Name: P2X2 리간드 - 게이 티드 양이온 채널과 상호 작용하는 단백질을 확인하는 Proteomics (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-18T23:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 36 s
Description: 배우세요 P2X2 수용체 C말단과 상호작용하는 뇌 단백질을 GST 풀다운 및 질량분석법으로 식별하는 프로토콜입니다. 이 방법은 P2X 수용체 신호전달 메커니즘 연구에 활용됩니다.

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SW와 TMV는 국립 보건원에서 NCRR 및 NHLBI 지원합니다. BSK와 HS은 국립 보건원의 NINDS와 NIGMS에 의해 지원됩니다.

실험 절차 실험 절차 (그림 2) 아래 단계 현명한 방식으로 설명하는 네 부분으로 구성되어 있습니다. 1 부 : P2X2 수용체의 C - 말단의 Subcloning, 그리고 표현. 우리는 바인딩하는 뇌 단백질을 식별하는 전체 길이 박테리아 P2X2 수용체의 C - 말단을 표명했습니다. <ol><li> P2X2 수용체 (그림 1)의 C ​​- 말단은 (잔류물 353-472) pGEX 4NT1 (GE 생명 과학)로 복제 및 시퀀싱과 검증, PCR에 의해 증폭되었다. </li><li> 재조합 플라스미드가 E.으로 변화되었다 재조합 단백질의 표현에 대한 대장균 (BL21). </li><li> 플라스미드 P2X2 CT - GST를 포함하는 박테리아 (E. 대장균 BL21)의 글리세롤 주식은 멸균 피펫 팁과 스크랩한 적합 선택적 마커 (50 G / ML 암피실린)와 함께 Luria - Bertani (LB) 미디어 5 ML에 주사했다 37C에서 궤도 통에 하룻밤 incubated. </li><li> 600 nm의에서 광학 밀도가 도착할 때까지 밤새 재배 문화는 적절한 항생제 (50 μg / ML 암피실린)와 LB 미디어 250 ML에 주사하여 37C에서 2-3 시간 250 rpm으로 궤도 통에 incubated되었습니다 ~ 0.6-0.7. </li><li> 문화 IPTG의 1 ㎜로 유도 나아가 단백질 표현을위한 3 시간을 위해 37C에 incubated했다. </li><li> 문화 다음 4C (문화의 1ml이 표현 수준을 분석 저장하고 &#39;유도&#39;로 표시했습니다) 15 분 5천그램에 소용되었다. 뜨는은 폐기되었으며 펠렛은 살린 트리스 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (인트) 버퍼 (10 MM 트리스 - HCL, 150 MM NaCl, EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 1 ㎜의 산도 8.0) 20 ML에 resuspended되었습니다. </li><li> 정지 50 ML 팔콘 튜브에서 15 분 5,000g에 소용되었다. 뜨는은 폐기되었으며 세미 드라이 펠렛은에 - 70C가 하룻밤 냉동했다. </li><li> - 70C 펠렛은 얼음 차가운 용해 완충액 (2 % (W / V) sarkosyl 15 MG 라이 소 자임, 150 MM NaCl, 트리스 pH7.5 50 MM, 5 MM의 DTT 완벽한 테아제 억제제 정제) 40 ML에 resuspended되었습니다 그리고 정지 30 분 얼음 incubated되었습니다. 이 부화하는 동안, 3 ML 글루타티온 - 세파 로스 4B 비즈는 인산 버퍼 살린 (PBS)과 PBS 다음 20 ML T - PBS (0.1 % (V / V) PBS에서 tritonX - 100) 20 ML로 세탁했다. 비즈는 1 ML PBS에서 resuspended되었습니다. </li><li> 세균 현탁액 액체 질소에 3 번 동결 - 해동 및 sonicated (1S ON / OFF, 얼음 3 분 30 마이크론)와 추가 4퍼센트 30 분 (V / V) 트리톤 X - 100, 10 MM MgSO에 대한 incubated되었습니다 4 얼음 2 MM ATP. </li><li> lysate는 (펠렛 1 뜨는의 ML cytosol과 세포막에있는 단백질의 양을 테스트 SDS 페이지에 저장된에서 샘플) 삭제되었습니다 4C 및 펠릿 15 분 2만그램에 소용되었다. 뜨는은 1 시간 (또는 야간) 4C에 대한 주판으로 incubated했다. </li><li> 구슬은 5 분 500g에 늘인되었으며 뜨는가 (예제는 언바운드 분율 저장되었습니다) 삭제되었습니다. 구슬은 T - PBS 다섯 번 (세척은 세척 컨트롤에 대한 저장된)로 세탁했다. </li><li> 구슬 그런 다음 50 % (W / V에게) 슬러리를 제공하기 위해 PBS에 resuspended 및 사용까지 4C에 냉장고에 저장되었습니다. 단백질 농도는 브래드 분석 (제조 업체의 지침에 따라)에 의해 추정되었다. </li></ol> 2 부 : 전체 두뇌 lysates의 준비 P2X2 수용체가 다량으로 뇌 8 표현하는 것으로 알려져 있습니다. 현재 분석에서 우리는 쥐의 뇌 전체 lysates (그림 3)에서 P2X2 수용체와 상호 작용하는 단백질을 식별하는 모색. <ol><li> 성인 쥐 두뇌는 수확 (동물 UCLA IAACUC 승인 프로토콜에 따라과 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 NIH 가이드에 따라 희생되었다)와 즉시 얼음 차가운 PBS (3 배)을 씻어서했습니다. </li><li> 10 ML (수확 뇌의 ~ 5 배 젖은 무게) 150 MM를 포함하는 얼음 차가운 용해 버퍼의 NaCl, 50 MM 트리스 - HCL, pH를 7.4, 10 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 1 MM EGTA, 1 MM NaF, 1 ㎜ 셀을 lyse하기 나 3 할머니 4, 1 ㎜ PMSF, 5 류펩틴의 μg / ML, 1 % (V / V) NP - 40, 그리고 프로 테아제 억제제 칵테일의 정제는 수확 두뇌에 추가되었습니다. </li><li> 균질 일관성의 혼합물이 달성되기 전까지는 뇌 조직은 유리 다운스의 균 질기와 얼음 homogenised되었습니다. </li><li> 세포 lysate은 깨지지 세포를 제거하는 5 분 2,000그램에 소용되었다. 뜨는은 그대로 organelles 및 멤브레인 집계를 제거하는 60 분 2만9천g에서 다시 수집 소용되었다. </li><li> 즉시 원심 분리 후 뜨는은 깨끗한 튜브로 이송되었다. 전체 뇌 lysate의 단백질 농도는 브래드 포드 분석에 의해 측정되었다 (보통 ~ 15 MG / ML). </li><li> lysate는 aliquoted과에서 - 70C 저장되었습니다. </li></ol> 파트 3 : P2X2 C - 꼬리 관련 단백질의 분리 전체 뇌 lysates에서 P2X2 CT - GST의 바인딩 파트너를 식별하려면 분석 아래로 끌어가 CT - G를 사용하여 수행되었습니다ST 미끼로 글루타티온 세파 로스 4B 비즈를 고정. 컨트롤, 구슬로 바운드 혼자 GST를 사용했습니다. <ol><li> 브레인 lysate는 4C에서 1 시간에 대한 GST 비즈와 precleared했다. 펠렛은 폐기되었으며 뜨는은 추가 분석을 위해 사용되었다. </li><li> GST와 P2X2 글루타티온 세파 로스 4 B 비즈에 바운드 CT - GST (10 μg)의 동등한 양의 용해 버퍼에 4C에서 회전, 쥐의 뇌 전체 lysate에서 precleared solubilised 단백질 100g과 함께 하룻밤 incubated되었습니다. </li><li> 비즈 5 분 1천g에 늘인되었으며 뜨는가 삭제되었습니다. </li><li> 구슬은 용해 버퍼와 한번 세탁하고 수정 Laemli 버퍼에 삶은되었습니다 [4 % (W / V) SDS, 10 % (V / V) 2 - 메르 캅 토 에탄올, 2 % (V / V) 글리세롤, 0.004 % (W / V) bromophenol 청색과 0.125 M TrisCl 산도 6.8] 5 분. </li><li> 샘플은 5 분와 10 % SDS - PAGE (그림 4)로 구분하여 뜨는 위해 5,0​​00그램에 소용되었다. 젤은 SYPRO 루비 단백질 얼룩 젤 (제조 업체의 지시에 따라)과 자외선을 시각 물들일되었습니다. P2X2 CT - 관련 단백질은 미끼로 GST - NULL을 사용하여 복구 사람과 비교했다. 네 생물 학적는 (4 머리과 네 개의 독립적인 끌어 오기 때로는 IE) 수행되었습니다 복제합니다. </li></ol> 4 부 : 단백질의 식별. 겔 전기 영동에 의해 분리된 단백질은 젤에서 excised 및 질량 분석법 12 확인되었습니다 참고 :. 프로세스 전반에 걸쳐 먼지의 부재는 각질 오염을 줄이기 위해 중요합니다. 실험자는 항상, 헤어 네트와 장갑을 얼굴 마스크를 착용하고 장갑을 사용하지 않고 관심의 겔 영역을 터치하지 않습니다. <ol><li> 아래 P2X2 당겨에서 발견한 모든 보이는 단백질 밴드는 깨끗한 면도날로 excised하고 (그림 4) 절단되었습니다. GST - NULL에 젤의 해당 영역 레인 풀다운도의 수준 아래의 단백질의 존재를 확보하기 위해 밴드 얼룩 (GST - NULL 미끼 특정 밴드도 excised 및 식별되었다)에 관계없이 동일한 방식으로 excised되었습니다 얼룩의 감도는보고되지 않았습니다. </li><li> 겔 조각은 200 50 % 50 MM의 탄산수 소 암모늄의 μl (V / V) acetonitrile (ACN)과 RT 15 분 vortexed 튜브 incubated되었습니다. 이 세척 단계를 반복합니다. </li><li> 겔 조각 200 μl acetonitrile (겔 조각이 수축 및 색상의 불투명 될한다)를 추가하여 탈수 있었다. </li><li> Acetontrile 제거하고 젤 조각 ~ 10 분 speedvac에서 건조되었다. </li><li> 겔 조각 그런 다음 조각을 담가에 신선한 10 MM MM DTT/10 트리스 (2 - 카르복시 - 에틸) 충분한 볼륨의 phosphine 하이드로 클로라이드 (TCEP) 30 μl와 incubated했다. 이것은 56C 물을 욕조에 30 분 남았는데. </li><li> 다음 DTT 솔루션 100 μl 500 50 % acetonitrile 솔루션 MM의 탄산수 소 암모늄 및 ammounium의 중탄산염로 씻은 겔 슬라이스로 대체되었습니다. </li><li> 세탁 솔루션은 aspirated과 acetonitrile 200 μl가 젤을 탈수에 추가되었습니다. </li><li> Acetonitrile 그런 다음 제거 100 μl 신선한 100 MM의 iodoacetamide 솔루션 무료 sulfhydryls을 alkylate에 추가되었습니다. 이 단계는 어둠 속에서 실온에서 25 분 진행. </li><li> Iodoacetamide 솔루션은 제거하고 vortexing하면서 겔 조각은 2 분 50 % acetontrile (산도 8.0) 50 MM의 탄산수 소 암모늄 200 μl로 세탁했다. 이 세척 단계가 반복되었다. </li><li> 세척 용액을 제거한 후 겔 조각 그러면 ~ 10 분 대한 speedvac에 의해 제거되었습니다 200 μl acetonitrile와 incubated했다. </li><li> 이 단계에서는 겔 조각은 트립신의 소화를 위해 준비가되어 있습니다. 젤 조각은 30 μl 트립신 용액 (20 μL / NG 작업 농도)에 incubated 잘 부푼 수 젤류 10 분 얼음에 배치했다. 초과 트립신은 제거하고 그들은 37C에서 12~16시간 위해 진행하는 허용했다 소화에 걸쳐 포장되어 보관 50 MM의 탄산수 소 암모늄 30 μl와 중첩 겔 입자를 rehydrated했다. </li><li> 5 % 다섯 μl (V / V) 개미의 산성은 트립신과 체포 소화를 비활성화에 추가됩니다. </li><li> 튜브는 ~ 15 분 vortexed 후 깨끗하고 표시 0.5 ML의 약병으로 전달했던 튜브의 바닥에 액체를 가지고 간단히 centrifuged했다. </li><li> 그들은 단지 간단한 원심 분리로 구분하여, 10-15 분 두 vortexing 다음 적용 너무나도 50 % acetonitrile에 0.1 %의 향후 30 μl (V / V) 개미의 산성은 겔 조각에 추가되었습니다. 이 단계는 단계 사이의 산성 - acetonitrile 개미의 교체, 한 번 반복했다. </li><li> 최종 액체는 하나의 약병에 제거하고 모든 추출 솔루션을 결합했다. 이 볼륨은 speedvac에서 ~ 30 UL로 축소되었다. 샘플은 현재 대량 분석법에 의해 반대로 위상 나노 액체 크로마 토그래피 및 단백질 식별을 위해 준비했습니다. 이 특정 예제에서,이 단계는 ThermoF에서 Orbi - 트랩 탠덤 질량 분석기에서 수행됩니다다른 모델 및 제조 업체의 악기가 쉽게이 시점에 설명된 방식으로 결합 수 있지만 isher (높은 질량 정확성, 단백질 검출을위한 빠른 듀티 사이클 일반적으로 강력한 운영 기능 선택). </li><li> 대량 spectrometric 분석에 대한 자세한 내용 및 기준은 이제 간단히 소개하는 부분이있다. 모든 펩티드는 반대 위상 나노 LC (Eksigent)와 펩티드가 3 μl / 분 유량에서 C18 리버스 위상 칼럼에 로드된되었다로 구분되었다. 모바일 위상 0.1 % 개미 산성과 물에 2 % ACN했습니다, 모바일 위상 B는 0.1 % 개미 산성과 ACN 20 %의 물이되었다. 펩티드는 220 NL / 분 5 분 이상 95 % B로 다음 90 분 이상 50 % B로 5 % B에서 선형 그라디언트를 사용 유량에있는 기둥에서 eluted, 그리고 마지막 5 분 지속적인 95 % B를 유지했다 . 스펙트럼은 MS / MS 검사에 대한 MS의 검색 및 LTQ 사용되는 Orbi - 트랩과 함께 데이터 종속 모드로 인수되었습니다. 펩티드는 Bioworks 소프트웨어 패키지에 통합된 SEQUEST 알고리즘을 사용하여 쥐의 IPI 데이터베이스 v.3.53에 대한 스펙트럼을 검색하여 확인되었다. 각 펩티드는 다음 기준을 충족 : XCorr ≥ 2 (+1), ≥ 3 (+2), ≥ 4 (3), 그리고 DeltaCN&gt; 0.1. 단백질 식별에 사용되는 모든 스펙트럼은 수동 검사 및 채 2 펩티드가 확인되었을 때 어떤 단백질 허용되지 않았습니다. 단 단백질은 GST - NULL 끌어 오기 다운즈 동안 네 개의 P2X2 끌어 오기 양지 각각 결석 다음 현재는 추가 분석을 위해 고려되었다. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1178/1178fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. P2X2 수용체의 subunit의 도식 표현. A.이 만화는 P2X2 수용체의 subunit의 토폴로지를 보여줍니다. cytosolic 도메인 N과 C 테르 미니 (Termini)로 구성되어 있습니다. P2X2 수용체 (적색)의 C - 말단은 분석 풀다운을위한 미끼로 사용되었습니다. 본 연구에서 사용되는 P2X2 수용체의 C - 말단의 B. 아미노산 서열은. <img src="/files/ftp_upload/1178/1178fig2.jpg" alt="" /> 그림 2. 플로우 차트와 표현에 사용되는 프로토콜의 시간 라인, 정화는 풀다운 및 단백질의 식별. 우리는 시간 라인 프로토콜의 개요를 보여줍니다. 성인 쥐 두뇌 lysate은 즉시 assays 풀다운을 위해 사용하기 전에 신선 준비했습니다. <img src="/files/ftp_upload/1178/1178fig3.jpg" alt="" /> 그림 3. 쥐의 두뇌에 P2X2 C - 터미 너스 네트워크의 이진 proteomic 분석의 도식 표현. GST 비즈에 바운드 GST 단백질과 융합 P2X2 수용체의 C - 말단은 assays 풀다운을 위해 사용되었다. 브레인 lysate 준비되었고 단백질은 재조합 단백질 고정화와 incubated했다. 언바운드 분율은 용해 버퍼로 세탁했다. 단백질은 질량 분광법으로 확인되었습니다. <img src="/files/ftp_upload/1178/Fig%204%20Singh%20et%20al.jpg" alt="" /> 그림 4. P2X2 수용체의 C - 말단의 바인딩 파트너의 식별. GST (파란색 상자)와 융합 수용체의 C - 말단과 상호 작용하는 단백질 putative의 스펙트럼을 보여주는 Sypro 스테인드 젤. 혼자 혼자 GST (노란색 상자)과 글루타티온 세파 로스 비즈에 대한 컨트롤 차선도 표시됩니다. 화살표 대량 분석법에 의해 더 분석을위한 excised되었습니다 독특한 밴드의 예를 나타냅니다.

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</ol>

이온 채널은 필수적인 멤브레인 단백질의 주요 클래스입니다. 그들은 선택적으로 플라즈마 막 걸쳐 자신의 전기 그라디언트 아래 이온의 움직임을 허용 물이 가득 모공이 포함되어 있습니다. 개방과 폐쇄 상태 사이의 이온 채널 게이트. 게이팅 단계 P2X의 리간드 게이 티드 이온 채널의 경우에는 송신기 (예 : ATP)에 의해 트리거됩니다, 또는 그것은 다른 단백질과 상호 작용에 의해 규제 수 있습니다. 지난 10 년간은 P2X 수용체가 ATP 13 바인딩하는 방법에 대한 우리의 이해의 증가를 목격하고 있지만 P2X 기능 조절에 보조 단백질의 역할은 덜 잘 이해 남아있다. 이 프로토콜에 설명된 접근 방식은 (첫 단계) C - 말단 세포와 상호 작용하는 단백질을 검사하여 P2X2 수용체에 의해 형성 신호 단지를 식별하도록 설계되었습니다. P2X2 수용체 신호 단지의 전체지도는 이러한 매혹적인 채널의 pathophysiology에 많이 필요한 통찰력을 제공할 것입니다.

<table><tbody><tr><td>아세토니트릴</td><td>시약</td><td>JT Baker</td><td>9829-02</td><td></td></tr><tr><td>아크릴아마이드</td><td>시약</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0156</td><td></td></tr><tr><td>암피실린</td><td>시약</td><td>VWR international</td><td>VW1507-01</td><td></td></tr><tr><td>탄산수소암모늄</td><td>시약</td><td>Fluka</td><td>09830</td><td></td></tr><tr><td>과황산암모늄 (APS)</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>아데노신 삼인산 (ATP)</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7699</td><td></td></tr><tr><td>브래드포드 시약</td><td>시약</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0006</td><td></td></tr><tr><td>브로모페놀 블루</td><td>시약</td><td>Fisher Scientific</td><td>B-392</td><td></td></tr><tr><td>코마시 블루 R-250</td><td>시약</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>Sc-24972</td><td></td></tr><tr><td>디티오트레이톨 (DTT)</td><td>시약</td><td>EMD Millipore</td><td>3860</td><td></td></tr><tr><td>에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA)</td><td>시약</td><td>VWR international</td><td>VW1474-01</td><td></td></tr><tr><td>에틸렌글리콜 tetraacetic acid (EGTA)</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E8145</td><td></td></tr><tr><td>개미산</td><td>시약</td><td>EMD Millipore</td><td>11670-1</td><td></td></tr><tr><td>Glutathione Sepharose 4B 비드</td><td>시약</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5132-01</td><td></td></tr><tr><td>염산 (HCl)</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>이소프로필-베타-D-티오갈락토피라노사이드 (IPTG)</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>15502</td><td></td></tr><tr><td>이오도아세트아미드</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I1149</td><td></td></tr><tr><td>루리아-버타니(Luria-Bertani, LB) 배지</td><td>시약</td><td>EMD Millipore</td><td>1.00547.5007</td><td></td></tr><tr><td>류펩틴</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L8511</td><td></td></tr><tr><td>라이소자임</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>62971</td><td></td></tr><tr><td>황산마그네슘 (MgSO4)&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨 (NaCl)</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>플루오린화 나트륨 (NaF)</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7920</td><td></td></tr><tr><td>오르토바나듐산 나트륨 (Na&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;음성 해설&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6508</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P40</td><td>시약</td><td>Fluka</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>페닐메탄설포닐플루오라이드 (PMSF)</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>프로테아제 억제제 정제</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8820</td><td></td></tr><tr><td>단백질 표준물질 </td><td>시약</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0305</td><td></td></tr><tr><td>사코실(Sarkosyl)</td><td>시약</td><td>Acros Organics</td><td>61207</td><td></td></tr><tr><td>스크류 캡 바이알</td><td>도구</td><td>Agilent Technologies</td><td>5182-0866</td><td></td></tr><tr><td>소듐 도데실 황산염</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4509</td><td></td></tr><tr><td>SYPRO&amp;#174; Ruby 단백질 겔 염색</td><td>시약</td><td>Bio-Rad</td><td>170-3125</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N&amp;rsquo;,N&amp;rsquo;-테트라메틸에틸렌디아민 (TEMED)</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>트립신</td><td>시약</td><td>Promega Corp.</td><td>V5111</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5927</td><td></td></tr><tr><td>물</td><td>시약</td><td>버딕(Burdick) &amp;및 Jackson</td><td>365-4</td><td></td></tr><tr><td>LTQ-Orbitrap 탠덤 질량 분석기</td><td>도구</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>나노 액체 크로마토그래피 시스템</td><td>도구</td><td>에크시전트(Eksigent)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>B-Mercaptoethanol&amp;#8211;에탄올</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td></td><td>EMD Millipore</td><td>GX0185-6</td><td></td></tr></tbody></table>

p2x2 리간드 - 게이 티드 양이온 채널과 상호 작용하는 단백질을 확인하는 proteomics

Proteomics to Identify Proteins Interacting with P2X2 Ligand-Gated Cation Channels

리간드 - 게이 티드 이온 채널은 신경계 1 시냅스 커뮤니케이 션을 기초. 포유 동물에서 리간드 - 문이 채널의 세 가족이 있습니다 cys 루프, 글루 탐 산염 - 게이 티드과 P2X 수용체 채널 2. 각각의 경우에 송신기의 바인딩은 이온들이 전기 그라디언트를 흘러이를 통해 기공의 개통에 이르게한다. 많은 리간드 - 문이 채널은 또한 하류 채널 개방 시간을 초과할 수 있습니다 역할 5 (예 : 유전자 규정)을 신호가 칼슘 이온 3, 4에 투과 수 있습니다. 따라서 리간드 - 문이 채널 몇 밀리초에서 일에 이르기까지 광범위한 시간 단위 이상의 신호 수 있습니다. 그것이 자신이 단백질에 의해 규제하는 방법 리간드 - 게이 티드 이온 채널을 이해하기 위해 필요하며, 어떻게 이러한 단백질이 중요한 역할을 감안할 때하면 신호를 조정할 수 있습니다. 최근 연구 많은 경우 전부는 아니 채널이 단백질 신호 단지 6 일부가 될 수있다하는 것이 좋습니다. 이 문서에서 우리는 P2X2 수용체 cytosolic 도메인의 C - 말단 부분에 바인딩 단백질을 식별하는 방법에 대해 설명합니다. P2X 수용체는 ATP - 게이 티드 양이온 채널이 일곱 subunits (P2X1 - P2X7)로 이루어져 있습니다. P2X 수용체 널리들이 흥분성의 시냅스 전송 및 신경 전달 물질 릴리스 7 presynaptic 촉진을 중재 두뇌에 표현됩니다. P2X 수용체는 고르기가 아닌 고르기 세포에서 발견의 연결 신호, 염증과 심장 혈관 기능 8 키 역할을 중재하고 있습니다. P2X2 수용체는 신경계 9 풍부하고 본 연구의 초점입니다. 각 P2X의 subunit는 세포외 지역 7 세포내 N과 C 테르 (그림 1A) 7로 구분이 멤브레인 스패닝 세그먼트를 (TM1 &amp; TM2) 소유로 생각됩니다. P2X의 subunits 10 (P2X1 - P2X7)는 아미노산 수준 11시 30~50% 시퀀스 상동을 보여줍니다. P2X 수용체가 ionotropic 수용체 중에서 가장 단순한 stoichiometry는 단지 세 subunits를 포함합니다. P2X2의 C - 말단 120 아미노산 (그림의 1B)로 구성되어 있으며, P2X2 수용체는 신호 단지의 일부가 될 수있는 가설을 지원하는 여러 단백질 도킹 합의 사이트가 포함됩니다. 몇 가지 기능이 P2X2 수용체 9 C - 말단에 기인하고 있지만 그러나, 연구는 분자 파트너 설명도 없어 그 전체 길이 C - 말단을 통해이 단백질의 세포 내쪽으로 몇 가지. 이 방법은 종이에 우리는 전체 길이 P2X2 수용체의 C - 말단과 상호 작용하는 단백질을 식별할 수있는 proteomic 방법을 설명합니다.

우리는 ATP - 문이 P2X2 수용체의 전체 길이 C 터미 너스에 바인딩 뇌 단백질을 식별하는 간단한 프로토콜을 설명합니다. 모든 P2X 수용체에 대한 확장 및이 방법의 체계적인 응용 프로그램은 P2X 수용체 신호의 더 나은 이해로 이어질 것으로 예상된다.

P2X2 리간드 - 게이 티드 양이온 채널과 상호 작용하는 단백질을 확인하는 Proteomics

리간드 개폐 이온 통로는 신경계의 시냅스 통신을 담당합니다1. 포유류에는 세 가지 가족의 리간드 개폐 통로가 있습니다: cys ...

이 절차는 세균 용해 후 GST 융합 단백질로 설계된 P2X receptor 또는 P2X2의 재조합 C 말단을 과발현시키는 것으로 시작합니다. 정제된 단백질을 glutathione sepharose 4B 비드와 함께 배양하고, Bradford법을 사용하여 농도를 측정합니다. 다음으로, 정제된 쥐 뇌 용해물 유래 단백질을 glutathione sepharose 비드에 결합된 P2X2 수용체의 C 말단과 함께 배양하며, SDS-PAGE 겔 전기영동 및 절단을 통해 P2X2 수용체의 C 말단에 결합된 단백질 복합체를 분리한 후 질량 분석법으로 확인합니다.안녕하세요, 저는 캘리포니아 대학교 로스앤젤레스(UCLA) 생리학과 JIT K 연구실의 Harpring입니다. 안녕하세요, 저는 캘리포니아 대학교 로스앤젤레스(UCLA) 마취과학과 Tom Vka 연구실의 Sarah Walburn입니다. 오늘은 P2X2 수용체의 CTS를 분리 및 정제하는 과정을 보여드리겠습니다.우리는 이 단백질들을 사용하여 적색 뇌의 내부를 식별하며, 저희 실험실에서는 이 단백질들을 이용해 P2X2 수용체에 미치는 기능적 결과에 대해 연구합니다. 그럼 시작해 보겠습니다. P2X2 수용체의 세포질 도메인은 N-말단과 C-말단으로 구성됩니다.P2X2 수용체의 C 말단을 풀다운 분석(pull down assay)의 베이트(bait)로 사용하며, 이는 본 상호작용 연구에 사용된 P2X2 수용체 C 말단의 서열로도 표시됩니다. P2X2 수용체의 전체 길이 C 말단을 발현시키기 위해, 일반적인 분자 생물학적 기법을 사용하여 수용체 C 말단의 코팅 서열인 353번부터 472번 잔기를 pGEX-4T-1 플라스미드에 삽입하십시오.그런 다음 재조합 플라스미드를 발현을 위해 e coli strain BBL 21에 형질전환시킵니다. 재조합 플라스미드를 포함하는 박테리아를 37 °C의 LB 배지에서 배양합니다. 배양액의 600 nm에서의 광학 밀도가 0.6에서 0.8 사이가 되면.1 mM IPTG로 배양물을 유도하고 37 °C에서 3시간 동안 배양합니다. 3시간의 배양이 끝나면, 배양물에서 1 mL 분액을 취하여 추후 분석을 위해 보관합니다. 남은 배양물을 4 °C에서 5,000 ×g로 15분간 원심분리한 후, 상층액을 제거하고 펠릿을 20 mL의 saline tris EDTA 완충액에 재부유시킵니다. 재부유된 펠릿을 50 mL falcon 튜브로 옮깁니다.이제 현탁액을 5

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

세포 투과 crosslinker DSP [dithiobis - (succinimidyl 프로피 온산)] 일시적 안정화와 불안 정한 상호...

불안 정한 다중 단백질 단지의 분리에 의해 생체내에 제어 세포 간 연결 및 단백질 자기 동질 크로마 토그래피

생화학 적 방법은 막 단백질의 생체 내 단백질 - 단백질 상호 작용 (PPI)를 식별하기 위해 설명된다. 이 방법은 단백질 교차 결합, 친화력 정화 및 질량 분석을 결합하여 거의 모든 세포 유형이나 유기체에 적응할 수있다. 이 방법을 과도 프로톤 펌프 억제제의도 식별이 가능하게된다.

막 척추 : 막 단백질의 단백질 - 단백질 상호 작용을 식별 할 수있는 생화학 적 도구 생체

광학적 바이오 센서 기술은 살아있는 세포에서 세포막 근처 질량의 변화를 감지 한 개별 세포와 세포 집단 모두에서 세포 반응을 수행 할 수있다. 이 프로토콜은 이러한 접근법을 사용하여 그대로 세포에서 G-단백질 결합 수용체에 의해 칼륨 채널의 변조의 검출에 대해서 설명한다.

G-단백질 결합 수용체에 의해 칼륨 채널의 변조를 감지하기 위해 라벨이없는 광 바이오 센서의 사용

단백질은 서로 상호 작용하며 이러한 상호 작용은 단백질의 기능을 대부분 결정합니다. 단백질 상호 작용 파트너는 디하이드로폴레이트 환원효소 단백질-단편 보완 분석법(DHFR-PCA)을 기반으로 하는 효모 적합성 분석을 사용하여 생체 내에서 고처리량으로 식별할 수 있습니다.

살아있는 세포의 단백질 조각 보완 분석 (PCA)에 의해 게놈 전체 단백질 - 단백질 상호 작용 상영

설명된 세포 분석 결과 CXC chemokine 수용 체 4 (CXCR4)의 식별을 위해 설계 되었습니다-상호 작용 하거나 에이전트는 억제 자극, 경쟁적으로 또는 allosterically, 세포내 캘리포니아2 + 릴리스 CXCR4 활성화에 의해 시작.

운동 형광 기반 Ca2 + 동원 분석 결과 G 단백질 결합 된 수용 체 주 작동 근, 길 항 근, 그리고 Allosteric 변조기를 식별 하

여기, 우리는 높은 처리량 프로토콜 화면 extracellular 단백질 microarrays 소설 수용 체 ligand 상호 작용의 식별을 제시. 우리는 또한 단백질 microbead 복합물을 사용 하 여 일시적인 단백질-단백질 상호 작용의 탐지를 강화 하는 방법을 설명 합니다.

세포 외 단백질 Microarray 기술은 낮은 친 화력 수용 체 Ligand 상호 작용의 높은 처리량 검색

단일 셀 감도 제공, 실시간 cytometry은 유일 하 게 라이브 문화의 복합 수용 체 기능을 계량 적합 합니다. 성숙한 신경 조상 세포를 사용 하 여, P2X7 수용 체 기능 칼슘 유입 칼슘 표시기 염료, ethidium 평범한 사람 통풍 관, 그리고 형광 라텍스 비즈를 사용 하 여 식 균 작용에 의해 막 횡단 기 공 형성에 의해 감지를 통해 평가 했다.

칼슘 유입, 기 공 형성 및 성숙한 신경 조상 세포 수용 체 P2X7에 의해 식 균 작용을 조사 하기 위해 실시간 라이브 셀 Cytometry

이 프로토콜은 세포 환경에서 실시간으로 수용체에 대한 아데닌 뉴클레오티드 결합을 측정하는 방법을 제시합니다. 결합은 트리니트로페닐 뉴클레오티드 유도체와 비표준 형광 아미노산으로 표지된 단백질 사이의 Förster 공명 에너지 전달(FRET)로 측정됩니다.

온전한 기능성 막 단백질에 대한 뉴클레오티드 결합을 실시간으로 측정

MRGPRX2 수용체를 통해 비만 세포를 활성화할 수 있는 짧은 펩티드 라이브러리를 생성하기 위한 기술이 기재되어 있다. 관련 기술은 쉽고 저렴하며 다른 세포 수용체로 확장 될 수 있습니다.

엔지니어링 된 HEK 세포를 사용하여 MRGPRX2를 활성화하는 펩티드 스크리닝

여기에서는 화학 프로브 및 질량 분석법을 사용하여 천연 세포 및 조직에서 질병 특이적 단백질-단백질 상호 작용을 포착하고 식별할 수 있는 프로토콜을 제시합니다. 결과 상호 작용 데이터 세트는 전용 웹 기반 플랫폼을 통해 분석되어 질병과 관련된 동적 네트워크 기능 장애 및 경로 변경을 밝힙니다.

질병에서 기능 장애 단백질-단백질 상호 작용 매핑

직접 lncRNA-단백질 상호작용을 식별하는 자외선 기반 ChIRP 방법.

LncRNA와 직접 상호작용하는 단백질을 검증 가능한 확인을 위한 자외선 기반 ChIRP 방법 - 배양된 세포부터 마우스 고환까지"

배우세요 P2X2 수용체 C말단과 상호작용하는 뇌 단백질을 GST 풀다운 및 질량분석법으로 식별하는 프로토콜입니다. 이 방법은 P2X 수용체 신호전달 메커니즘 연구에 활용됩니다.

P2X2 리간드 - 게이 티드 양이온 채널과 상호 작용하는 단백질을 확인하는 Proteomics

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