측정 Caenorhabditis 엘레간스 수명

C 엘간의 수명을 측정하기 위해 생식 가능한 시기 난자 랭을 사용해 연령 동기화된 개체군을 생성합니다. 활동적인 자웅동체 벌레는 자외선으로 죽은 대장균을 심은 선충 성장 배지 판에 옮겨 6시간에서 8시간 동안 알을 낳은 후 이틀 동안 제거하면, 이 알에서 부화하여 L4 유충 단계로 성장합니다. L형 네 마리의 벌레는 살아있는 박테리아 오염을 막기 위해 암피실린이 포함된 새로운 NGM 플레이트로 옮겨지고, 번식을 막기 위해 FUDR을 사용해 성충으로 발달하도록 합니다.

이때부터 성충 벌레는 모든 벌레가 죽을 때까지 이틀에서 사흘마다 관찰됩니다. 각 시점에서 죽은 벌레를 판에서 제거하고 기록된 살아있는 벌레 수와 죽은 벌레 수를 기록합니다. 저는 워싱턴 대학교 병리학과 매트 캡라인 연구실의 조지 세튼입니다.

오늘은 수명을 측정하는 방법과 우리의 간염 우아함을 보여주겠습니다. 저희 실험실에서는 이 절차를 사용해 노화 유전학을 연구합니다. 그럼 시작해볼까요.

기본 수명 실험에는 두 가지 유형의 플레이트가 필요합니다. 표준 NGM 플레이트는 첨가물이 전혀 없고, AMP FUDR 플레이트는 NGM에 암피실린과 플루오로 디옥시 우리딘이 모두 첨가되어 있습니다. 두 종류의 플레이트 모두 대장균 OP 50이 자리 잡고 있으며, 이 박테리아는 자외선 노출로 죽습니다. 먼저 10밀리리터의 NGM 용액을 준비하세요.

60밀리미터 페트리 접시를 32번째 펄스로 전자레인지로 가열하여 고체 NGM을 완전히 녹입니다. 펄스 사이에 매체를 휘저어 압력이 쌓이는 가스 거품이 쌓이지 못하게 하고, 액체 NGM을 55도 수조나 작업대 위에 두어 매체가 식도록 하세요. 매체가 55도까지 식으면 맨손으로 유리 용기를 편안하게 들 수 있을 정도로 약을 넣을 준비가 된 것입니다.

그리고 약물 접시를 부을 때는 150밀리몰라 FUDR 33마이크로리터와 100밀리그램당 100마이크로리터를 추가하세요. 암피실린은 NGM 100밀리리터당 사용하고 혼합물을 휘돌리며 외부 박테리아 오염을 방지하고, FUDR는 알의 부화를 방지합니다. 따라서 벌레를 자라는 유충과 분리하기 위해 며칠마다 옮길 필요가 없습니다.

이제 배지를 부어 접시를 작업대에서 이틀간 건조시키고, 그 다음 날 접시가 신선한 대장균 한 줄기와 함께 씨앗 액체 LB 배양을 마치는 것을 마칩니다. LB 오거에 OP 50 박테리아가 있습니다. 60밀리미터 플레이트당 최소 0.5밀리리터 배양액을 준비하세요.

OP 50 배양물을 섭씨 37도의 셰이커에 넣고 박테리아가 하룻밤 동안 자라도록 하세요. 다음 날에는 OP 50 박테리아에 3,500g의 원심력을 10분간 펠릿으로 투여했습니다. 박테리아를 10배 농도로 재현탁할 만큼 충분한 상청액을 디캔트하세요.

이제 각 플레이트에 농축된 배양액 100마이크로리터를 접종하세요. 피펫 팁을 NGM 표면에 닿지 마세요. 매체 표면의 결함 때문에 벌레가 소용돌이 판을 파고들어 박테리아가 NGM 중앙 부위를 덮고 판 벽에 가까이 가지 않도록 하며, 접시판을 24시간 동안 작업대에 말리게 합니다. 건조 후에는 박테리아 성장을 멈출 만큼 강한 UV 선량에 플레이트 표면을 노출시키고, 우리는 스트라타 유전자 UV 스트래들 링커 2,400을 사용합니다.

플레이트를 뚜껑 없이 스트래들 링커에 넣는 것부터 시작하세요. 이제 에너지 버튼을 눌러. 키패드에 9 9 9 9를 입력하고 시작을 누르세요.

판은 약 5분간 자외선에 노출됩니다. 자외선으로 죽은 박테리아가 담긴 플레이트는 4도에서 거꾸로 보관할 수 있습니다. 이 섹션에서는 공통 부화 날짜를 가진 벌레 개체군을 생성하는 방법을 설명합니다.

약 20마리의 젊은 성충을 약물 없이 신선한 NGM 플레이트에 옮기는 것부터 시작하세요. 접시를 약 일주일 정도 25도 온도에서 두어 벌레가 번식하고 일주일 내에 모든 박테리아 먹이를 먹도록 하세요. 성장이 멈춘 지참수 단계에서 갓 부화한 지의류는 약물 없이 20에서 30마리의 지참수 유충을 신선한 NGM 배지에 옮겨 25도 섭씨에서 먹이와 함께 배양해야 합니다.

지참 유충은 이틀 내에 생식 활동이 가능한 성체가 되어 며칠간 생식 활동을 유지합니다. 이제 생식 활동 성인 10명에서 15명을 약물 없이 새로운 NGM 플레이트로 옮기세요. 이 판을 타이밍드 산란 판(TEL plate)이라고 합니다.

TEL 플레이트는 25도 섭씨로 두어 벌레가 알을 낳을 수 있게 하세요. 이 알에서 부화한 동물들은 실험 동물이며, 6시간 후에 수명이 평가됩니다. TEL 플레이트에 계란이 있는지 점검하세요.

아직 달걀이 부족하다면, TEL 플레이트를 최대 24시간 동안 25도 섭씨에 두세요. 주기적으로 알이 있는지 확인하고. 충분한 수의 알이 낳히면 성충을 TEL 플레이트에서 꺼내세요.

일반적인 수명 실험은 실험 그룹당 30개에서 90개의 난자가 필요하지만, 단일 TEL 플레이트에서 수백 개의 난자를 생성할 수 있습니다. 생식 활동이 활발한 10명에서 15명의 성인이 6시간에서 8시간 동안 약 150개의 알을 낳습니다. 실험군을 비교할 때, 30마리의 동물 정도로도 큰 수명 차이를 통계적으로 알 수 있습니다.

더 많은 동물을 사용해 더 작은 차이를 구별해야 합니다. 이제 성체 없는 TEL 플레이트를 20도 섭씨에 놓아 알이 부화하고 벌레가 L4 유충 단계로 발달할 때까지 보관합니다. 야생형 C 엘리건스는 보통 이틀이 걸리지만, 발달이 느린 품종은 더 오래 걸릴 수 있습니다.

이 절에서는 연령 동기화된 인구의 삶을 어떻게 따라가는지 설명합니다. 먼저, T 플레이트에서 앉은 AMP FUDR 플레이트로 L 4 유충을 옮깁니다. 각 균주나 상태에 대해, 보통 25개에서 30개의 벌레를 넣은 2개에서 3개의 플레이트를 설치하는 것이 일반적입니다.

AMP FUDR 플레이트는 20도 섭씨에서 24시간 동안 배양하세요. 그리고 육안으로 벌레, 배지, 박테리아가 새로운 AMP FUDR 플레이트로 옮기는 벌레를 평가합니다. 만약 벌레가 대부분의 박테리아 먹이를 먹었다면, 보통 일주일에 한두 번 정도 발생합니다.

실험 초기에 유충이 상당수 존재한다면, 이는 보통 벌레가 L 4가 아닌 젊은 성충으로 AMP FUDR 판으로 옮겨졌음을 나타냅니다. 젊은 성충은 FUDR이 작용하기 전에 알을 낳을 수 있으며, 때때로 유충이 FUDR의 영향을 피해 성충으로 성장하기도 합니다. 이 유충들은 실험을 혼란스럽게 하여 성충 벌레를 새 판으로 옮기고 유충이 담긴 기존 판을 버립니다.

살아있는 박테리아가 관찰되면 벌레는 신선한 플레이트로 옮겨야 합니다. 일반적으로 AMP와 UV 살균의 조합은 살아있는 박테리아가 실험을 오염시키지 않도록 보장하지만, 가끔 그런 일이 발생합니다. 그리고 벌레도 옮기세요.

배지에서 곰팡이 성장이 관찰된다면, 조기에 발견하면 피펫 팁이나 주걱으로 곰팡이를 제거할 수 있습니다. 지름이 몇 밀리미터 이상 커지면 보통 벌레를 새로운 판으로 옮기기가 더 쉬워집니다.

모든 벌레의 수명을 2일에서 3일마다 측정하세요. 해부 스코프를 사용했습니다. 각 벌레가 살아 있는지 죽었는지 확인하세요.

접시를 살짝 두드려. 웜이 탭에 반응해 움직인다면 살아있는 것입니다. 만약 벌레가 플레이트를 두드려도 반응하지 않는다면, 머리 부분을 확대하여 플래티넘 트랜스퍼 픽으로 웜의 머리를 부드럽게 두드리세요.

벌레를 죽은 것으로 평가해. 머리를 움직여도 반응하지 않으면 죽은 벌레를 판에서 제거하세요. 모든 벌레를 확인한 후, 날짜와 살아 있고 죽은 벌레 수를 기록하세요.

고체 매체 위에 유지된 벌레는 때때로 판 표면을 파거나 벽을 기어 올라가며 탈출하기도 합니다. 도망가는 벌레는 연구에서 완전히 제외되었습니다. 완성되면 플레이트를 20도 인큐베이터로 다시 넣으세요.

이틀에서 사흘 더 기다렸다가 다시 번호판을 확인해보세요. 이 방식을 모든 벌레가 죽을 때까지 계속하세요. 매일 죽는 벌레 수는 보통 반전되어 매일 살아있는 벌레 비율을 계산하며, 이 데이터는 산란 날짜를 고려한 생존 곡선으로 그래프로 그려집니다.

제로 데이. N의 전형적인 중간 수명 2. 20도 섭씨에서 자외선을 유지한 씨 엘간 야생형 균주는 박테리아를 죽이기 위해 달걀에서 측정할 때 약 25일간 생존합니다.

우리는 방금 수명을 측정하고 우아함을 보는 방법을 보여드렸습니다. 이 기본 절차를 수정하여 식이 제한과 RNA 간섭 등 다양한 환경 조건을 테스트할 수 있으며, 이는 지원 텍스트에서 다루고 있습니다. 그게 다야.

시청해 주셔서 감사하고, 실험에 행운을 빕니다.