라이브 zebrafish의 배아에서 두 광자의 axotomy하고 시간이 경과 공촛점 영상

In vivo 이광자 이미징을 사용하여 축삭을 절단하려면, TEFLON 및 커버슬립으로 구성된 특수 챔버 내에서 아가로스(agarose)가 굳어지는 동안 마취된 제브라피시 배아를 방울 속에 배치하십시오. 챔버 상단에 유리 슬라이드를 놓은 후, 축삭 절단 전 단계에서 이를 거꾸로 뒤집습니다. 절단하려는 축삭의 사전 이미지를 40배 배율로 촬영한 후, 절단하려는 영역을 70배 배율로 확대하여 관찰하십시오.

레이저를 끈 상태에서 레이저 출력을 높입니다. 레이저를 짧게 켭니다. 축삭의 잔상에서, 절단(exotomy)이 성공했다면 흩어진 축삭 파편들이 보일 것입니다.

안녕하세요, 저는 Georgia O'Brien입니다. 안녕하세요, 저는 Sandra Rigo입니다. 그리고 저는 Shauna Martin입니다.

저희는 캘리포니아 대학교 로스앤젤레스 캠퍼스(University of California Los Angeles) 분자 세포 및 발생 생물학과의 Alvarez TI 연구실 소속입니다. 오늘은 살아있는 제브라피시 배아에서 2광자 절단술(two photon ex sodomy) 및 타임랩스 공초점 이미징을 수행하는 절차를 보여드리겠습니다. 저희 연구실에서는 말초 체성 감각 축삭의 퇴행과 재생을 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다.

그럼 시작하겠습니다. 우선, 임베딩을 위해 1% low melt agarose 용액을 준비합니다. agarose를 2회 증류수에 녹인 후 마이크로웨이브로 가열하고, 이를 작은 튜브에 분주하여 42 °C의 히팅 블록에 보관합니다.

먼저, 색소 형성을 억제하기 위해 수정 후 22~24시간 된 배아를 5% PTU 링거 용액에 넣습니다. 색소는 강한 자가형광을 띠어 이광자 현미경으로 관찰 시 축삭을 가릴 수 있기 때문입니다. 그다음, 이미징에 사용할 배아를 선택하고 핀셋으로 조심스럽게 분리하여 융모막(choon)을 제거합니다. 배아 선택이 완료되면 PTU 링거 용액에 약 0.02% tricaine을 첨가하여 마취시킵니다.

계속하기 전에 동물이 촉각에 반응하지 않는지 확인하십시오. 유리 또는 테플론 링의 한 면에 진공 그리스를 바르고 이를 유리 커버슬립 위에 고정하여 장기 이미징 챔버를 준비합니다. 이때 PTU 링거액이 많이 옮겨지지 않도록 주의하십시오.

유리 피펫을 사용하여 배아 하나를 42 °C의 agro 용액으로 옮깁니다. 그다음, agro 용액 한 방울과 함께 배아를 준비된 커버 슬립 위로 옮깁니다. 옮긴 후, agro 용액이 굳는 동안 배아를 원하는 위치에 맞게 배치합니다.

작업이 끝나면 이미징 챔버를 뒤집어 구리 슬라이드가 상단 표면이 된다는 점에 유의하십시오. 모터 구동 스테이지가 있어 여러 위치를 동시에 이미징할 수 있는 경우, 각 배아에 대해 이 단계들을 반복하십시오. 아가로스 겔이 완전히 응고될 때까지 기다리십시오.

그 다음 링을 0.02%tri canine PTU ringers로 채웁니다. 마지막으로, 링의 반대편에 진공 그리스를 도포합니다. 그런 다음 유리 슬라이드로 덮어줍니다.

씰 챔버를 뒤집습니다. 이제 2광자 흥분 토모그래피(two-photon excitation tomography) 이미징을 위한 준비가 되었습니다. 이미징을 준비하기 위해, 마운팅된 배아를 현미경 아래의 슬라이드 홀더에 놓습니다.

40 x 0.8 수치구경(numerical aperture) 수침 렌즈를 사용하여 배아 하나에 초점을 맞춥니다. 그다음 레이저를 켭니다. 레이저 파장은 910 nanometers로, 출력은 30 milliwatts로 설정하십시오.

이미징 소프트웨어를 엽니다. 본 연구실에서는 Boar's Laboratory를 위해 corals에서 개발한 스캔 이미지 소프트웨어를 사용합니다. 이 배율에서는 절단할 대상 axon의 후보가 있는지 시야를 스캔할 수 있습니다.

대상 축삭을 찾았다면 이미지를 촬영하십시오. 첫 번째와 마지막 Z 위치를 표시하고, 이미지를 획득하여 Z 스택의 최대 투영(maximum projection)을 생성합니다. 다음으로, 조사하고자 하는 축삭의 분기점을 70배로 확대하십시오.

출력을 180 milliwatts로 올리고 Z 슬라이스 수를 1로 설정하십시오. grab을 눌러 레이저로 단일 스캔을 시작합니다. 이 정도로면 축삭을 절단하기에 충분하지만, 사용 중인 현미경과 실험 목적에 맞게 이 절차를 최적화하는 것이 필요합니다.

마지막으로, 줌 아웃합니다. 출력을 30 milliwatts로 낮추고 새로 절단된 축삭의 이미지를 촬영합니다. 실험실에 맞춤 제작된 이광자 현미경이 없는 경우, Zes five 10 공초점 이광자 현미경을 사용하여 축삭을 절단할 수도 있습니다.

먼저 마운트된 배아를 스테이지 위에 놓고 25 x 수침 대물렌즈를 사용하여 초점을 맞춥니다. 다음으로, 서로 전환이 가능하도록 멀티 트랙 설정에서 투포톤(two photon) 레이저와 Argonne 레이저 두 개를 모두 켭니다. 두 레이저 모두 GFP를 검출하는 데 사용되지만, 투포톤 방출은 빨간색으로, Argonne 레이저 방출은 초록색으로 시각화하여 구분합니다.

두 가지를 구별하기 위해, Argonne 레이저를 사용하여 Z 설정 하에서 유지될 축삭을 식별하십시오. 첫 번째와 마지막 광학 절편을 표시하십시오. 공초점 이미지를 촬영하고 Zack의 최대 투영 영상을 생성하십시오.

아르곤 레이저를 끄고 투광닝 약 9% 강도로 이광자 레이저 스캔을 켭니다. 축삭이 여전히 초점에 있는지 확인하려면 정지 버튼을 클릭하여 크롭 도구를 사용할 수 있도록 합니다. 크롭 기능을 사용하여 관심 영역을 확대합니다.

보통 약 70 x로 확대합니다. 손상을 줄 축삭 부위를 선택하고 해당 부위의 초점을 맞춥니다. 확대 배율은 mode 탭에서 확인할 수 있습니다.

다음으로, 채널(channels) 탭에서 이광자(two photon)의 강도를 약 9% 투과율에서 15~30% 투과율로 변경합니다. 새로운 설정을 적용하려면 fast XY 버튼을 클릭한 후 빠르게 정지(stop) 버튼을 클릭하십시오. 과도한 손상을 방지하기 위해, 절차가 제대로 수행되었다면 축삭(axon)이 흩어진 파편처럼 보여야 합니다.

마지막으로, 축삭이 실제로 손상되었는지 확인하기 위해 488 nm 아르곤 레이저로 다시 전환하십시오. 공초점 이미지를 다시 촬영하고 축삭의 최대 투영 영상을 생성합니다. 이와 같이 이광자 레이저 현미경을 사용하여 축삭을 절단하는 두 가지 방법을 보여드렸으므로, 이제 Zeiss LSM 510을 이용한 재생 과정의 공초점 타임랩스 이미징에 대해 살펴보겠습니다.

타임랩스 이미징을 준비하려면 타임랩스 영상을 설정하기 최소 30분 전에 가열 스테이지를 켜십시오. 마운팅된 배아를 현미경 아래의 슬라이드 홀더에 배치하십시오. 원하는 대물렌즈를 사용하여 배아 하나에 초점을 맞추십시오.

20 x 0.5 수치구경 대물렌즈를 사용하며, Zeiss LSM 510 이미징 소프트웨어를 실행한 다음 적절한 레이저를 켜고 원하는 설정을 구성합니다. 스캔 스테이지와 멀티 타임 윈도우를 엽니다. 멀티 타임 소프트웨어를 사용하는 경우, 멀티 타임 윈도우에서 첫 번째 배아의 위치와 구성을 정의하십시오.

스캔 창에서 fast scan을 활성화한 후, 스테이지를 원하는 XY 위치로 이동시키십시오. 스캔 창에 첫 번째와 마지막 Z 위치를 표시하십시오. 스캔 창에서 stop을 누른 다음 mid를 누르고, 중간 Z 슬라이스의 스캔이 완료될 때까지 기다리십시오.

그 다음 스테이지 창에서 mark position을 누르십시오. 하나의 배아만 이미징하는 경우, multi-time 창에서 single location 탭을 클릭하십시오. replace X, y, Z를 클릭한 후, save configuration을 클릭하십시오.

이전 구성을 덮어쓰라는 요청이 나오면 동의하십시오. 이제 다중 위치(multi lo) 창에서 이미지 획득을 위한 파라미터를 설정할 수 있습니다. 전동 스테이지를 사용하는 경우, 여러 위치를 설정하여 다수의 배아를 촬영할 수 있습니다.

이 경우, 첫 번째 위치의 X, Y, Z 좌표와 구성을 정의하기 전에 다중 위치(multiple locations) 탭을 선택해야 합니다. 또한, 다중 위치 탭 바로 아래의 드롭다운 메뉴가 'location one'으로 설정되어 있는지, 그리고 구성(configuration) 섹션의 드롭다운 메뉴가 'multi lo one'으로 표시되는지 확인하십시오. 구성 저장(save configuration)을 클릭하기 전에, 다중 시간 창에서 나머지 배아들의 위치와 구성을 정의하십시오.

다음 배아 프레스 고속 스캔(fast scan) 위치를 지정한 후, 스테이지를 원하는 XY 위치로 이동시키고 스캔 창에서 첫 번째와 마지막 Z 위치를 표시하십시오. 중지(stop)를 누르십시오. 그다음 스캔 창에서 중간 지점(mid)을 선택하고, 중간 Z 슬라이스의 스캔이 완료될 때까지 기다리십시오.

그런 다음 mark position을 누릅니다. 스테이지 창에서 replace X, Y, Z를 클릭하십시오. multiple locations 탭 바로 아래의 드롭다운 메뉴가 location two로 설정되어 있는지, 그리고 configuration 섹션의 드롭다운 메뉴가 multi lobe two로 되어 있는지 확인하십시오. 그런 다음 save configuration을 클릭하십시오. 동의합니다. 이전 설정을 덮어쓰겠냐는 메시지가 나타나면, 나머지 배아들에 대해서도 이 과정을 반복하십시오.

multi lo 창에서 이미지 획득 파라미터를 설정하십시오. 블록 섹션 목록에서 GR GL 옵션을 선택합니다. 그런 다음 원하는 그룹 반복 횟수를 입력하십시오.

이는 공초점 현미경이 각 위치에서 이미지를 획득하는 횟수입니다. 파라미터 섹션에 원하는 대기 간격을 입력하십시오. 이는 한 번의 이미지 획득 반복 시작부터 다음 반복 시작까지의 시간입니다.

설정 섹션에서 Zack XY를 선택하십시오. 하단 섹션에 기본 파일 이름을 입력하십시오. 이미지 db 선택을 클릭하고 데이터베이스를 선택하십시오.

옵션 버튼을 클릭한 다음, 임시 파일을 저장할 MDB 폴더를 선택하십시오. '최종 이미지 열어두기(keep final image open)'를 체크하십시오. 최종 이미지를 저장하고, Zack의 중간 지점을 선택한 후 가중치 간격을 선택하십시오.

확인을 클릭하여 옵션 창을 닫은 다음, 시작 시간을 클릭하십시오. 이미징이 진행되는 동안 다중 시간(multi-time) 창을 열어 두십시오. 이제 데이터를 분석할 차례입니다.

타임랩스 이미징이 완료되면, multi-time 소프트웨어가 모든 임시 파일을 각 위치별 요약 파일로 컴파일합니다. 영상 촬영이 완료되기 전에 중단하려는 경우, 요약 파일이 생성될 수 있도록 'stop' 대신 'finish'를 반드시 눌러주십시오.

임시 파일과 요약 파일은 지정된 MDB 폴더에 자동으로 저장되어야 합니다. 다음은 수정 후 54시간이 지난 시점에서 절단술(ex otomy) 후의 타임랩스 공초점 현미경 영상의 대표적인 예시입니다. 첫 번째 프레임은 절단술 전 축삭의 등쪽 뷰를 보여주며, 노란색 화살표는 이후의 절단술 부위를 가리키고 있습니다.

타임랩스 영상은 외배엽 절제술(ex otomy) 후 1시간 이내에 시작하여 12시간 동안 지속됩니다. 20분마다 하나의 공초점 스택(confocal stack)을 수집하였습니다. 이 타임랩스 공초점 영상은 수정 후 78시간 시점과 동일한 파라미터를 사용하여 기록되었습니다.

첫 번째 프레임은 절단 전 축삭의 측면 모습이며, 노란색 화살표가 절단 부위를 가리키고 있습니다. 지금까지 이광자 절단과 타임랩스 공초점 이미징을 이용하여 제브라피시 배아의 정밀한 조직 손상을 유도하고 이를 시각화하는 방법을 살펴보았습니다. 이 절차를 수행할 때, 과도한 손상을 방지하기 위해 이광자 레이저 절단에 사용되는 출력량을 최적화하는 것이 중요합니다.

이상입니다. 시청해 주셔서 감사하며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.