생을 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다.그럼 시작하겠습니다. 우선, 임베딩을 위해 1% low melt agarose 용액을 준비합니다. agarose를 2회 증류수에 녹인 후 마이크로웨이브로 가열하고, 이를 작은 튜브에 분주하여 42 °C의 히팅 블록에 보관합니다.먼저, 색소 형성을 억제하기 위해 수정 후 22~24시간 된 배아를 5% PTU 링거 용액에 넣습니다. 색소는 강한 자가형광을 띠어 이광자 현미경으로 관찰 시 축삭을 가릴 수 있기 때문입니다. 그다음, 이미징에 사용할 배아를 선택하고 핀셋으로 조심스럽게 분리하여 융모막(choon)을 제거합니다. 배아 선택이 완료되면 PTU 링거 용액에 약 0.02% tricaine을 첨가하여 마취시킵니다.계속하기 전에 동물이 촉각에 반응하지 않는지 확인하십시오. 유리 또는 테플론 링의 한 면에 진공 그리스를 바르고 이를 유리 커버슬립 위에 고정하여 장기 이미징 챔버를 준비합니다. 이때 PTU 링거액이 많이 옮겨지지 않도록 주의하십시오.유리 피펫을 사용하여 배아 하나를 42 °C의 agro 용액으로 옮깁니다. 그다음, agro 용액 한 방울과 함께 배아를 준비된 커버 슬립 위로 옮깁니다. 옮긴 후, agro 용액이 굳는 동안 배아를 원하는 위치에 맞게 배치합니다.작업이 끝나면 이미징 챔버를 뒤집어 구리 슬라이드가 상단 표면이 된다는 점에 유의하십시오. 모터 구동 스테이지가 있어 여러 위치를 동시에 이미징할 수 있는 경우, 각 배아에 대해 이 단계들을 반복하십시오. 아가로스 겔이 완전히 응고될 때까지 기다리십시오.그 다음 링을 0.02%tri canine PTU ringers로 채웁니다. 마지막으로, 링의 반대편에 진공 그리스를 도포합니다. 그런 다음 유리 슬라이드로 덮어줍니다.씰 챔버를 뒤집습니다. 이제 2광자 흥분 토모그래피(two-photon excitation tomography) 이미징을 위한 준비가 되었습니다. 이미징을 준비하기 위해, 마운팅된 배아를 현미경 아래의 슬라이드 홀더에 놓습니다.40 x 0.8 수치구경(numerical aperture) 수침 렌즈를 사용하여 배아 하나에 초점을 맞춥니다. 그다음 레이저를 켭니다. 레이저 파장은 910 nanometers로, 출력은 30 milliwatts로 설정하십시오.이미징 소프트웨어를 엽니다. 본 연구실에서는 Boar's Laboratory를 위해 corals에서 개발한 스캔 이미지 소프트웨어를 사용합니다. 이 배율에서는 절단할 대상 axon의 후보가 있는지 시야를 스캔할 수 있습니다.대상 축삭을 찾았다면 이미지를 촬영하십시오. 첫 번째와 마지막 Z 위치를 표시하고, 이미지를 획득하여 Z 스택의 최대 투영(maximum projection)을 생성합니다. 다음으로, 조사하고자 하는 축삭의 분기점을 70배로 확대하십시오.출력을 180 milliwatts로 올리고 Z 슬라이스 수를 1로 설정하십시오. grab을 눌러 레이저로 단일 스캔을 시작합니다. 이 정도로면 축삭을 절단하기에 충분하지만, 사용 중인 현미경과 실험 목적에 맞게 이 절차를 최적화하는 것이 필요합니다.마지막으로, 줌 아웃합니다. 출력을 30 milliwatts로 낮추고 새로 절단된 축삭의 이미지를 촬영합니다. 실험실에 맞춤 제작된 이광자 현미경이 없는 경우, Zes five 10 공초점 이광자 현미경을 사용하여 축삭을 절단할 수도 있습니다.먼저 마운트된 배아를 스테이지 위에 놓고 25 x 수침 대물렌즈를 사용하여 초점을 맞춥니다. 다음으로, 서로 전환이 가능하도록 멀티 트랙 설정에서 투포톤(two photon) 레이저와 Argonne 레이저 두 개를 모두 켭니다. 두 레이저 모두 GFP를 검출하는 데 사용되지만, 투포톤 방출은 빨간색으로, Argonne 레이저 방출은 초록색으로 시각화하여 구분합니다.두 가지를 구별하기 위해, Argonne 레이저를 사용하여 Z 설정 하에서 유지될 축삭을 식별하십시오. 첫 번째와 마지막 광학 절편을 표시하십시오. 공초점 이미지를 촬영하고 Zack의 최대 투영 영상을 생성하십시오.아르곤 레이저를 끄고 투광닝 약 9% 강도로 이광자 레이저 스캔을 켭니다. 축삭이 여전히 초점에 있는지 확인하려면 정지 버튼을 클릭하여 크롭 도구를 사용할 수 있도록 합니다. 크롭 기능을 사용하여 관심 영역을 확대합니다.보통 약 70 x로 확대합니다. 손상을 줄 축삭 부위를 선택하고 해당 부위의 초점을 맞춥니다. 확대 배율은 mode 탭에서 확인할 수 있습니다.다음으로, 채널(channels) 탭에서 이광자(two photon)의 강도를 약 9% 투과율에서 15~30% 투과율로 변경합니다. 새로운 설정을 적용하려면 fast XY 버튼을 클릭한 후 빠르게 정지(stop) 버튼을 클릭하십시오. 과도한 손상을 방지하기 위해, 절차가 제대로 수행되었다면 축삭(axon)이 흩어진 파편처럼 보여야 합니다.마지막으로, 축삭이 실제로 손상되었는지 확인하기 위해 488 nm 아르곤 레이저로 다시 전환하십시오. 공초점 이미지를 다시 촬영하고 축삭의 최대 투영 영상을 생성합니다. 이와 같이 이광자 레이저 현미경을 사용하여 축삭을 절단하는 두 가지 방법을 보여드렸으므로, 이제 Zeiss LSM 510을 이용한 재생 과정의 공초점 타임랩스 이미징에 대해 살펴보겠습니다.타임랩스 이미징을 준비하려면 타임랩스 영상을 설정하기 최소 30분 전에 가열 스테이지를 켜십시오. 마운팅된 배아를 현미경 아래의 슬라이드 홀더에 배치하십시오. 원하는 대물렌즈를 사용하여 배아 하나에 초점을 맞추십시오.20 x 0.5 수치구경 대물렌즈를 사용하며, Zeiss LSM 510 이미징 소프트웨어를 실행한 다음 적절한 레이저를 켜고 원하는 설정을 구성합니다. 스캔 스테이지와 멀티 타임 윈도우를 엽니다. 멀티 타임 소프트웨어를 사용하는 경우, 멀티 타임 윈도우에서 첫 번째 배아의 위치와 구성을 정의하십시오.스캔 창에서 fast scan을 활성화한 후, 스테이지를 원하는 XY 위치로 이동시키십시오. 스캔 창에 첫 번째와 마지막 Z 위치를 표시하십시오. 스캔 창에서 stop을 누른 다음 mid를 누르고, 중간 Z 슬라이스의 스캔이 완료될 때까지 기다리십시오.그 다음 스테이지 창에서 mark position을 누르십시오. 하나의 배아만 이미징하는 경우, multi-time 창에서 single location 탭을 클릭하십시오. replace X, y, Z를 클릭한 후, save configuration을 클릭하십시오.이전 구성을 덮어쓰라는 요청이 나오면 동의하십시오. 이제 다중 위치(multi lo) 창에서 이미지 획득을 위한 파라미터를 설정할 수 있습니다. 전동 스테이지를 사용하는 경우, 여러 위치를 설정하여 다수의 배아를 촬영할 수 있습니다.이 경우, 첫 번째 위치의 X, Y, Z 좌표와 구성을 정의하기 전에 다중 위치(multiple locations) 탭을 선택해야 합니다. 또한, 다중 위치 탭 바로 아래의 드롭다운 메뉴가 'location one'으로 설정되어 있는지, 그리고 구성(configuration) 섹션의 드롭다운 메뉴가 'multi lo one'으로 표시되는지 확인하십시오. 구성 저장(save configuration)을 클릭하기 전에, 다중 시간 창에서 나머지 배아들의 위치와 구성을 정의하십시오.다음 배아 프레스 고속 스캔(fast scan) 위치를 지정한 후, 스테이지를 원하는 XY 위치로 이동시키고 스캔 창에서 첫 번째와 마지막 Z 위치를 표시하십시오. 중지(stop)를 누르십시오. 그다음 스캔 창에서 중간 지점(mid)을 선택하고, 중간 Z 슬라이스의 스캔이 완료될 때까지 기다리십시오.그런 다음 mark position을 누릅니다. 스테이지 창에서 replace X, Y, Z를 클릭하십시오. multiple locations 탭 바로 아래의 드롭다운 메뉴가 location two로 설정되어 있는지, 그리고 configuration 섹션의 드롭다운 메뉴가 multi lobe two로 되어 있는지 확인하십시오. 그런 다음 save configuration을 클릭하십시오. 동의합니다. 이전 설정을 덮어쓰겠냐는 메시지가 나타나면, 나머지 배아들에 대해서도 이 과정을 반복하십시오.multi lo 창에서 이미지 획득 파라미터를 설정하십시오. 블록 섹션 목록에서 GR GL 옵션을 선택합니다. 그런 다음 원하는 그룹 반복 횟수를 입력하십시오.이는 공초점 현미경이 각 위치에서 이미지를 획득하는 횟수입니다. 파라미터 섹션에 원하는 대기 간격을 입력하십시오. 이는 한 번의 이미지 획득 반복 시작부터 다음 반복 시작까지의 시간입니다.설정 섹션에서 Zack XY를 선택하십시오. 하단 섹션에 기본 파일 이름을 입력하십시오. 이미지 db 선택을 클릭하고 데이터베이스를 선택하십시오.옵션 버튼을 클릭한 다음, 임시 파일을 저장할 MDB 폴더를 선택하십시오. '최종 이미지 열어두기(keep final image open)'를 체크하십시오. 최종 이미지를 저장하고, Zack의 중간 지점을 선택한 후 가중치 간격을 선택하십시오.확인을 클릭하여 옵션 창을 닫은 다음, 시작 시간을 클릭하십시오. 이미징이 진행되는 동안 다중 시간(multi-time) 창을 열어 두십시오. 이제 데이터를 분석할 차례입니다.타임랩스 이미징이 완료되면, multi-time 소프트웨어가 모든 임시 파일을 각 위치별 요약 파일로 컴파일합니다. 영상 촬영이 완료되기 전에 중단하려는 경우, 요약 파일이 생성될 수 있도록 'stop' 대신 'finish'를 반드시 눌러주십시오.임시 파일과 요약 파일은 지정된 MDB 폴더에 자동으로 저장되어야 합니다. 다음은 수정 후 54시간이 지난 시점에서 절단술(ex otomy) 후의 타임랩스 공초점 현미경 영상의 대표적인 예시입니다. 첫 번째 프레임은 절단술 전 축삭의 등쪽 뷰를 보여주며, 노란색 화살표는 이후의 절단술 부위를 가리키고 있습니다.타임랩스 영상은 외배엽 절제술(ex otomy) 후 1시간 이내에 시작하여 12시간 동안 지속됩니다. 20분마다 하나의 공초점 스택(confocal stack)을 수집하였습니다. 이 타임랩스 공초점 영상은 수정 후 78시간 시점과 동일한 파라미터를 사용하여 기록되었습니다.첫 번째 프레임은 절단 전 축삭의 측면 모습이며, 노란색 화살표가 절단 부위를 가리키고 있습니다. 지금까지 이광자 절단과 타임랩스 공초점 이미징을 이용하여 제브라피시 배아의 정밀한 조직 손상을 유도하고 이를 시각화하는 방법을 살펴보았습니다. 이 절차를 수행할 때, 과도한 손상을 방지하기 위해 이광자 레이저 절단에 사용되는 출력량을 최적화하는 것이 중요합니다.이상입니다. 시청해 주셔서 감사하며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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