Name: 측정 Caenorhabditis 엘레간스 수명 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-12T00:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 49 s
Description: 학습하세요 Caenorhabditis elegans의 고체 배지 수명 측정 프로토콜을 통해 노화 유전학 연구를 수행하는 방법을. UV 살균 박테리아와 연령 동기화 기법을 활용하여 정확한 수명 데이터를 획득할 수 있습니다.

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이 작품은 노인학 수상 및 NIH 그랜트 MKGS에 1R01AG031108 - 01 NIH 연수 부여 P30AG013280에서 지원하는에있는 글렌 / 멀리 획기적인 지원했다. MK는 노화에 엘리슨 의료 재단 신규 장학생입니다.

1 부 : 준비 선충류의 성장 미디어 (NGM) 접시 이 섹션은 수명 실험에 사용하기 위해 고체 NGM 플레이트의 준비에 대해 설명합니다. 암피실린 (앰프)와 NGM에 추가 fluorodeoxyuridine (FUDR)를 모두 가지고 아무런 첨가제 및 앰프 / FUDR 접시를 포함하지 표준 NGM 번호판, : 기본 수명 실험은 접시 두 가지 유형이 필요합니다. 암피실린 외국 세균 오염을 방지하는 데 사용됩니다. FUDR은 세포 분열을 억제 계란 생산을 감소하고, 부화에서 계란을 방지할 수 있습니다. 장수 분석을위한 FUDR의 사용은 성인 수명에 영향을 성장 유충에서 분리하기 위해 모든 며칠 벌레를 전송하는 필요를 제거하지 않습니다. 접시의 두 종류 E. 함께 씨앗 아르 이후 UV에 노출에 의해 살해 대장균 박테리아 OP50. <ol><li> NGM (조리법 및 스토리지 노트 섹션 5 참조)와 레이블 배양 접시를 준비합니다. 당신은 NGM 10 ML 당 1 60mm 페트리 접시가 필요합니다. 당신이 이전에 준비 고체 NGM 시작하는 경우, 1.2 단계로 진행합니다. 당신은 갓 autoclaved NGM 시작하는 경우, 1.4 단계로 건너 뜁니다. </li><li> 완전히 30초 펄스의 높이 microwaving하여 고체 NGM을 용융. 최대 건물에서 가압 가스 거품을 방지하기 위해 펄스 사이의 소용돌이 미디어. </li><li> 55 ° C 물 목욕이나 냉각 벤치에 자리 액체 NGM. </li><li> 일단 NGM 55에 도달 ° C 150 MM의 FUDR 33 μL과 100 MG / ML 100 ML NGM 당 암피실린 (앰프 / FUDR 접시)와 섞어 소용돌이 100 μL를 추가합니다. 추가 약물없이 NGM 접시에 대한 1.5 단계로 바로 진행합니다. </li><li> 각 60mm 배양 플레이트에 살균 기법, 피펫 10 ML NGM을 사용합니다. 가능하면 거품을 형성하지 마십시오. 거품이 양식을 할 경우, 그들은 피펫 팁을 사용하여 쐈고 수 있습니다. </li><li> NGM은 응고 및 건조 수 있도록 뚜껑에있는 벤치에 접시를 남겨주세요. 가능하면, 박테리아를 추가하기 전에 2 일간 벤치에 번호판을 떠나지만, 접시가 빨리 필요하면 일일 작동합니다. </li><li> 당일 번호판 E.의 신선한 행진에서 하나의 식민지로 건조, 종자 액체 LB 문화를 완료하기 전에 LB 한천에서 대장균 박테리아를 OP50. 당신은 60mm 판 당 하룻밤 OP50 문화의 최소한 1 ML 준비를해야합니다. </li><li> 37 장소 OP50 문화 박테리아 (문화 포화에 도달한다) 하룻밤 성장 ° C 뿌리와이 가능하다는 특징을 가지고있다. </li><li> 펠렛 OP50 10 분 3,500그램에서 회전에 의해 박테리아. </li><li> 문화 10X 집중 뜨는 및 resuspend 박테리아의 90 %를 제거합니다. </li><li> 확정 NGM 플레이트의 중심에 10X 집중 OP50 문화의 피펫 100 μL. (이상적으로 박테리아가 판 벽 근처에 오는없이 NGM의 중심 영역을 커버한다) 필요할 경우 소용돌이의 번호판은 부드럽게 박테리아 문화를 확산합니다. 미디어의 표면에 결함이 NGM로 버로우로 벌레를 허용 등 NGM의 표면에 피펫 팁을 만지는 피하기 위해보십시오. </li><li> 박테리아 문화가 고체 NGM (일반적으로 약 24 시간 소요)에 건조 수 있도록 밤새 벤치에 접시를 남겨주세요. </li><li> 일단 건조하고 박테리아의 성장을 체포하는 데 충분한 UV 복용으로 접시의 표면을 쉽게받을 수 있습니다. 당신은 Stratagene의 자외선 Stratalinker 2400을 사용하는 경우 : <ul><li> 플레이스 Stratalinker에 접시와 뚜껑을 제거 </li><li> 문을 닫고 Stratalinker 켜십시오 </li><li> 보도 자료 '에너지' </li><li> '9999 '은 키패드를 사용하여 입력 </li><li> 누르면 '시작' </li><li> 플레이트는 약 5 분 동안 자외선에 노출됩니다 </li></ul></li><li> UV - 살해 박테리아와 플레이트는 ° C 최대 1 개월 4에서 거꾸로 저장할 수 있습니다. </li></ol> 2 부 : 동물의 연령 동기 인구를 얻기 누워있는 시간이 초과되었습니다 달걀을 수행 이 섹션에서 우리는 공통의 해치 - 날짜와 웜의 인구를 생성합니다. 이것은 reproductively 활성 성인 시간 정의된 기간 동안 접시에 알을 낳을 수 있도록 이들 계란 개발함으로써 수행됩니다. <ol><li> (선택 사항) FUDR없이 신선한 NGM 접시에 약 20 젊은 성인 웜을 전송합니다. ° C 웜은 세균성 음식의 모든을 통해 전파하고 먹을 수 있도록 25 접시를 남겨주세요. 세균성 음식 섭취 후에는 새로 부화 벌레는 dauer 단계를 체포 성장을 입력합니다. 당신은 처음 접시로 전송 얼마나 많은 벌레에 따라 일주일 이내 주변 dauer의 유충을 볼 시작합니다. Dauer의 유충은 최대 1 개월 다음 단계에 사용할 수 있습니다. </li><li> FUDR없이 신선한 NGM 접시에 (옵션) 전송 20-30 dauer의 유충. 식품 dauer의 유충의 존재 2 일 이내에 reproductively 활성 성인이 될 것이며, 25 이후 며칠 동안 reproductively 활성 상태로 유지 ° C.가 </li><li> FUDR없이 신선한 NGM 접시에 10-15 reproductively 적극적인 성인을 전송합니다. 이 번호판은 시간 초과 에그 누워 (전화) 번호판이라고합니다. </li><li> ° C 6 시간 t를 허용하기 위해 25 TEL 접시를 남겨주세요그는 벌레 시간은 알을 낳기 위해. </li><li> TEL 플레이트에서 어른 벌레를 제거합니다. 플레이트는 시각 성인 제거하기 전에 달걀에 대한 검사를하실 수 있습니다. 벌레가 알을 충분한 숫자를 마련하지 않은 경우 TEL 판은 어른 벌레를 제거하기 전에 24 시간 총 최대 25 ° C에서 남아있을 수 있습니다. </li><li> 20 장소 TEL 판 ° C 계란이 부화하고 벌레가 L4 애벌레 단계 (이것은 일반적으로 야생 유형 C. 엘레간스 2 일이 소요하지만, 속도가 느린 개발 phenotypes와 종자에 대한 더 오래 걸릴 수 있습니다)을 개발하기 전까지. </li></ol> 파트 3 : 수명에 대한 점수 동물 그들은 죽을 때까지이 섹션에서 우리는 2 부에서 벌레의 시대 - 동기 인구를 수행합니다. 웜가 계란 생산 및 박테리아 오염을 방지하기 위해 앰프 / FUDR 접시에 유지되며 외부 자극에 반응하지 않는 경우 죽은 것으로 간주됩니다. <ol><li> 씨앗 앰프 / FUDR 접시에 L4 유충을 전송합니다. 각각의 변형이나 조건이 테스트되는 경우, 그것은 접시마다 25-30 벌레와 2-3 접시를 설정하는 것이 일반적입니다. C. 이미지 엘레간스 생활 단계는 참조 (그림 1)를 제공합니다 1. </li><li> 20 플레이스 앰프 / FUDR 접시 ° 24 시간 동안 C. </li><li> 24 시간 후에, 시각 웜, 미디어, 그리고 박테리아를 평가. 다음 중 하나를 관찰하는 경우 신선한 앰프 / FUDR 접시에 웜을 전송 : <ul><li> 웜는 세균 음식의 대부분을 먹었. 조기 수명의 실험 웜을 1로 2 배에게 고갈되는 세균을 방지하기 위해 일주일을 전송해야합니다. </li><li> 애벌레의 상당수가 존재하고 있습니다. 이것은 일반적으로 벌레가 젊은 성인 대신 L4s로 앰프 / FUDR 접시에 전송하고 FUDR이 효과를 데려가기 전에 몇 알을 낳을 수 있었던 것을 나타냅니다. FUDR은 일반적으로 전체 성인으로 성장의 애벌레를 방지할 수 있지만, 가끔 몇 어른으로 성장하고 실험 동물과 혼동이 될 것입니다. </li><li> 라이브 / 성장 세균이 관찰됩니다. 일반적으로 앰프와 UV - 살인의 조합은 사는 박테리아가 실험을 오염하지 않도록되지만 종종 발생합니다. </li><li> 곰팡이 성장은 미디어에 관찰됩니다. 초기 충분히 잡는다면, 곰팡이 성장은 일반적으로 피펫 팁 또는 주걱을 사용하여 잘라하실 수 있습니다. 일단 그것은 직경이 새 접시에 벌레를 전송하는 일반적으로 쉽게 몇 mm보다 큰 수 자랍니다. </li><li> 절개 범위를 사용하여, 각각의 벌레가 살아 있거나 죽어 있는지 확인합니다. </li><li> 부드럽게 접시를 누릅니다. 그것은 감​​청에 대한 응답으로 이동하면 웜이가 살아있다는 의미이다. </li><li> 웜은 머리 지역에있는 판, 줌 감청에 응답하지 않는 경우. </li><li> 부드럽게 플래티넘 전송 선택으로 벌레의 머리를 누릅니다. 그것의 머리를 이동하여 응답하지 않으면 죽은 벌레를 점수. </li><li> 죽은 벌레는 접시에서 제거할 수 있습니다. </li></ul></li><li> 살아 죽은 날짜와 벌레의 수를 기록합니다. </li><li> 20 ° C.에 접시로 돌아가기 </li><li> 모든 벌레가 죽었을 때까지 반복 3.3 3.6를 통해 모든 2~3일 단계를 반복합니다. </li></ol> 4 부 : 대표 결과. 선충류의 수명 실험에 의해 만들어진 원시 데이터 테스트 각 변형에 대한 살아있는 죽은 벌레의 해당 숫자와 날짜의 목록입니다. 매일 죽는 벌레의 수는 일반적으로 생존 곡선 (그림 2B로 그래픽 꾸몄다는 매일 살아있는 벌레의 비율 (그림 2A), 계산하기 위해 거꾸로되며 시간 초과 에그 누워 당일 것은 일 0로 간주됩니다 ). 연구의 각 웜에 대한 수명은 매일 죽는 벌레의 개수의 계산과 변종 사이의 비교에 대한 의미와 중간 수명을 계산하는 데 사용할 수 있습니다. 매일 살아있는 벌레의 수를 셀 수명 분석에 직접 사용되지 않습니다. 고체 미디어에 유지 벌레는 때로는 '도망'또는 언론 아래 접시 또는 아래의 벽까지 중 크롤 링합니다. 매일 살아있는 벌레의 수는 얼마나 많은 벌레들이 실험 과정을 통해 도망 결정하는 데 사용할 수 있습니다. 도망 웜은 일반적으로 분석에서 제거됩니다. N2, C.위한 벤치 마크로서, 전형적인 중간 수명 20 UV - 살해 박테리아에서 유지 엘레간스 야생 형 변형, ° C는 난자에서 측정한 약 25 일입니다. 제 5 부 : 솔루션 <table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> 선충류 성장 미디어 (NGM), 100 ML : </td></tr><tr><td colspan="2"> 컴바인 : </td></tr><tr><td> 0.3 g </td><td> NaCl </td></tr><tr><td> 0.25 g </td><td> 펩톤 </td></tr><tr><td> 2g </td><td> 한천 </td></tr><tr><td colspan="2"> 40 분 압력솥과 55 식지는 ° C, 다음 추가 : </td></tr><tr><td> 100 μL </td><td> 1 M MgSO 4 </td></tr><tr><td> 100 μL </td><td> 5 MG / ML 콜레스테롤 </td></tr><tr><td> 100 μL </td><td> 1 M CaCl2 </td></tr><tr><td> 1.625 ML </td><td> 1.5 M KPI의 산도 6.0 </td></tr><tr><td colspan="2"> 액체 NGM는 실온에서 번호판을 부어 즉시 사용되거나 응고 허용 및 장기 저장할 수 있습니다 </td></tr></tbody></table><table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> Luria 맛을 (LB), 1L : </td></tr><tr><td> 10g </td><td> BactoTryptone </td></tr><tr><td> 5g </td><td> 효모 추출 </td></tr><tr><td> 10g </td><td> NaCl </td></tr><tr><td> 10 ML </td><td> 1 M 트리스 산도 8.0 </td></tr><tr><td> 1 L </td><td> 탈이온수 </td></tr><tr><td colspan="2"> 압력솥과 실온에서 저장합니다. </td></tr></tbody></table><table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> 1 M MgSO 4, 300 ML : </td></tr><tr><td> 73.95 g </td><td> MgSO 4 </td></tr><tr><td> 300 ML </td><td> 탈이온수 </td></tr><tr><td colspan="2"> 압력솥과 실온에서 저장합니다. </td></tr></tbody></table><table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> 5 MG / ML 콜레스테롤, 200 ML : </td></tr><tr><td> 1g </td><td> 콜레스테롤 </td></tr><tr><td> 200 ML </td><td> 100 % 에탄올 </td></tr><tr><td colspan="2"> 소독 필터 및 실내 온도에 저장합니다. </td></tr></tbody></table><table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> 1 M CaCl 2, 500 ML : </td></tr><tr><td> 27.75 g </td><td> CaCl 2 </td></tr><tr><td> 500 ML </td><td> 탈이온수 </td></tr><tr><td colspan="2"> 소독 필터 및 실내 온도에 저장합니다. </td></tr></tbody></table><table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> 1.5 M KPI 산도 6.0 1L : </td></tr><tr><td colspan="2"> 컴바인 : </td></tr><tr><td> 31.4 g </td><td> KPI 이염 </td></tr><tr><td> 179.6 g </td><td> KPI 일염기의 </td></tr><tr><td> 850 ML </td><td> 탈이온수 </td></tr><tr><td colspan="2"> 히트 KPI는 솔루션으로 분해하도록 혼합하는 동안. 10 N NaOH와 6.0 산도를 조정합니다. </td></tr><tr><td colspan="2"> 1 L.에 탈이온수 추가 </td></tr><tr><td colspan="2"> 압력솥과 실온에서 저장합니다. </td></tr></tbody></table><table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> 1 M 트리스, 산도 8.0 : </td></tr><tr><td> 60.57 g </td><td> 트리스 </td></tr><tr><td> 400 ML </td><td> 탈이온수 </td></tr><tr><td colspan="2"> HCL과 8.0 산도를 조정합니다. </td></tr><tr><td colspan="2"> 500 ML에 탈이온수를 추가합니다. </td></tr><tr><td colspan="2"> 소독 필터 및 실내 온도에 저장합니다. </td></tr></tbody></table><table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> 150 MM Fluorodeoxyuridine (FUDR), 10 ML : </td></tr><tr><td> 0.3693 g </td><td> FUDR </td></tr><tr><td> 10 ML </td><td> 무균 탈이온수 </td></tr><tr><td colspan="2"> -20 ° C.에 저장 </td></tr></tbody></table><table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> 100 MG / ML 암피실린 (앰프), 10 ML : </td></tr><tr><td> 1g </td><td> 암피실린 </td></tr><tr><td> 10 ML </td><td> 무균 탈이온수 </td></tr><tr><td colspan="2"> -20 ° C.에 저장 </td></tr></tbody></table><table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> 50 MG / ML Carbenicillin (수화물), 10 ML : </td></tr><tr><td> 500 MG </td><td> Carbenicillin </td></tr><tr><td> 10 ML </td><td> 무균 탈이온수 </td></tr><tr><td colspan="2"> -20 ° C.에 저장 </td></tr></tbody></table><table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> 1 M 이소 프로필 β - D - Thiogalactopyranoside (IPTG), 10 ML : </td></tr><tr><td> 2.38 g </td><td> IPTG </td></tr><tr><td> 10 ML </td><td> 무균 탈이온수 </td></tr><tr><td colspan="2"> -20 ° C.에 저장 </td></tr></tbody></table><img src="/files/ftp_upload/1152/Figure%201.png" alt="그림 1"> C. 그림 1. 명시야 이미지 달걀을 포함 엘레간스 생활 단계, 네 개의 애벌레 단계 (L1 - L4) 및 성인. 모든 패널은 성인 남성 (우드 (1988)에서 이미지) 보여주는, 오른쪽 아래를 제외하고 나온것을 보여줍니다. <img src="/files/ftp_upload/1152/Figure%202.png" alt="그림 2"> C.에서 그림 2. 대표 결과 엘레간스 수명 실험은 DAF - 2 유전자에 돌연변이 포함된 변형으로 야생 유형 변형 N2를 비교. (A) 수집 벌레가 알을 이후 일수를 포함하여 데이터, 매일 관찰 죽은 벌레의 수를, 그리고 매일에 살아 남아있는 원래의 샘플의 비율 (죽은 벌레의 일상 건의부터 계산) 보여주는 표 . (B) 생존 (A)에서 제공하는 수명 데이터에 해당하는 곡선. <imgsrc files></imgsrc> 그림 3. 젊은이와 노인 성인 C. 사이 lipofuscin 대표 비교 엘레간스. 명시야 이미지는 오른쪽 왼쪽 채널 DAPI 형광 이미지에 표시됩니다. 상단 패널은 사일 오래된 웜 및 바닥 패널 (같은 난자에서 측정) 11일 오래된 벌레를 보여 보여줍니다.

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</ol>

장수 유전자 제어 C. 광범위하게 연구되어 수명을 확인할 수있는 쉽고 인텔리로 주로 인해 엘레간스. 본 문서에서 언급한 다른 프로토콜은 C로 재현성 수명 데이터를 얻기위한 기본 프레임 워크를 설명 엘레간스하며 relatednematode 수종에도 적용할 수 있습니다. 2 이러한 절차는 다양한 조건 하에서 수명을 측정하기 위해 적응 수있는 몇 가지 간단한 변경을함으로써. 여기 우리는 RNA 간섭 (RNAi), 세균의 박탈에 의해식이 제한, 그리고 약물없는 NGM, 라이브 박테리아를 포함한 몇 가지 일반적인 변형을 설명합니다. 아마이 프로토콜의 가장 일반적인 변형 라이브 박테리아에 벌레의 유지이다. 이것은 몇 가지 사소한 변경하여 수행할 수 있습니다. 첫째, 세균 (1.13 단계 1.7)와 접시 시딩위한 절차를 변경합니다. 대신 포화에 OP50 문화를 성장, 200 μL의 액체 문화에서 직접 접시...

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>시약</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0145-17-0 (214530)</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>시약</td><td>MidSci</td><td>0339</td><td></td></tr><tr><td>BactoTryptone</td><td>시약</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0123-17-3 (211705)</td><td></td></tr><tr><td>BactoPeptone</td><td>시약</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0118-17-0 (211677)</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>시약</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9699248 (1332-01)</td><td></td></tr><tr><td>Carbenicillin</td><td>시약</td><td>Gold Biotechnology</td><td>C0109</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C75209</td><td></td></tr><tr><td>Fluorodeoxyuridine (FUDR)</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0503</td><td></td></tr><tr><td>Isopropyl &amp;#946;-d-Thiogalactopyranoside (IPTG)</td><td>시약</td><td>Gold Biotechnology</td><td>I2481C5</td><td></td></tr><tr><td>KPi Dibasic</td><td>시약</td><td>Fisher Scientific</td><td>5087862 (3252-01)</td><td></td></tr><tr><td>KPi Monobasic</td><td>시약</td><td>Fisher Scientific</td><td>5087861 (3246-01)</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>시약</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9561800 (2500-01)</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>시약</td><td>Fisher Scientific</td><td>S251</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Yeast Extract</td><td>시약</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0886-17-0 (288620)</td><td></td></tr></tbody></table>

측정 caenorhabditis 엘레간스</em솔리드 미디어> 수명

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

노화는 세포의 구성 요소와 사망률의 결과 organelles의 점진적 저하 특징 퇴행성 과정이다. 선충류<em&gt; Caenorhabditis 엘레간스</em&gt; 노화의 생물학을 연구하는 데 사용하는 주요 모델로 등장했습니다. 거의 모든 생물 학적 서브 시스템이 점점 나이가 기능 감소를 겪습 때문에 노화의 총 비율을 고려할 때, 수명은 관심의 기본 종점이다. nematodes에서, 수명은 일반적으로 동물은 외부 자극에 반응 남아있는 일수로 정의됩니다. Nematodes은 액체 매체 또는 접시에있는 고체 매체에 중 전파 될 수 있으며, 기술은 두 조건에서 수명을 측정하기 위해 개발되었습니다. 여기 고체 선충류의 성장 미디어에 유지 nematodes의 수명을 측정하는 일반적인 프로토콜을 제시하고 UV - 살해 박테리아의 음식을 먹이. 이러한 절차는 쉽게 사는 박테리아,식이 제한, 그리고 RNA 간섭 구성된 식단을 포함하여 다양한 일반적인 조건 하에서 분석 수명을 적용할 수 있습니다.

이 문서에서 우리는 UV - 살해 박테리아 음식 고체 미디어에 유지 nematodes의 수명을 측정하는 일반적인 프로토콜을 제시한다.

측정 Caenorhabditis 엘레간스</em솔리드 미디어> 수명

노화는 세포 구성 성분과 세포 소기관의 점진적인 퇴화로 인해 사망에 이르게 되는 퇴행성 과정이다. 선충 ...

C. elegans의 수명을 측정하기 위해, 시간차 산란법을 사용하여 연령이 동기화된 집단을 생성합니다. 활동성 있는 성체 자웅동체 벌레를 UV로 사멸시킨 E. coli가 도말된 nematode growth media(NGM) 플레이트로 옮겨 6~8시간 동안 알을 낳게 한 후 제거합니다. 이후 이틀 동안 알에서 벌레가 부화하여 L4 유충 단계까지 성장합니다. L4 벌레를 살아있는 박테리아의 오염을 방지하기 위한 ampicillin과 생식을 억제하기 위한 FUDR이 포함된 새로운 NGM 플레이트로 옮겨 성체로 발달하도록 합니다.이 시점부터 모든 벌레가 죽을 때까지 2~3일마다 성충을 관찰합니다. 각 시점마다 죽은 벌레를 플레이트에서 제거하고, 살아있는 벌레와 죽은 벌레의 수를 기록합니다. 저는 워싱턴 대학교 병리학과의 Matt Capline 연구실 소속 George Seton입니다.오늘은 수명을 측정하는 방법과 이를 통해 확인한 C. elegans의 간염 상태를 보여드리겠습니다. 저희 연구실에서는 노화의 유전학을 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다. 그럼 시작하겠습니다.기초적인 수명 실험에는 두 종류의 플레이트가 필요합니다. 첨가물이 없는 표준 NGM 플레이트와, NGM에 ampicillin 및 fluoro deoxy uridine이 모두 첨가된 AMP FUDR 플레이트입니다. 두 종류의 플레이트 모두 e coli OP 50 박테리아를 도말한 후, uv 노출을 통해 박테리아를 사멸시킵니다. 먼저 10 milliliters의 NGM 용액을 준비하는 것으로 시작하십시오.60 mm 페트리 접시당 고체 NGM을 전자레인지의 고출력 모드에서 32초 간격으로 가열하여 완전히 녹입니다. 가압된 가스 기포가 생기는 것을 방지하기 위해 가열 단계 사이에 배지를 흔들어 줍니다. 액체 상태의 NGM을 55 °C 항온수조에 넣거나 벤치 위에 두어 배지를 냉각시킵니다. 배지가 55 °C까지 식어 유리 용기를 맨손으로 편하게 잡을 수 있게 되면, 약물을 첨가할 준비가 된 것입니다.약물이 포함된 플레이트를 제조하려면, NGM 100 mL당 150 mM FUDR 33 µL와 100 mg/mL Ampicillin 100 µL를 첨가하고 소용돌이치듯 섞어줍니다. Ampicillin은 외부 박테리아 오염을 방지하기 위해 사용하며, FUDR은 알의 부화를 막기 위해 사용합니다. 따라서 성장하는 유충으로부터 성충을 분리하기 위해 며칠마다 웜을 옮겨줄 필요가 없습니다.이제 배지를 붓고 플레이트를 벤치 위에서 이틀 동안 건조합니다. 플레이트 건조가 완료되기 전날, LB agar 플레이트에 신선하게 스트리킹한 e coli OP 50 박테리아의 단일 콜로니를 사용하여 액체 LB 배양액을 접종합니다. 60 mm 플레이트당 최소 0.5 milliliter의 배양액을 준비하십시오.OP 50 배양액을 37 °C 셰이커에 넣고 박테리아를 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 3,500 g의 원심력으로 10분 동안 원심 분리하여 OP 50 박테리아를 펠렛화합니다. 박테리아를 10배 농도로 재현탁할 수 있을 만큼 상층액을 데칸테이션하여 제거합니다.이제 각 플레이트에 농축된 배양액 100 µL를 접종합니다. 피펫 팁이 NGM 표면에 닿지 않도록 주의하십시오. 배지 표면에 흠집이 생기면 벌레가 그 속으로 파고들 수 있기 때문입니다. 박테리아가 플레이트 벽면에 닿지 않으면서 NGM의 중앙 영역을 덮을 때까지 플레이트를 회전시킨 후, 벤치 위에서 24시간 동안 건조시킵니다. 건조가 완료되면 박테리아 성장을 억제할 수 있을 만큼 충분한 강도의 UV 선량을 플레이트 표면에 조사합니다. 본 실험에서는 StrataGene UV Straddle Linker 2,400을 사용합니다.먼저 뚜껑을 제거한 플레이트를 스트래들 링커(straddle linker)에 로딩하십시오. 그런 다음 energy 버튼을 누릅니다. 키패드에 9 9 9 9를 입력하고 start 버튼을 누르십시오.플레이트를 약 5분 동안 UV에 노출시킵니다. UV로 박테리아를 사멸시킨 플레이트는 4°C에서 뒤집은 상태로 최대 한 달 동안 보관할 수 있습니다. 이 섹션에서는 부화 날짜가 동일한 벌레 집단을 생성하는 방법을 설명합니다.먼저 약 20마리의 젊은 성체 벌레를 약물이 포함되지 않은 신선한 NGM 플레이트로 옮깁니다. 벌레가 증식하고 일주일 이내에 모든 박테리아 먹이를 다 먹을 수 있도록 플레이트를 25 °C에서 약 일주일 동안 둡니다. 성장이 정지된 dower 단계의 갓 부화한 벌레들이 나타나면, 20~30마리의 dower 유충을 약물이 없는 신선한 NGM 플레이트로 옮기고 먹이가 있는 상태에서 25 °C로 배양합니다.dower 유충은 2일 이내에 생식 능력이 있는 성체로 성장하며, 이후 며칠 동안 생식 능력을 유지합니다. 이제 생식 능력이 있는 성체 10~15마리를 약물이 포함되지 않은 새로운 NGM 플레이트로 옮깁니다. 이 플레이트를 시간별 산란 또는 TEL 플레이트라고 합니다.충이 알을 낳을 수 있도록 TEL 플레이트를 25 °C에 둡니다. 이 알에서 부화한 개체들이 실험 동물이 되며, 6시간 후에 수명을 측정합니다. TEL 플레이트에 알이 있는지 확인합니다.아직 알의 수가 충분하지 않다면, TEL 플레이트를 25 °C에서 최대 24시간까지 유지하십시오. 주기적으로 알이 생성되었는지 확인하십시오. 충분한 수의 알이 낳아지면, TEL 플레이트에서 성충을 제거하십시오.전형적인 수명 실험에는 실험군당 30~90개의 알이 필요하지만, 단일 TEL 플레이트에서 수백 개의 알을 생성할 수 있습니다. 10~15마리의 생식 능력이 있는 성체는 6~8시간 동안 약 150개의 알을 낳습니다. 실험군을 비교할 때, 수명 차이가 큰 경우에는 30마리 정도의 적은 개체수로도 통계적 유의성을 확보할 수 있습니다.더욱 미세한 차이를 구별하기 위해서는 더 많은 수의 동물을 사용해야 합니다. 이제 성체가 없는 TEL 플레이트를 20 °C에서 보관하여, 부화한 알과 벌레들이 L4 유충 단계까지 발달하도록 합니다. 야생형 C elegance의 경우 일반적으로 2일이 소요되지만, 발달 속도가 느린 표현형을 가진 균주의 경우에는 더 오래 걸릴 수 있습니다.이 섹션에서는 연령이 동기화된 개체군의 생애를 추적하는 방법을 설명합니다. 먼저, L4 유충을 TEL 플레이트에서 준비된 AMP FUDR 플레이트로 옮깁니다. 테스트하려는 각 균주 또는 조건에 대해, 일반적으로 플레이트당 25~30마리의 벌레를 포함하는 플레이트를 2~3개 준비합니다.AMP FUDR 플레이트를 20 °C에서 24시간 동안 배양합니다. 그런 다음 벌레, 배지 및 박테리아 상태를 육안으로 평가하고 벌레를 새로운 AMP FUDR 플레이트로 옮겨줍니다. 벌레가 박테리아 먹이를 대부분 섭취했다면, 이는 보통 일주일에 한두 번 정도 발생합니다.실험 초기 단계에서 상당수의 유충이 관찰된다면, 이는 일반적으로 벌레를 L4 단계가 아닌 성체 초기(young adults) 단계에서 AMP FUDR 플레이트로 옮겼음을 나타냅니다. 성체 초기 벌레는 FUDR이 효과를 나타내기 전에 알을 낳을 수 있으며, 때로는 유충이 FUDR의 영향을 벗어나 성체로 성장하기도 합니다. 이러한 유충들은 실험 결과에 혼선을 줄 수 있으므로, 이 경우 성체 벌레를 새로운 플레이트로 옮기고 유충이 포함된 기존 플레이트는 폐기하십시오.살아있는 박테리아의 성장이 관찰되는 경우에도 벌레를 새로운 플레이트로 옮겨야 합니다. 일반적으로 AMP와 UV 살균을 병행하면 살아있는 박테리아가 실험을 오염시키지 않도록 보장할 수 있으나, 때때로 오염이 발생할 수 있습니다. 또한, 벌레를 옮겨 줍니다.배지에서 곰팡이 성장이 관찰되는 경우, 조기에 발견했다면 피펫 팁이나 스패튤라를 사용하여 곰팡이 부분을 제거할 수 있습니다. 곰팡이의 직경이 몇 mm 이상으로 커지면, 일반적으로 벌레들을 새 플레이트로 옮기는 것이 더 효율적입니다.2~3일마다 모든 벌레의 수명을 측정합니다. 해부 현미경을 사용하여 각 벌레의 생존 여부를 판별합니다.플레이트를 가볍게 두드립니다. 두드리는 자극에 반응하여 움직이면 벌레가 살아 있는 것입니다. 플레이트를 두드려도 반응이 없는 경우, 머리 부분을 확대하고 백금성 전이 픽(platinum transfer pick)으로 벌레의 머리를 가볍게 두드립니다.해당 벌레를 죽은 것으로 판정합니다. 머리를 움직여 반응하지 않으면, 죽은 벌레를 플레이트에서 제거하십시오. 모든 벌레를 확인한 후, 날짜와 살아있는 벌레 및 죽은 벌레의 수를 기록하십시오.고체 배지에서 사육 중인 벌레는 때때로 굴을 파거나 벽면을 기어올라 플레이트 표면을 탈출할 수 있습니다. 탈출한 벌레는 연구 대상에서 완전히 제외합니다. 작업이 끝나면 플레이트를 20 degrees Celsius 배양기로 돌려놓으십시오.2~3일 더 기다린 후 플레이트를 다시 확인합니다. 모든 벌레가 죽을 때까지 이 과정을 반복합니다. 매일 죽은 벌레의 수를 일반적으로 역산하여 매일 생존한 벌레의 비율을 계산하며, 이 데이터를 시간별 산란일을 기준으로 생존 곡선으로 도식화합니다.0일 차. 20 °C의 UV kill bacteria 배지에서 배양된 야생형 C. elegans 균주의 일반적인 중앙값 수명은 알 단계부터 측정했을 때 약 25일입니다.지금까지 수명을 측정하고 노화의 징후를 관찰하는 방법을 살펴보았습니다. 이 기본적인 절차를 수정하여 지원 텍스트에서 다루는 식이 제한 및 RNA 간섭을 포함한 다양한 환경 조건을 테스트할 수 있습니다. 이것으로 모든 설명을 마치겠습니다.시청해 주셔서 감사드리며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

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복제 설정된 방법: 양적 측정 꼬마 선 충 수명에 접근 높은 처리량

Caenorhabditis elegans는 건강, 수명 및 스트레스에 대한 탄력성을 조사하기위한 강력하고 저렴한 방법을 갖춘 우수한 모델 시스템 역할을합니다.

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여기에 제시된 것은 미세 가공된 멀티웰 장치의 고체 배지에서 분리된 개별 선충을 배양하기 위한 최적화된 프로토콜입니다. 이 접근 방식을 통해 활동, 신체 크기 및 모양, 움직임 기하학 및 생존을 포함하여 노화 및 건강과 관련된 다양한 표현형에 대해 개별 동물을 평생 동안 모니터링할 수 있습니다.

Multi-well 장치의 고체 배지에서 분리된 Caenorhabditis elegans의 장기 배양 및 모니터링Long-term culture and monitoring of isolated Caenorhabditis elegans on Solid Media in Multi-well devices

여기에서 우리는 평생 생리학적 매개변수 추적 및 형광 정량화를 위해 고체 배지에서 분리된 개별 선충을 배양하는 프로토콜을 제시합니다. 이 배양 시스템에는 동물이 도망가는 것을 방지하기 위해 단일 벌레 우물 주위에 팔미트산 장벽이 포함되어 있어 병원성 박테리아 및 화학적 스트레스 요인을 포함한 혐오적인 개입을 사용할 수 있습니다.

Longitudinal Fluorescence Monitoring and Averseive Interventions를 위한 고체 배지에서 개별 Caenorhabditis elegans 의 장기 배양

여기에서 우리는 모델 유기체 C. elegans를 사용하여 배아 생존력과 생산된 배아(새끼)의 총 수를 결정하는 일반적인 방법을 제시합니다.

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이 프로토콜은 액체 배양에서 박테리아의 청소율을 측정하여 Caenorhabditis elegans 섭식 속도를 정량화하는 분석을 설명합니다.

예쁜꼬마선충( Caenorhabditis elegans )의 음식 섭취량을 세균 청소율 측정으로 정량화

학습하세요 Caenorhabditis elegans의 고체 배지 수명 측정 프로토콜을 통해 노화 유전학 연구를 수행하는 방법을. UV 살균 박테리아와 연령 동기화 기법을 활용하여 정확한 수명 데이터를 획득할 수 있습니다.

측정 Caenorhabditis 엘레간스 수명

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