Name: 의 해부 Saccharomyces Cerevisiae Asci (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-19T00:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 57 s
Description: 배우세요 효모 세포의 미세조작 기술을 이용한 감수분열 유전 분석 및 이배체 접합체 선택 방법입니다. 이 기법은 Saccharomyces cerevisiae를 활용하여 유전자형을 정확히 식별하고 연구할 수 있습니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

저자의 실험실에서 작품은 건강 연구의 캐나다 연구소, 혁신, 자연 과학 및 공학 연구위원회와 콩코디아 대학에 대한 캐나다 재단 후원됩니다.

diploid의 변종 구축 교배에 의해 diploids 생산을위한 프로토콜 <ol><li> 필요, 하나의 식민지를 생성하는 경우 초기 종자는 YPD, 또는 선택적 매체에 밖으로 명중한다. 두 h​​aploid 계통 반대 짝짓기 유형 (예 마타와 MATα)의해야합니다. </li><li> 멸균 접종 루프를 사용하면 두 개의 haploid 변종 중 하나에서 식민지의 일부를 선택하십시오. 새로운 YPD 판 연속 루프 한번 접시에 걸쳐 직선에서. 접시의 바닥에 화살표와 함께 행진의 방향을 표시합니다. </li><li> 같은 YPD 접시에 두 번째로 부담이 단계를 반복합니다. 처음으로이 시간은 탄력 콜로니 직각을 두 번째로 첫 번째 승리를 건너. 두 번째 줄무늬의 방향을 선택하고 두 번째 승리가 먼저 교차 영역을 확인합니다. diploids이 생성됩니다 어디에이 지역은 것입니다. </li><li> 30 ° C 하룻밤에 YPD 번호판을 품어. </li><li> 복제 판 선택 새로 형성된 diploids의 성장을 허용합니다 선택적 미디어에 YPD 판. </li><li> 하나의 식민지를 생성하기 위해 같은 선택적 매체에 하나의 식민지 가능한 경우, 또는 diploid 스트 리크와 행진의 일부를 선택하십시오. </li></ol> Sporulation 및 asci의 소화 프로토콜 <ol><li> 위의 접시에서 하나의 식민지를 선택하고 (1cm X 1cm) sporulation (SPO) 접시에 패치를 작게 만들고 sporulate에 3~7일 30 ° C에서 알을 품다. </li><li> Sporulation은 가벼운 현미경으로 각 패치의 세포를보고하여 확인하실 수 있습니다. 물을 5-10 μl의 현미경 슬라이드에 삽입 세포는 비말 위에 coverslip을 배치하고, asci의 존재를 찾으십시오. asci 쉽게 발견되지 않은 경우 다음 인큐베이터에 다시 넣어. </li><li> 패치 중 하나에 효과 sporulation가있다면, tetrad 주스의 100μL와 살균 15mL 원뿔 튜브를 준비합니다. </li><li> 멸균 3mm 접종 루프 (세포가 루프의 ¼을 커버한다) 및 tetrad 주스에서 개최이 sporulation 패치의 세포를 선택하십시오. 부드럽게 소용돌이 세포 솔루션과 루프와 혼합을 떨어져 수 있도록 루프를. </li><li> 4 - 상업 중심지 (zymolyase 및 변형 자체의 농도와 활동에 따라)에 대한 tetrad 주스 (zymolyase을 포함)에 둡니다. 이것은 ascospores를 둘러싼 세포 벽 소화를 위해 수 있습니다. </li><li> YPD 접시에 inoculum 지역의 상단과 하단을 표시합니다. </li><li> 선택 사항입니다. 반응은 차가운 얼음 살균 DH 2 O.의 1mL를 추가하여 막을 수 세포 5mins에 대한 해결하실 수 있습니다. 뜨는에서 제거 1mL 다음 손으로 가볍게 섞어 얼음 계속. </li><li> 5 단계에서 소화 세포 5μL를 타고 부드럽게 장소는 미리 표시 YPD 판의 inoculum 지역에서 일렬로 방울. </li><li> 간신히 한천과 접촉하는 동안 매우 부드럽게 라인 방울 1-3 시간을 확산하기 위해 멸균 3mm 접종 루프를 사용합니다. </li><li> (7 단계가 생략되면, 이것은 외부 세포 벽의 소화가 감소하거나 중단 될 때) 한천로 흡수하는 액체를 허용합니다. 해부 현미경으로 진행합니다. </li></ol> Asci의 해부 프로토콜 다음과 같은 프로토콜 가수 MSM 시스템 200 미세 현미경에 대한 설명입니다. 이 프로토콜은 이러한 자이스 혈구 micromanipulator MR로 수동 micromanipulator를 사용하는 경우 약간의 수정을 따라 수 있습니다. <ol><li> 필드의 절반이 세포를 포함하고 절반 비어있는 접시의 지역에 중점을두고 있습니다. 천천히 그것이 필드의 빈 영역을 만지는 것과 같은 초점에 바늘을 가지고. 이것은 바늘이 이전 사용의 세포를 포함하지 않도록합니다. 바늘과 한천 사이의 연락은 서서히 초점에 와서 어두운 블랙 서클으로 여겨진다. </li><li> 위치 A1에서 매트릭스로 이동하여 다시 한천을 천공하여 표시를합니다. 이것이 완성되기 전에 현미경을 촬영하는 경우에는 접시의 방향을 결정하는 것입니다. </li><li> 검색 모드로 전환합니다. asci를 찾습니다. 가급적 세포가 잘 밖으로 보급되어 지역에 asci를 선택합니다. 셀 클러스터와 지역을 피한다. asci에서 네 가지 ascospores은 아직도 서로에게 부착해야합니다. 두 ascospores은 다른 두보다 약간 클 수 있습니다. 한 ascospore 줄을과 ascospores의 나머지 부분에 연결되어 있지 asci을 채취하지 마십시오. </li><li> 바늘로 자낭을 선택하십시오. 천천히 접시에 바늘을 가져와. microneedle의 그림자가 보인다, 라인 자낭이 최대가 뽑힐 수 있습니다. 서클 (바늘 끝)의 검은 외곽선이 볼 때까지 다시는 바늘을 접근한다. 이 원형으로 tetrad을 터치하고 신속하게 거리에 바늘을 가져옵니다. 자낭에서 네 명 모두 ascospores가 바늘을 준수하고 추가 세포이 자낭의 일부가 아닌 microneedle에서 수집하지 않은 것을 가지고 있는지 확인합니다. </li><li> 멀리 접시에서 microneedle를 당겨와 매트릭스 (처음 자낭위한 이동로 이동위치 A1). 자낭이 이전 각 위치를 기록해 둡니다. microneedle과 접시를 감동 넷 모두 ascospores은 microneedle를 올 때까지 돌아서하여 자낭을 놓으십시오. 바늘을 암 또는 YPD 접시를 들고 플랫폼의 부드러운 감청이 단계에서 종종 유용합니다. </li><li> asci의 원하는 번호가 잡았 때까지 3-5 단계와 매트릭스에서 연속 위치에 자리 asci를 반복합니다. </li><li> 각각의 자낭에 다시 가서 부드럽게 플랫폼 또는이 둘의 조합을 도청, 바늘로 괴롭히고하여 분리 네 개의 세포를 휴식. 각각의 자낭 각 ascospore 네개가의 행을 분리 때까지 모체의 새로운 위치에 뒤에 하나를두고 세포를 선택하십시오. </li><li> ° C의 성장 패턴을 관찰하기 위해 몇 일 동안 30 인큐베이터에서 YPD 접시를 놓습니다. </li><li> 복제 플레이트 선택 매체 필요한 경우에 해부 세포. </li></ol> Zygotes의 이주 프로토콜 <ol><li> 하나의 식민지를 얻을 수있는 적절한 매체에 반대 짝짓기 유형 두 개의 haploid 종자 밖으로 승리. </li><li> 메이트이 두 계통은 위에서 설명한, 4 일에서 6 시간 (또는 야간 필요한 경우)에서 성장 수 있습니다. </li><li> 가벼운 현미경 zygotes 있는지 확인합니다. Zygotes 중 하나 또는 버드없이 아령 모양의 세포로 나타납니다. </li><li> 3mm 접종 루프 (세포가 루프의 ¼을 커버한다)와 세포를 들고 살균 DH 2 O.의 100μL에 부드럽게 장소 </li><li> YPD 접시에 inoculum 지역의 상단과 하단을 표시합니다. </li><li> 5μL 타고 부드럽게 장소는 미리 표시 YPD 판의 inoculum 지역에서 일렬로 방울. </li><li> 간신히 한천과 접촉하는 동안 매우 부드럽게 라인에 방울을 확산하기 위해 3mm 접종 루프를 사용합니다. </li><li> 액체 배지에 흡수하도록 허용합니다. 해부 현미경으로 진행합니다. </li><li> 필드의 절반이 세포를 포함하고 절반 비어있는 접시의 지역에 중점을두고 있습니다. 천천히 그것이 필드의 빈 영역을 만지는 것과 같은 초점에 바늘을 가지고. 이것은 바늘이 이전 사용의 세포를 포함하지 않도록합니다. 바늘과 한천 사이의 연락은 서서히 초점에 와서 어두운 블랙 서클으로 여겨진다. </li><li> 위치 A1에서 매트릭스로 이동하여 다시 한천을 천공하여 표시를합니다. 이것이 완성되기 전에 현미경을 촬영하는 경우에는 접시의 방향을 결정하는 것입니다. </li><li> 검색 모드로 전환합니다. 접합자를 찾습니다. </li><li> 바늘로 접합자를 선택하십시오. </li><li> 장소는 매트릭스에 개별적으로 zygotes. </li><li> zygotes 몇 일 동안 성장할 수 있습니다. </li><li> 적절한 선택 매체에 복제 판은 zygotes. </li></ol> 대표 결과 <img src="/files/ftp_upload/1146/1146fig1.jpg" alt="" /> 그림 1 : 반대 짝짓기 유형의 두 haploid 변종의 짝짓기는 diploid 변형을 생성합니다. <img src="/files/ftp_upload/1146/1146fig2.jpg" alt="" /> 그림 2 : 온도에 민감한 변형 (leu2 auxotrophy)와 야생 유형 스트레인 (LEU2) 사이에 짝짓기의 thre 결과 (A) YPD 플레이트. 소화 세포는 두 흑인 라인 사이의 두꺼운 성장을 볼 수 있습니다 왼쪽에있는 inoculum 지역에 보급하고 있습니다. 해부했습니다 Asci가 균일하게 오른쪽에 매트릭스의 간격 성장. (B) (A)의 접시는 SD - 류신 드롭 아웃 플레이트에 복제되었습니다. 확인 ascospore이 해부되었다 나타내는 LEU2 마커에 대한 2시 2분 성장을합니다. (C) (A)의 번호판은 YPD 접시에 복제와 37 ° C.에 incubated되었습니다 더 ascospore가 해부하는 것을 검증 2시 2분 성장을합니다.

<ol><li>Sherman, F., Hicks, J. Micromanipulation and Dissection of Asci. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSherman%2C+F+%22Guide+to+Yeast+Genetics+and+Molecular+Biology%22">Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology</a>. Guthrie, C., Fink, G. R. , Academic Press. San Diego. 21-37 (1991).</li>
</ol>

효모 해부 원하는 마커 새로운 변종을 선택하는 유용한 도구입니다. 네 ascospores의 이론적인 성장 패턴을 결정할 때 그것은 식물 세포의 유전자형 보는 것이 중요합니다. 플라스미드가 있으면이 ascospore (들)은 플라스미드를 받고 조작되는 변종에 대한 예측과 결론에 영향을 미칠 수있는 영향을 줄 수로가 하나의 낮은 또는 높은 복사하는 경우, 하나는 알고 있어야합니다. 일부 변종은 시간의 짧은 기간에 많은 ascospores 생산 다른 사람보다 sporulate 수 있습니다. 다른 변종은 ascospores의 낮은 비율을 얻을 수 있습니다. 이 정도로 진정한 asci 선택할 수있는 한 실험에 어떤 영향을 미칠 수 없습니다. 또한, 계통 세포 벽 소화하는 동안 다른 반응 그리고 그것은 경험적으로 tetrad 주스의 배양 시간을 조정할 필요가 있습니다. 원하는 마커와 세포를 선택할 때, 하나는 모든 ascospores의...

<table><tbody><tr><td>Singer MSM System 200</td><td>현미경</td><td>Singer Instruments</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>D-sorbitol</td><td>시약</td><td>BioShop Canada</td><td>SOR508</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>시약</td><td>BioShop Canada</td><td>TRS001</td><td></td></tr><tr><td>Zymolyase 100T</td><td>시약</td><td>Seikagaku Corporation</td><td>120493</td><td></td></tr><tr><td>Yeast extract</td><td>시약</td><td>BioShop Canada</td><td>YEX401</td><td></td></tr><tr><td>Peptone</td><td>시약</td><td>BioShop Canada</td><td>PEP 403</td><td></td></tr><tr><td>D-glucose</td><td>시약</td><td>BioShop Canada</td><td>GLU501</td><td></td></tr><tr><td>Yeast nitrogen base</td><td>시약</td><td>BioShop Canada</td><td>YNB406</td><td></td></tr><tr><td>Bio-tryptone</td><td>시약</td><td>BioShop Canada</td><td>TRP402</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>시약</td><td>BioShop Canada</td><td>SOD002</td><td></td></tr><tr><td>Potassium acetate</td><td>시약</td><td>BioShop Canada</td><td>POA 301</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>시약</td><td>BioShop Canada</td><td>AGR003</td><td></td></tr><tr><td>Adenine sulfate</td><td>시약</td><td>BioShop Canada</td><td>ADS201</td><td></td></tr><tr><td>L-uracil</td><td>시약</td><td>BioShop Canada</td><td>URA 241</td><td></td></tr><tr><td>L-tryptophan</td><td>시약</td><td>BioShop Canada</td><td>TRP 100</td><td></td></tr><tr><td>L-histidine</td><td>시약</td><td>BioShop Canada</td><td>HIS 200</td><td></td></tr><tr><td>L-arginine</td><td>시약</td><td>Amresco</td><td>0877-100G</td><td></td></tr><tr><td>L-methionine</td><td>시약</td><td>BioShop Canada</td><td>MET 222</td><td></td></tr><tr><td>L-tyrosine</td><td>시약</td><td>BioShop Canada</td><td>TYR 333</td><td></td></tr><tr><td>L-isoleucine</td><td>시약</td><td>BioShop Canada</td><td>ISO 910</td><td></td></tr><tr><td>L-valine</td><td>시약</td><td>BioShop Canada</td><td>VAL 201</td><td></td></tr><tr><td>L-lysine</td><td>시약</td><td>BioShop Canada</td><td>LYS 101</td><td></td></tr><tr><td>L-phenylalanine</td><td>시약</td><td>BioShop Canada</td><td>PHA 302</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamic acid</td><td>시약</td><td>BioShop Canada</td><td>GLU 202</td><td></td></tr><tr><td>L-threonine</td><td>시약</td><td>BioShop Canada</td><td>THR002</td><td></td></tr><tr><td>L-leucine</td><td>시약</td><td>BioShop Canada</td><td>LEU 222</td><td></td></tr></tbody></table>

의 해부 saccharomyces cerevisiae asci

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

효모는 다양한 세포 과정을 연구하는 데 사용되는 매우 다루기 쉬운 모델 시스템입니다. 일반적인 실험실 변형<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; haploid 또는 diploid 상태 중 하나에 존재합니다. 이 haploids에서 대립 유전자를 조합하는 능력과 게놈에 수정을 소개하는 능력은 asci의 생산과 절개를 필요로합니다. haploid 세포에서 Asci 생산 diploid의 변형을 만들어 호환 짝짓기 형식의 두 개의 효모 haploid의 종자의 짝짓기와 함께 시작됩니다. 이것은 고체 매체에 또는 액체 중 여러 가지 방법으로 수행할 수 있습니다. 그것은 선택적으로 haploid 변종 중 하나에 비해 자신의 성장을 촉진 매체 diploids을 선택에 유리합니다. diploids 그러면 asci, diploid의 meiotic 복제로 인한 사 haploid 딸 세포의 번들 형태로 영양분이 가난한 매체에 sporulate 수 있습니다. 식물 세포와 asci의 혼합물은 다음 asci의 ascospores를 둘러싼 막 색 멀리 소화 효소 zymolyase로 처리됩니다. 한 개인 asci를 선택하고 네 개의 ascopores 분리 및 재배치 수있는 해부 현미경 아래 microneedle과 미세 조작을 사용합니다. 해부 asci은 며칠 동안 성장하고 적절한 선택 매체에 복제 도금에 의해 관심의 표시 또는 대립 유전자에 대한 검사를하고 있습니다.

효모 세포의 미세 조작은 diploid의 zygotes을 선택 meiotic 유전 분석 또는 필요합니다. 이러한 micromanipulations은 해부 현미경의 microneedle를 사용하여 수행됩니다. microneedle는 세포를 재배치하는 데 사용됩니다 및 자동화의 다양한 학위와 함께 사용할 수 있습니다 micromanipulator에 의해 제어됩니다.

의 해부 Saccharomyces Cerevisiae Asci

효모는 다양한 세포 프로세스를 연구하는 데 사용되는 매우 다루기 쉬운 모델 시스템입니다. 일반적인 실험실 균주인 Saccharomyces cerevisiae는 ...

이 절차는 유전적으로 서로 다른 두 가지 하이브리드 효모 세포의 교배로 시작합니다. 이배체만 성장할 수 있는 배지에 복제 도말(replica plating)을 하여 이배체를 선별합니다. 그 후, 선별된 이배체를 포자 형성 플레이트에 도말하여 자낭을 형성시킵니다.자낭을 해부하여 단배체들을 플레이트의 지정된 위치에 배치합니다. 결과물인 단배체들이 가시적인 콜로니로 성장하면, 개별 세포의 유전형을 식별하기 위해 선택 배지로 플레이트를 복제합니다. 안녕하세요, 저는 Adrian Morris입니다.저는 Audrey Mahe입니다. 저희는 몬트리올 Concordia 대학교의 Michael Satcher 박사님 연구실 소속입니다. 오늘은 보통 ra라고 불리는 효모의 해부 절차를 보여드리겠습니다.본 실험실에서 이 절차를 사용하여 새로운 유전자형을 가진 haplo D 균주를 제작하고, 두 가지 돌연변이를 함께 혼합했을 때의 효과를 연구하십시오. 그럼 시작하겠습니다. 이배체 균주를 구축하려면 서로 반대되는 교배형의 두 haplo 균주를 교배시킵니다. 먼저 haplo 균주를 적절한 배지(본 실험의 경우 YPD)에 도말하여 단일 콜로니를 생성합니다. 멸균된 접종 루프를 사용하여 두 haplo 균주 중 하나의 콜로니 일부를 소량 취해 새로운 YPD 플레이트에 도말합니다.플레이트 전체에 걸쳐 직선으로 도말한 후, 플레이트 바닥에 화살표로 도말 방향을 표시합니다. 다음으로, 동일한 YPD 플레이트에 있는 다른 haplo 균주의 콜로니 일부분을 소량 떼어냅니다. 첫 번째 균주와 수직 방향으로 콜로니를 도말하여, 두 번째 도말 방향이 첫 번째 도말선을 가로지르게 합니다.그리고 두 번째 스트리킹이 첫 번째 스트리킹과 교차하는 영역을 확인하십시오. 이 영역에서 이배체가 생성될 것입니다.YPD 플레이트를 30 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 하룻밤 배양이 끝난 후, 새롭게 형성된 이배체만 선택적으로 성장이 가능한 선택 배지로 YPD 플레이트를 복제 도말합니다. 해당 플레이트를 30 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다.이배체(diploid)가 플레이트에서 성장하면, 가능하면 단일 콜로니를 선택하거나 이배체 스트리크의 일부분을 선택하여 동일한 선택 배지에 스트리크하여 단일 콜로니를 생성합니다. 이배체 균주가 확보되면, 단일 콜로니를 선택하여 포자 형성 플레이트에 작게 패치(patch)를 만듭니다. 30 °C에서 3~7일 동안 배양하여 포자를 형성시킵니다.포자 형성 여부를 확인하기 위해, 각 패치의 세포를 광학 현미경으로 관찰하십시오. 슬라이드 위에 세포를 올리고 5~10 µL의 물을 가합니다.액적 위에 커버슬립을 덮고 자낭의 존재 여부를 확인합니다. 자낭이 없거나 쉽게 발견되지 않는 경우, 플레이트를 인큐베이터로 옮깁니다. 패치 중 하나에서 효과적인 포자 형성이 관찰되면, 100 µL의 tetra juice가 들어 있는 멸균된 15 mL 원심분리관을 준비합니다.멸균된 3mm 접종 루프로 이 포자 형성 패치에서 세포를 채취하여 tetrad juice에 넣습니다. 루프를 부드럽게 돌려 세포가 루프에서 떨어져 용액과 섞이도록 합니다. 세포를 tetrad juice에 4~10분 동안 둡니다.이를 통해 ASCO 포자를 둘러싸고 있는 세포벽을 분해할 수 있습니다. 자낭 해부를 위한 플레이트를 준비하려면, YPD 플레이트의 접종 부위 상단과 하단을 표시합니다. 세포가 충분히 분해되면, 분해된 세포 5 µL를 취해 멸균된 3 mm 접종 루프로 미리 표시한 YPD 플레이트의 접종 부위에 한 줄로 조심스럽게 떨어뜨립니다.오거(auger)에 거의 닿지 않을 정도로 조심스럽게 방울들을 한두 번에서 세 번 정도 일직선으로 펴 바릅니다. 액체가 오거에 흡수되도록 둡니다. 이제 자낭(asci)의 해부를 시작할 준비가 되었습니다.자낭의 해부를 시작하려면, 해부 플레이트를 singer MSM system 200 미세 조작 현미경 아래에 놓으십시오. 시야의 절반은 세포가 있고 나머지 절반은 비어 있는 플레이트 영역에 초점을 맞춥니다. 바늘이 시야의 빈 영역에 닿도록 천천히 초점을 맞추십시오.바늘과 한천(agar)이 닿으면 서서히 초점이 맞춰지며 진한 검은색 원으로 보입니다. 바늘이 한천에 닿은 후, 바늘을 살짝 뒤로 당겨 바늘이 닿았던 부위에 세포가 침착되지 않았는지 확인하십시오. 이는 바늘에 이전 사용 시의 세포가 남아 있지 않음을 보장하기 위한 것입니다.A1 위치의 매트릭스로 이동하여 오거로 구멍을 뚫어 표시를 합니다. 다시 말씀드리지만, 이는 플레이트의 방향을 결정하는 데 도움이 됩니다. 해부가 완료되면 이를 제거합니다.검색 모드로 전환하십시오. 자낭을 찾으십시오. 하나의 자낭에서 나온 4개의 자낭포자는 여전히 서로 부착되어 있어야 합니다.두 개의 ASCUS 포자가 나머지 두 개보다 약간 더 클 수 있습니다. 하나의 ASCA 포자가 떨어져 나와 나머지 ASCA 포자들과 연결되지 않은 자낭은 선택하지 마십시오. 자낭을 채취하려면 바늘을 플레이트 쪽으로 천천히 가져가십시오.마이크로니들의 그림자가 보이면, 채취하려는 자낭(ascus)의 위치에 맞춥니다. 원형의 검은색 외곽선이 보일 때까지 니들을 이동시킵니다. 이 원으로 사분포자(tetrad)를 터치한 다음, 니들을 빠르게 뗍니다.네 개의 자낭포자가 모두 자낭에서 바늘에 부착되었는지, 그리고 이 자낭에 속하지 않은 추가 세포가 마이크로니들에 의해 채집되지 않았는지 확인하십시오. 마이크로니들로 자낭을 채집했다면, 마이크로니들을 플레이트에서 멀리 떼어내어 매트릭스로 이동하십시오. 첫 번째 자낭의 경우, a1 위치로 이동하십시오.마이크로니들을 플레이트에 접촉시킨 후, 4개의 ascus 포자가 모두 마이크로니들에서 떨어질 때까지 천천히 떼어내어 배치합니다. 이 단계에서는 니들 암이나 YPD 플레이트를 고정하는 플랫폼을 가볍게 두드리는 것이 도움이 될 때가 많습니다.원하는 수의 asci를 확보할 때까지 매트릭스의 연속된 위치에서 asci를 계속해서 찾아 선택하여 배치합니다. ASCUS가 재배치된 각 위치를 기록해 둡니다. 원하는 수의 asci를 모두 선택했다면, 각각의 asci로 돌아가 니들로 살살 떼어내거나 플랫폼을 가볍게 두드리거나, 혹은 이 두 가지 방법을 병행하여 네 개의 세포를 분리합니다.하나의 세포를 남겨두고 나머지 세포들을 집어 올립니다. 남은 세포들을 옮깁니다. 매트릭스의 새로운 위치에 E를 배치하고 각 요청이 완료될 때까지 이 과정을 반복합니다.각 자낭 내의 APO는 4개씩 행으로 분리됩니다. 자낭의 해부가 한 차례 완료되었습니다. 성장 패턴을 관찰하기 위해 YPD 플레이트를 30 °C 인큐베이터에 며칠 동안 보관하십시오.분리된 자낭이 성장하면 이를 선택 배지에 복제 도말합니다. 필요한 경우, 이는 복제 도말이 수행된 플레이트이며 원래의 분리 플레이트와 선택 플레이트 모두 하룻밤 동안 배양된 상태입니다. 선택 배지에서 나타난 결과를 판독하여 적절한 반수성 세포를 식별하고 선택해야 합니다.선택 배지에서 이배체를 식별할 수 없는 경우에는, 접합 후 초기 단계에서 쉽게 식별 가능한 접합자라고 불리는 접합된 단배체를 수동으로 선택해야 합니다. 단배체 세포 준비 및 접합 절차는 이미 설명한 내용과 동일하지만, 이배체가 생성되어야 할 영역을 30°C에서 더 짧은 배양 시간 후에 검사한다는 점이 다릅니다. 4~6시간이 적절한 시작점인 것으로 확인되었으나, 최종적인 시간 길이는 경험적으로 결정해야 합니다.광학 현미경으로 접합자를 확인합니다. 접합자는 돌기가 있거나 없는 아령 모양의 세포로 관찰됩니다. 3mm 백금이를 사용하여 세포를 채집한 후, 100µL의 멸균수에 조심스럽게 넣습니다. 세포를 미리 표시해 둔 YPD 플레이트로 옮긴 후, 3mm 백금이를 사용하여 배지와 거의 닿지 않을 정도로 매우 살살 방울을 직선으로 펴 바릅니다. 액체가 배지에 흡수될 때까지 기다립니다.해부 현미경으로 이동합니다. 시야의 절반에는 세포가 있고 나머지 절반은 비어 있는 플레이트 영역에 초점을 맞춥니다. 바늘이 시야의 빈 영역에 닿도록 천천히 초점을 맞춥니다.이전 단계에서 보여준 바와 같이 수행합니다. 바늘에 이전 사용 시의 세포가 남아 있지 않은지 확인하십시오. A1 위치의 매트릭스로 이동하여 오거(auger)를 찔러 표시를 남깁니다.다시 한번 플레이트의 방향을 결정하는 데 도움을 받으십시오. 검색 모드로 전환하여 접합자를 찾습니다. 니들로 접합자를 집어 올립니다.접합자를 매트릭스 위에 개별적으로 배치합니다. 접합자를 며칠 동안 배양합니다. 이배체 세포를 포자 형성 플레이트에 패치하고 파트 3에서와 같이 진행합니다.서로 다른 교배형을 가진 두 개의 반수체 균주를 교배시키면 이배체 균주가 생성됩니다. 이 YPD 플레이트는 lu-2-ox 위축증을 가진 온도 민감성 균주와 야생형 균주 간의 교배 결과를 보여줍니다. 접종된 균주들은 왼쪽의 접종 영역에 도말되었으며, 두 검은색 선 사이로 두꺼운 성장 영역이 관찰됩니다.해부된 자낭(asci)이 오른쪽 매트릭스 상에 일정한 간격으로 성장해 있습니다. 이 YPD 플레이트를 SD leucine dropout 플레이트로 복제했을 때, LU2 마커에 대해 2:2 비율의 성장이 관찰되었으며, 이는 유효한 ASCO 포자가 해부되었음을 나타냅니다. 원래의 YPD 플레이트를 또 다른 YPD 플레이트로 복제하여 37 °C의 더 높은 온도에서 배양하였으며, 여기서 2:2 비율의 성장이 나타나 ASCO 포자가 해부되었음을 추가로 입증합니다.지금까지 두 개의 하이브리드 세포를 제작하고 이배체를 선택하는 방법을 살펴보았습니다. 이는 두 가지 서로 다른 방법에 기반하며, 하나는 영양 표지자를 사용하고 다른 하나는 세포 형태학에 기반합니다. 이 절차를 사용할 때, 영양 표지자가 예측된 대로 나타나는 사배체 분리로부터 새로 구축된 하이브리드 세포를 선택하는 것이 매우 중요함을 기억하십시오.또한 과도하게 소화시키거나 불충분하게 소화시키지 않는 것이 중요합니다. 과도하게 소화된 tetra as asci는 4분포자로 뭉쳐 있지 못하고, 불충분하게 소화된 경우에는 4분포자로 분리하기 어렵기 때문입니다. 이것으로 모두 마쳤습니다.실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

dissection-of-saccharomyces-cerevisiae-asci

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

우리는 침략과 pseudohyphal 차별화의 수단으로 효모 접착 및 한천 침공에 대한 질적 분석을 설명합니다. 이 간단한 분석은 다양한 돌연변이의 침략 표현형뿐만 아니라 효과 환경 단서를 평가하고 효모 차별에 대한 경로를 신호하는 데 사용할 수 있습니다.

S. cerevisiae의의 접착 및 아가르 침략을위한 분석

무균 조건 하에서 Gibberella zeae, 수집을위한 절차에 ascospores의 발달 과정을 공부를하는 것은 프로토콜에 대한 정보의 최고 수준을 생성하기 위해 촬영입니다. 이것은 실험, 전체 게놈 표현 프로필 테스트 구현하는 중요한 부분의 재현성을 촉진한다.

Microarray 실험에 대한 Gibberella zeae Ascospore 생산 및 수집.

빛과 전자 현미경에 대한 sectioning 수 있도록 효모 식민지를 포함하는 방법. 이 프로토콜은 곰팡이 지역 사회 내에서 세포 유형의 조직을 이해하는 방향으로 새로운 도구를 제공하는 식민지 이내 sporulated 세포 pseudohyphal 세포의 분포의 결정 수 있습니다.

효모 콜로니 임베딩 방법

효모에서이 프로토콜에서 유전자 발현...

Microarray 분석을위한 Saccharomyces cerevisiae</em

성 십자가와 재조합 자손의 고립은 사상균에 대한 중요한 연구...

의 성적 개발 및 Ascospore 방전 Fusarium graminearum</em

우리는 형광 세포의 내부 패턴을 관찰 할 효모 커뮤니티를 동결 cryosectioning을위한 프로토콜을 제시한다. 방법은 메탄올 - 고정에 의존하고 지역 사회 내에서 형광 단백질의 운영을 중지시키지 않고 세포의 공간 분포를 유지하기 위해 월 퍼가기.

형광 패턴 검사를위한 효모 커뮤니티 Cryosectioning

싹트는 효모에서 염색체를 표면으로 퍼뜨리는 방법이 제시됩니다. 이 방법은 이전에 Loidl과 Klein이 설명한 방법에서 파생되었습니다. 또한, 퍼진 염색체의 면역 염색 절차를 시연합니다.

표면 확산과 효모 염색체의 면역 염색

여기에서, 우리는 주사 전자 현미경 검사법 (SEM)를 사용하여 섬세한 조직 견본을 화상 진찰을 위한 상세한 처리 프로토콜을 제시합니다. 세 가지 다른 처리 방법, 즉, hexamethyl disilazana (HMDS) 화학 건조, 간단한 공기 건조 및 임계 점 건조는 각각 경질 계란 껍질, 초기 발달 단계에서 배아 및 곰팡이 배양을 준비하기 위해 설명됩니다.

전자 현미경 검사법을 검사하기위한 배아, 달걀 껍질 및 곰팡이 배양 처리

우리는 극저온 전자 단층 촬영을 통해 대용량 분자의 고해상도 구조 연구를 위해 극저온 중심이온 빔 마이크로머시닝에 의한 급락 냉동 생물학적 표본의 라멜라 제제를 위한 프로토콜을 제시합니다. 제시된 프로토콜은 사카로미세스 세레비시아에내부의 거대 분자의 구조적 특성화를 위한 높은 재현성을 가진 고품질 라멜라의 제조를 위한 지침을 제공한다.

냉동 전자 단층 촬영을위한 사카로미세스 cerevisiae의 준비 및 Cryo-FIB 마이크로 매칭

이 연구는 다양한 연령에서 쥐의 내이에서 내림프낭을 해부하는 방법을 설명합니다. 유사한 해부의 결과는 내림프낭의 확대에 대한 Slc26a4-null 마우스 모델에 나타나 있습니다. 내림프낭에 발현된 형광 리포터가 있는 형질전환 마우스를 내림프낭을 쉽게 시각화할 수 있는 모델과 교육 도구로 제시합니다.

생쥐의 내림프낭 해부

이 프로토콜은 7 일 이내에 대규모 토양 샘플 세트에서 효모와 곰팡이 Aspergillus fumigatus를 배양하는 효과적이고 신속한 방법입니다. 이 방법은 실험에 필요한 다양한 인큐베이션 배지 및 온도를 수용하도록 쉽게 변형 될 수 있습니다.

곰팡이 개체군 구조를 조사하기 위해 토양에서 배양 가능한 효모와 곰팡이를 분리합니다.

배우세요 효모 세포의 미세조작 기술을 이용한 감수분열 유전 분석 및 이배체 접합체 선택 방법입니다. 이 기법은 Saccharomyces cerevisiae를 활용하여 유전자형을 정확히 식별하고 연구할 수 있습니다.

의 해부 Saccharomyces Cerevisiae Asci

더 많은 동영상 탐색