Name: 전체 Plasmids의 수제 사이트 감독 돌연변이 유발 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-11T00:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 11 s
Description: 학습하세요 전체 플라스미드의 수제 사이트 감독 돌연변이 유발 방법을 간단하고 비용 효율적인 프로토콜로 배울 수 있습니다. 표준 시약을 사용하여 플라스미드 DNA에 원하는 염기 치환을 도입하는 실용적인 기술을 익혀보세요.

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방법의 원리 : 이 사이트는 전체 plasmids의 돌연변이 유발이 동영상에 직접 플라스미드로 몇 기지의 대체, 삭제 또는 삽입하여 복제된 대상 유전자를 변경할 수있는 돌연변이 유발 방법이 설명 감독. 그것은 비 PCR 기반 thermocycling 반응에서 전체 플라스미드를 확장하여 사용할 수 있습니다. 반응하는 동안 원래의 플라스미드에 불일치의 형태로 원하는 돌연변이를 운반 mutagenic primers는, 새로 합성 플라스미드에 통합되어 있습니다. 반응에서 원래 플라스미드의 제거 후 변이 플라스미드가 E.으로 변화 도착 이 방법의 돌연변이 효율이 100 % 없기 때문에 대장균. 다음 단계만을 심사 목적으로하고 있습니다. 전체 절차는 사흘 걸리지만 주요 부분은 하루 이내에 할 수 있습니다. 1.0 하루에 한 : 1.1 Thermocycling 반응 : 원본 플라스미드 : 돌연변이 유발 프로토콜을 감독이 사이트 10킬로바이트까지 plasmids와 함께 잘 작동됩니다. 큰 Plasmids이 방법으로 공격하는 조금 어려운 일부 인내와 thermocycling 조건 및 / 또는 관할 세포의 조절이 걸릴 수 있습니다. 또한 당신이 작업하는 플라스미드는 댐 + 박테리아 스트레인으로부터 격리해야합니다. thermocycling 반응을 위해 당신이가 자신을 공격하려는 플라스미드의 10-60 ngs 필요합니다. Primers : 당신 thermocycling 반응을 설정할 수 전에 손에에서 primers을 가지고있다. 당신은 모든 mutagenic 입문서 약 150 NG가 필요합니다. 당신이 1시 10분 희석 100 PM 주식의 1.5 μl을한다면 그것은 괜찮습니다. 귀하의 mutagenic primers를 디자인할 때 고려해야 할 몇 가지 간단한 지침이있다 : <ul><li> primers 서로 보완되어야 </li><li> primers 길이 25 45 세포핵 사이 여야합니다 </li><li> 원래 플라스미드에 불일치 형태의 변이는 두 primers에 포함되어 있어야합니다 </li><li> 불일치는 뇌관 중심으로 각 면에 최소한 8 세포핵 둘러싸인해야 </li><li> primers 적어도 40 % GC - 내용이 있어야합니다 </li><li> primers는 하나 이상의 거시기 뭐냐 또는 고사 5 총리 3 프라임을 종료해야합니다 </li><li> primers는 phosphorylated 필요가 없습니다 없으며 그들은 단지 그들이해야 desalted FPLC 또는 페이지 정화,해야 할. </li><li> TM의 계산에 대해 어떤 수식하지만 배송 인증서 TM이 60 이상되어야 ° C. 필요하지 않습니다 </li><li> 심사 목적을 위해 그것은 당신의 돌연변이와 제한 사이트를 삽입하거나 삭제하는 실용적입니다. 때문에 유전자의 변성의 원하는 돌연변이와 제한 사이트를 삽입할 수있는 많은 가능성이 있습니다. 뉴잉글랜드 Biolabs의 웹사이트는 적절한 제한 사이트를 찾을 수있는 도구를 제공합니다. 간단히 DNA에 대한 모호함 코드를 사용하여, 당신이 원하는 아미노산 서열에 대한 코딩하여 프라이머 시퀀스를 입력합니다. 효소 찾기 도구는 제한 사이트가 원하는 돌연변이에 평행 도입 수있는 당신에게 말할 것이다. 이 방법으로 모든 가능한 한 실제적인 제한 사이트를 찾을 수 없다면, 당신은 돌연변이의 사이트에있는 유전자에 관한 새로운 제한없이 사이트를 삽입할 수 있습니다. 이후이 제한 사이트가 새로운 mutagenic primers 삽입에 의해 삭제됩니다되는 돌연변이 시리즈를위한 템플릿으로이 플라스미드 사용할 수 있습니다. 당신이 플라스미드 같은 사이트에서 돌연변이의 시리즈를 할 계획이라면이 방법은 매우 편리합니다. </li></ul> DNA - 효소 :이 방법 여러분은 3&#39; - 5 &#39;Exonuclease 활동을 전시하고 뭉툭한 끝을 만들어 내열성 DNA 중합 효소 - 필요합니다. 우리는 항상 Fermentas에서 재조합 Pfu - 중합 효소를 사용합니다. 당신이 증폭 단계에 문제가있다면 당신은 높은 품질의 효소를 시도 수도 있지만 대부분의 목적에 표준 Pfu 충분합니다. dNTPs, 효소 버퍼와 물로 반응을 완료합니다. 1.2 Thermocycling 조건 thermocycler은 다음과 같은 방법으로 설정되어야합니다. 초기 및 반복 변성 단계는 95 ° C.에 30sec로 설정됩니다 primers의 어닐링 온도는 복잡한 수식 계산해서는 안됩니다. 우리는 일반적으로 55 ° C 및 1 분 어닐링 시간 어닐링 온도를 설정합니다. 당신이 대부분 사용합니다 25-30 세포핵의 primers 경우, 이것은 우리의 시간의 95 %를 작동합니다. 60 ° C. -이 일을하지 말아야하는 경우 여하튼, 간단하게 50 사이의 어닐링 온도를 변화 시도 신장 온도는 사용하는 효소에 따라 달라집니다. 이 예제에서 우리는 72 신장 온도 요구 Fermentas에서 Pfu - 효소 °​​ C.를 사용하여 연신율 시간은 플라스미드의 크기에 따라 다릅니다. 우리는 항상 킬로바이트 당 1 분을 계산하고, 그 한 분 추가 추가시간. 예를 들어, 9킬로바이트 플라스미드에 대해 우리는 연신율 시간 10 분 선택한 것입니다. 18 사이클 정도 추가로 사용하기 위해 플라스미드 변이 만드는 데 충분합니다. 낮은 사이클의 수를 유지, 또한 시간을 절약할 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/1135/figure1.png" alt="그림 1" width="600" height="287" /> Thermocycling 반응 후 1.3 Gelcheck 성공적인 확대는 전기 영동을 수행하여 확인한다. 자전거가 완료 직접 후, 1 %의 태 아가로 오스 겔에 반응 5 μl를로드합니다. 증폭이 성공했다면, 당신은 별개의 밴드를 확인할 수 있습니다. 새로 합성된 DNA가 젤에 명확하게 표시되지 않으면 그러나 전체 반응을 촉진하려고하고 다음 단계에서 변환을 위해 사용할 수 있습니다. 우리를 위해 이것은 거의 효과가 없어 가지고 있지만 사용해 가치가있다. 반응이 작동하지 않을 경우에 가장 좋은 것은 어닐링 온도를 조절하는 것입니다. 1.4 DpnI의 소화 : 변환하기 전에 템플릿으로 제공하는 원래의 플라스미드가 강한 배경을 방지하기 위해 반응에서 제거되어야합니다. 이 DpnI로 제한 소화에 의해 이루어집니다. 이 제한 endonuclease는 플라스미드 methylated 상처. A는 methylated되어야 반면, 그 인식 및 제한 사이트는 시퀀스 GATC입니다. DpnI와 소화 경우에만 댐에서 고립되었던 원래 unmutated 플라스미드가 + 변형이 탈락, methylated되지 않은 새로 합성 변이 플라스미드는 DpnI에 의해 영향을받지 않습니다. 단순히 반응 DpnI 1-2 μl를 추가하고 37에서 적어도 한 시간을 품어 °. 빠른 다이제스트 DpnI을 사용할 때 배양 시간은 15 분 감소 수 있습니다. 귀하의 DpnI이 제한 소화의 배양 시간의 품질이 크게 unmutated 플라스미드와 배경이되는 방법을 강한 결정합니다. 1.5 변환 : DpnI는 소화 후 플라스미드는 유능한 E.으로 변환을위한 준비 대장균 세포. 간단히 관할 세포에 DpnI의 소화 반응에서 5 μl을 추가하고 실험실에서 권장하는대로 변환을 수행합니다. 우리 사건에서 우리는 30 분 얼음 박테리아 - 플라스미드 혼합 잠복기 후 42 ° C 90 초에서 열 충격 그걸로 열 충격 절차를 사용합니다. 200 μl SOC - 솔루션을 추가하면, 박테리아는 적극적으로 한 H. 위해 37, ° C를 흔들어, incubated 아르 일시간 후 세균은 한천 미디어를 선택을 도금하고 있습니다. 2.0 하루에 두세 클론 1 부 2.1 심사 : 클론의 선택 돌연변이 효율이 100 %가 아니므로 귀하의 돌연변이에 대한 화면으로 필요합니다. 우리는 우리가 추가하거나 뇌관 통합을 통해 삭제된 제한 사이트의 존재 또는 부재를 확인하는 제한 소화하여이 작업을 수행할. 이러한 목적을 위해 우리는 보통 여덟 식민지를 선택하고 다음날 플라스미드 준비 밤새도록 그들을 성장. 3.0 지나고 3 클론 2 부 3.1 상영 : 마커 효소로 제한 소화 셋째 날에는 당신의 마커 효소와 미니 준비와 후속 제한 소화를 수행합니다. 겔에서는 다음 원하는 돌연변이를 운반하고있는 사람 아닌 클론 어느 확인할 수 있습니다. 제한 소화를 사용하는 심사 방법은 잘 작동합니다. 그럼에도 불구하고, 당신은 시퀀싱하여 성공적인 돌연변을 확인합니다.

<ol><li>Papworth, C., Bauer, J. C., Braman, J., Wright, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((QuikChange+site-directed+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Strategies%22%5BJournal%5D)">QuikChange site-directed mutagenesis.</a> Strategies. 9, 3-4 (1996).</li>
</ol>

저자들은 공개할 사항이 없습니다.

사이트 감독 돌연변이 유발이 플라스미드에 의해 운반 유전자를 공격하는 빠른 방법을 제공하는 돌연변이 유발 - 방법입니다. 전체 반응은 하루에 할 수 있습니다. 이 방법을 사용하면, 그것은 단지 원하는 변이를 가지고 무료 primers 한 쌍의 등 Pfu - 효소로 교정 효소가 필요합니다. 새로 합성된 플라스미드는 제한 효소 DpnI와 반응을 소화하여 부모의 플라스미드 분리 수 있습니다. 이 효소는 methylated DNA를 요약. 따라서 오직 새로 합성 플라스미드는 변형하실 수 있습니다. 이 튜토리얼에서 우리는 수제 돌연변이 유발 키트를 사용하여 사이트 이동 돌연변이 유발을 수행 보여주었다. 이 키트의 장점은 효과가 남아있는 동안 절약 비용입니다. 이 방법의 중요한 포인트는 뇌관 디자인과 어닐링 온도입니다. 경우에는 새로 합성 DNA가 전기 후, 방법의 실패를 표시 할 수있는, 하나는 박테리아의 변환에 대한 전체적인 반응과 사용을 촉진하기 위해 시도할 수 시각 수 없습니다. 그러나이 문제를 해결하는 가장 좋은 방법은 어닐링 ...

<table><tbody><tr><td>Pfu polymerase (재조합 또는 천연형)</td><td>Fermentas</td><td>EP0571 또는 EP0501</td><td></td></tr><tr><td>dNTP mix 10 mM </td><td>Fermentas</td><td>R0191</td><td></td></tr><tr><td>DpnI 또는 DpnI Fast digest</td><td>Fermentas</td><td>ER1701</td><td></td></tr><tr><td>프라이머</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>탈염 처리됨</td></tr></tbody></table>

전체 plasmids의 수제 사이트 감독 돌연변이 유발

Homemade Site Directed Mutagenesis of Whole Plasmids

전체 plasmids의 사이트 이동 돌연변이 유발은 원래 플라스미드의 약간 다른 유사 콘텐츠를 작성하는 간단한 방법입니다. 이 방법으로 복제된 대상 유전자 직접 플라스미드로 몇 기지의 대체, 삭제 또는 삽입하여 변경할 수 있습니다. 그것은 단순히이 아닌 PCR 기반 thermocycling 반응에서 전체 플라스미드를 확장하여 사용할 수 있습니다. 반응 동안 원하는 돌연변이를 운반 mutagenic primers는, 새로 합성 플라스미드에 통합되어 있습니다. 이 비디오 튜토리얼에서 우리는 플라스미드에 기본 재료를 소개하는 쉽고 비용 효과적인 방법을 보여줍니다. 프로토콜은 표준 시약 작동 종종 매우 비싼 상용 키트에서 독립적입니다. 이 프로토콜을 적용하는 것은 그것이 상업 키트의 일부를 사용하는 비용은 무엇 여덟째에 대한 반응의 총 비용을 줄일 수 있습니다. 이 비디오에서 우리는 또한 과정에서 중요한 단계에 대해 언급하고 mutagenic primers를 디자인하는 방법에 대한 자세한 지침을 제공합니다.

전체 plasmids의 사이트 이동 돌연변이 유발은 원래 플라스미드의 약간 다른 유사 콘텐츠를 작성하는 간단한 방법입니다. 여기서 우리는 플라스미드를 사용 표준 시약에 기본 재료를 소개하는 쉽고 비용 효과적인 방법을 보여줍니다.

전체 Plasmids의 수제 사이트 감독 돌연변이 유발

전체 플라스미드의 부위 특이적 돌연변이 유발(site directed mutagenesis)은 기존 플라스미드의 약간씩 다른 변이체들을 생성하는 간단한 방법입니다. 이 방법을 통해 클로닝된...

안녕하세요. 제 이름은 Mark Blo이며, 독일 Mines 대학교에서 생물학을 전공하고 있는 대학원생입니다. 오늘은 제 동료 Kajo와 함께 가정에서 수행할 수 있는 부위 특이적 신경 생성(site directed neurogenesis) 방법을 소개해 드리고자 합니다.이 방법은 원래 Ethal에 의해 개발되었으며 이후 많은 다른 연구자들에 의해 수정되었습니다. 따라서 현재 인터넷을 검색하면 어느 정도 유의미한 차이가 있는 다양한 프로토콜들을 찾을 수 있습니다. 오늘 저희는 저희의 실험실에서 효과적으로 작동하는 간단하고 비용 효율적인 방법을 소개해 드리고자 합니다.그럼 시작하겠습니다. 이 실험을 위해서는 열 안정성 교정 DNA 중합효소가 필요합니다. 저희는 항상 Fermentas의 PFU polymerase를 사용합니다.또한 폴리머레이스 버퍼, dNTP 믹스 및 증류수가 필요합니다. 더불어 제한 효소인 DpnI, 컴피턴트 E. coli 세포, 아가 플레이트, 박테리아 배양액, 그리고 다수의 이쑤시개가 필요합니다. 이 방법에서 가장 핵심적이고 중요한 부분은 돌연변이 유발 프라이머의 설계입니다.프라이머 쌍을 설계할 때 고려해야 할 몇 가지 간단한 가이드라인이 있습니다. 프라이머는 서로 상보적이어야 하며, 길이는 25에서 45 뉴클레오타이드 사이여야 합니다. 돌연변이는 원래 플라스미드에 대한 미스매치 형태로 삽입됩니다.미스매치는 두 프라이머 모두에 포함되어야 하며, 양옆으로 최소 8개의 뉴클레오타이드가 배치된 프라이머의 중앙 부분에 위치해야 합니다. 프라이머의 GC 함량은 최소 40%여야 하며, 5' 말단과 3' 말단에 하나 이상의 G 및 C가 포함되어야 합니다. PCR을 수행하기 전, 프라이머는 탈염 및 인산화 과정을 거쳐야 합니다.FPLC 또는 page 정제는 필요하지 않습니다. melting temperature를 계산할 필요도 없습니다. 단순히 배송 증명서에 기재된 melting temperature가 60 °C보다 높은지만 확인하십시오. 스크리닝 목적으로, 저희는 항상 플라스미드에서 제한 효소 인식 부위를 추가하거나 삭제합니다.자세한 내용은 서면 프로토콜을 확인하시기 바랍니다. 전체 절차의 첫 번째 단계는 열 순환 반응을 설정하는 것입니다. 이를 위해 변이시키고자 하는 플라스미드 10 to 60 nanograms가 필요합니다.플라스미드를 댐프 양성 세균 균주로부터 분리하는 것이 매우 중요합니다. 그 다음,

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

여기서 우리는 주어진 대상 시퀀스에 대한 임의의 돌연변이 라이브러리를 작성하는 간단한 프로토콜을 보여줍니다. 우리는 대장균의 생체내에서 수행됩니다이 방법은, 새로운 효소 활동을 진화하기 위해 기능 선택과 함께 할 수있는 방법을 보여줍니다.

에서 단백질의 감독 진화에 대한 돌연변이 유발 및 기능 선택 프로토콜 E. 대장균</em

출처: Tomás, JM, et al. 박테리아 운동성에서 박테리아 글리코실트랜스퍼라제의 역할을 밝히기 위한 null 돌연변이체의 생성. J. Vis. 경험. (2022).이 비디오는 대장균  에서 자살 플라스미드의 개시자 의존적 증폭을 보여줍니다.항생제 내성 유전자를 운반하는 플라스미드는 숙주에 의해 암호화된 개시제 단백질이 있는 경우에만 복제됩니다. 전기천공 및 회수 배지에서 배양한 후, 혼합물을 항생제 함유 한천에 도금합니다. 플라스미드를 가진 박테리아는 개시제 단백질이 플라스미드의 항생제 내성 유전자를 발현할 수 있기 때문에 생존합니다.

박테리아 숙주에서 자살 플라스미드의 증폭

출처: Lea-Smith, DJ, et al. 모델 시아노박테리아 종에서 마크 및 마커가 없는 돌연변이체의 생성. J. Vis. 경험. (2016년)이 비디오는 시아노박테리아에서 항생제 표시 돌연변이를 생성하는 방법을 보여줍니다. 프로토콜은 시아노박테리아 배양으로 시작하여 표면 필리를 보존하는 원심분리 및 세척 단계가 이어집니다. 그런 다음 상동 서열 옆에 있는 항생제 내성 유전자를 운반하는 플라스미드를 도입합니다. 배양하는 동안 플라스미드는 필리를 통해 내재화되고 상동 재조합을 통해 표적 유전자를 대체합니다. 항생제 선택 및 재추출은 돌연변이 균주를 분리하고 정제하는 데 사용됩니다.

상동 재조합을 통한 시아노박테리아에서 항생제 표시 돌연변이체의 생성

우리는 높은 처리량 시퀀싱을 이용하여 단백질의 종합적인 단일 사이트 포화 돌연변이 라이브러리의 기능 평가를위한 프로토콜을 제시한다. 중요한 것은,이 방법은 라이브러리 구축 및 시퀀싱을 다중화하는 직교 프라이머 쌍을 사용한다. 암피실린의 임상 적 투여 량에서 선택 TEM-1 β-lactamase를를 사용하는 대표적인 결과가 제공된다.

높은 처리량 시퀀싱을 활용하여 전체 - 단백질 포화 돌연변이 유발 도서관의 기능 평가를위한 프로토콜

유전자 코드 확장 acetylation 단백질을 포함 한 생물 학적 과정의 넓은 범위를 공부 하는 강력한 도구 역할을 합니다. 여기 균질 생성 하기 위한이 기술을 악용 하는 손쉬운 프로토콜 acetylated 단백질 대장균 세포에 특정 사이트에 설명 합니다.

Site-Specifically 생성 하는 손쉬운 프로토콜 Acetylated 대장균 에서 단백질

이 문서에는 분열 효 모에 대상 유전자의 무작위 mutagenesis에 대 한 자세한 방법을 설명합니다. 예를 들어, 우리가 대상 rpt4 +, 19S 프로테아좀 섬으로 불안정 돌연변이 대 한 스크린의 소 단위를 인코딩하는.

분열 효 모 섬으로 불안정 프로테아좀 돌연변이 선택할 임의의 Mutagenesis 유전자 타겟팅

사이트 지시 된 mutagenesis deoxyribonucleic 산 (DNA) 특정 돌연변이 소개 하는 기술 이다. 이 프로토콜 사이트 감독 mutagenesis 2 스텝을 수행 하는 방법을 설명 하 고 3 단계 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 기반 접근, 관심의 모든 DNA 조각에 적용 됩니다.

사이트 감독 Mutagenesis에 대 한 생체 외에서 그리고 Vivo 실험 대장균 RNA 상호 Exemplified에서

새로운 서열 특이성을 가진 제한 endonucleases는 부분적으로 퇴화한 서열을 인식하는 효소로부터 개발될 수 있다. 여기에서 우리는 우리가 성공적으로 NlaIV 효소의 순서 특이성을 바꾸기 위하여 이용된 상세한 프로토콜을 제공합니다. 프로토콜의 주요 성분은 전사/번역 반응의 생체외 구획화 및 새로운 서열 특이성을 가진 변이체의 선택이다.

더 엄격한 특이성을 가진 제한 endonuclease의 시험관 진화

본 프로토콜은 HA, S 당단백질, 관련 하이브리드형 글리칸 및 고만노스 올리고당에 대한 CV-N 결합을 검사하기 위한 SPR 결합 분석을 위한 새로운 도구를 설명합니다. SPR은 이량체 또는 단량체 CV-N을 이들 글리칸에 결합시키기 위한KD 를 결정하기 위해 사용된다.

표면 플라즈몬 공명을 통한 항바이러스제 엔지니어링

여기에서는 NgTET 효소를 사용하여 박테리오파지의 DNA 변형을 줄여 효율적이고 흉터가 없는 CRISPR-Cas 돌연변이 유발을 가능하게 하는 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 생명공학 및 파지 치료에 응용하기 위한 파지의 유전 공학을 용이하게 합니다.

NgTET 지원 CRISPR-Cas 시스템을 사용한 정확한 파지 돌연변이 유발

학습하세요 전체 플라스미드의 수제 사이트 감독 돌연변이 유발 방법을 간단하고 비용 효율적인 프로토콜로 배울 수 있습니다. 표준 시약을 사용하여 플라스미드 DNA에 원하는 염기 치환을 도입하는 실용적인 기술을 익혀보세요.

전체 Plasmids의 수제 사이트 감독 돌연변이 유발

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