Name: P2X2 리간드 - 게이 티드 양이온 채널과 상호 작용하는 단백질을 확인하는 Proteomics (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-18T23:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 36 s
Description: 배우세요 P2X2 수용체 C말단과 상호작용하는 뇌 단백질을 GST 풀다운 및 질량분석법으로 식별하는 프로토콜입니다. 이 방법은 P2X 수용체 신호전달 메커니즘 연구에 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

SW와 TMV는 국립 보건원에서 NCRR 및 NHLBI 지원합니다. BSK와 HS은 국립 보건원의 NINDS와 NIGMS에 의해 지원됩니다.

실험 절차 실험 절차 (그림 2) 아래 단계 현명한 방식으로 설명하는 네 부분으로 구성되어 있습니다. 1 부 : P2X2 수용체의 C - 말단의 Subcloning, 그리고 표현. 우리는 바인딩하는 뇌 단백질을 식별하는 전체 길이 박테리아 P2X2 수용체의 C - 말단을 표명했습니다. <ol><li> P2X2 수용체 (그림 1)의 C ​​- 말단은 (잔류물 353-472) pGEX 4NT1 (GE 생명 과학)로 복제 및 시퀀싱과 검증, PCR에 의해 증폭되었다. </li><li> 재조합 플라스미드가 E.으로 변화되었다 재조합 단백질의 표현에 대한 대장균 (BL21). </li><li> 플라스미드 P2X2 CT - GST를 포함하는 박테리아 (E. 대장균 BL21)의 글리세롤 주식은 멸균 피펫 팁과 스크랩한 적합 선택적 마커 (50 G / ML 암피실린)와 함께 Luria - Bertani (LB) 미디어 5 ML에 주사했다 37C에서 궤도 통에 하룻밤 incubated. </li><li> 600 nm의에서 광학 밀도가 도착할 때까지 밤새 재배 문화는 적절한 항생제 (50 μg / ML 암피실린)와 LB 미디어 250 ML에 주사하여 37C에서 2-3 시간 250 rpm으로 궤도 통에 incubated되었습니다 ~ 0.6-0.7. </li><li> 문화 IPTG의 1 ㎜로 유도 나아가 단백질 표현을위한 3 시간을 위해 37C에 incubated했다. </li><li> 문화 다음 4C (문화의 1ml이 표현 수준을 분석 저장하고 &#39;유도&#39;로 표시했습니다) 15 분 5천그램에 소용되었다. 뜨는은 폐기되었으며 펠렛은 살린 트리스 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (인트) 버퍼 (10 MM 트리스 - HCL, 150 MM NaCl, EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 1 ㎜의 산도 8.0) 20 ML에 resuspended되었습니다. </li><li> 정지 50 ML 팔콘 튜브에서 15 분 5,000g에 소용되었다. 뜨는은 폐기되었으며 세미 드라이 펠렛은에 - 70C가 하룻밤 냉동했다. </li><li> - 70C 펠렛은 얼음 차가운 용해 완충액 (2 % (W / V) sarkosyl 15 MG 라이 소 자임, 150 MM NaCl, 트리스 pH7.5 50 MM, 5 MM의 DTT 완벽한 테아제 억제제 정제) 40 ML에 resuspended되었습니다 그리고 정지 30 분 얼음 incubated되었습니다. 이 부화하는 동안, 3 ML 글루타티온 - 세파 로스 4B 비즈는 인산 버퍼 살린 (PBS)과 PBS 다음 20 ML T - PBS (0.1 % (V / V) PBS에서 tritonX - 100) 20 ML로 세탁했다. 비즈는 1 ML PBS에서 resuspended되었습니다. </li><li> 세균 현탁액 액체 질소에 3 번 동결 - 해동 및 sonicated (1S ON / OFF, 얼음 3 분 30 마이크론)와 추가 4퍼센트 30 분 (V / V) 트리톤 X - 100, 10 MM MgSO에 대한 incubated되었습니다 4 얼음 2 MM ATP. </li><li> lysate는 (펠렛 1 뜨는의 ML cytosol과 세포막에있는 단백질의 양을 테스트 SDS 페이지에 저장된에서 샘플) 삭제되었습니다 4C 및 펠릿 15 분 2만그램에 소용되었다. 뜨는은 1 시간 (또는 야간) 4C에 대한 주판으로 incubated했다. </li><li> 구슬은 5 분 500g에 늘인되었으며 뜨는가 (예제는 언바운드 분율 저장되었습니다) 삭제되었습니다. 구슬은 T - PBS 다섯 번 (세척은 세척 컨트롤에 대한 저장된)로 세탁했다. </li><li> 구슬 그런 다음 50 % (W / V에게) 슬러리를 제공하기 위해 PBS에 resuspended 및 사용까지 4C에 냉장고에 저장되었습니다. 단백질 농도는 브래드 분석 (제조 업체의 지침에 따라)에 의해 추정되었다. </li></ol> 2 부 : 전체 두뇌 lysates의 준비 P2X2 수용체가 다량으로 뇌 8 표현하는 것으로 알려져 있습니다. 현재 분석에서 우리는 쥐의 뇌 전체 lysates (그림 3)에서 P2X2 수용체와 상호 작용하는 단백질을 식별하는 모색. <ol><li> 성인 쥐 두뇌는 수확 (동물 UCLA IAACUC 승인 프로토콜에 따라과 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 NIH 가이드에 따라 희생되었다)와 즉시 얼음 차가운 PBS (3 배)을 씻어서했습니다. </li><li> 10 ML (수확 뇌의 ~ 5 배 젖은 무게) 150 MM를 포함하는 얼음 차가운 용해 버퍼의 NaCl, 50 MM 트리스 - HCL, pH를 7.4, 10 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 1 MM EGTA, 1 MM NaF, 1 ㎜ 셀을 lyse하기 나 3 할머니 4, 1 ㎜ PMSF, 5 류펩틴의 μg / ML, 1 % (V / V) NP - 40, 그리고 프로 테아제 억제제 칵테일의 정제는 수확 두뇌에 추가되었습니다. </li><li> 균질 일관성의 혼합물이 달성되기 전까지는 뇌 조직은 유리 다운스의 균 질기와 얼음 homogenised되었습니다. </li><li> 세포 lysate은 깨지지 세포를 제거하는 5 분 2,000그램에 소용되었다. 뜨는은 그대로 organelles 및 멤브레인 집계를 제거하는 60 분 2만9천g에서 다시 수집 소용되었다. </li><li> 즉시 원심 분리 후 뜨는은 깨끗한 튜브로 이송되었다. 전체 뇌 lysate의 단백질 농도는 브래드 포드 분석에 의해 측정되었다 (보통 ~ 15 MG / ML). </li><li> lysate는 aliquoted과에서 - 70C 저장되었습니다. </li></ol> 파트 3 : P2X2 C - 꼬리 관련 단백질의 분리 전체 뇌 lysates에서 P2X2 CT - GST의 바인딩 파트너를 식별하려면 분석 아래로 끌어가 CT - G를 사용하여 수행되었습니다ST 미끼로 글루타티온 세파 로스 4B 비즈를 고정. 컨트롤, 구슬로 바운드 혼자 GST를 사용했습니다. <ol><li> 브레인 lysate는 4C에서 1 시간에 대한 GST 비즈와 precleared했다. 펠렛은 폐기되었으며 뜨는은 추가 분석을 위해 사용되었다. </li><li> GST와 P2X2 글루타티온 세파 로스 4 B 비즈에 바운드 CT - GST (10 μg)의 동등한 양의 용해 버퍼에 4C에서 회전, 쥐의 뇌 전체 lysate에서 precleared solubilised 단백질 100g과 함께 하룻밤 incubated되었습니다. </li><li> 비즈 5 분 1천g에 늘인되었으며 뜨는가 삭제되었습니다. </li><li> 구슬은 용해 버퍼와 한번 세탁하고 수정 Laemli 버퍼에 삶은되었습니다 [4 % (W / V) SDS, 10 % (V / V) 2 - 메르 캅 토 에탄올, 2 % (V / V) 글리세롤, 0.004 % (W / V) bromophenol 청색과 0.125 M TrisCl 산도 6.8] 5 분. </li><li> 샘플은 5 분와 10 % SDS - PAGE (그림 4)로 구분하여 뜨는 위해 5,0​​00그램에 소용되었다. 젤은 SYPRO 루비 단백질 얼룩 젤 (제조 업체의 지시에 따라)과 자외선을 시각 물들일되었습니다. P2X2 CT - 관련 단백질은 미끼로 GST - NULL을 사용하여 복구 사람과 비교했다. 네 생물 학적는 (4 머리과 네 개의 독립적인 끌어 오기 때로는 IE) 수행되었습니다 복제합니다. </li></ol> 4 부 : 단백질의 식별. 겔 전기 영동에 의해 분리된 단백질은 젤에서 excised 및 질량 분석법 12 확인되었습니다 참고 :. 프로세스 전반에 걸쳐 먼지의 부재는 각질 오염을 줄이기 위해 중요합니다. 실험자는 항상, 헤어 네트와 장갑을 얼굴 마스크를 착용하고 장갑을 사용하지 않고 관심의 겔 영역을 터치하지 않습니다. <ol><li> 아래 P2X2 당겨에서 발견한 모든 보이는 단백질 밴드는 깨끗한 면도날로 excised하고 (그림 4) 절단되었습니다. GST - NULL에 젤의 해당 영역 레인 풀다운도의 수준 아래의 단백질의 존재를 확보하기 위해 밴드 얼룩 (GST - NULL 미끼 특정 밴드도 excised 및 식별되었다)에 관계없이 동일한 방식으로 excised되었습니다 얼룩의 감도는보고되지 않았습니다. </li><li> 겔 조각은 200 50 % 50 MM의 탄산수 소 암모늄의 μl (V / V) acetonitrile (ACN)과 RT 15 분 vortexed 튜브 incubated되었습니다. 이 세척 단계를 반복합니다. </li><li> 겔 조각 200 μl acetonitrile (겔 조각이 수축 및 색상의 불투명 될한다)를 추가하여 탈수 있었다. </li><li> Acetontrile 제거하고 젤 조각 ~ 10 분 speedvac에서 건조되었다. </li><li> 겔 조각 그런 다음 조각을 담가에 신선한 10 MM MM DTT/10 트리스 (2 - 카르복시 - 에틸) 충분한 볼륨의 phosphine 하이드로 클로라이드 (TCEP) 30 μl와 incubated했다. 이것은 56C 물을 욕조에 30 분 남았는데. </li><li> 다음 DTT 솔루션 100 μl 500 50 % acetonitrile 솔루션 MM의 탄산수 소 암모늄 및 ammounium의 중탄산염로 씻은 겔 슬라이스로 대체되었습니다. </li><li> 세탁 솔루션은 aspirated과 acetonitrile 200 μl가 젤을 탈수에 추가되었습니다. </li><li> Acetonitrile 그런 다음 제거 100 μl 신선한 100 MM의 iodoacetamide 솔루션 무료 sulfhydryls을 alkylate에 추가되었습니다. 이 단계는 어둠 속에서 실온에서 25 분 진행. </li><li> Iodoacetamide 솔루션은 제거하고 vortexing하면서 겔 조각은 2 분 50 % acetontrile (산도 8.0) 50 MM의 탄산수 소 암모늄 200 μl로 세탁했다. 이 세척 단계가 반복되었다. </li><li> 세척 용액을 제거한 후 겔 조각 그러면 ~ 10 분 대한 speedvac에 의해 제거되었습니다 200 μl acetonitrile와 incubated했다. </li><li> 이 단계에서는 겔 조각은 트립신의 소화를 위해 준비가되어 있습니다. 젤 조각은 30 μl 트립신 용액 (20 μL / NG 작업 농도)에 incubated 잘 부푼 수 젤류 10 분 얼음에 배치했다. 초과 트립신은 제거하고 그들은 37C에서 12~16시간 위해 진행하는 허용했다 소화에 걸쳐 포장되어 보관 50 MM의 탄산수 소 암모늄 30 μl와 중첩 겔 입자를 rehydrated했다. </li><li> 5 % 다섯 μl (V / V) 개미의 산성은 트립신과 체포 소화를 비활성화에 추가됩니다. </li><li> 튜브는 ~ 15 분 vortexed 후 깨끗하고 표시 0.5 ML의 약병으로 전달했던 튜브의 바닥에 액체를 가지고 간단히 centrifuged했다. </li><li> 그들은 단지 간단한 원심 분리로 구분하여, 10-15 분 두 vortexing 다음 적용 너무나도 50 % acetonitrile에 0.1 %의 향후 30 μl (V / V) 개미의 산성은 겔 조각에 추가되었습니다. 이 단계는 단계 사이의 산성 - acetonitrile 개미의 교체, 한 번 반복했다. </li><li> 최종 액체는 하나의 약병에 제거하고 모든 추출 솔루션을 결합했다. 이 볼륨은 speedvac에서 ~ 30 UL로 축소되었다. 샘플은 현재 대량 분석법에 의해 반대로 위상 나노 액체 크로마 토그래피 및 단백질 식별을 위해 준비했습니다. 이 특정 예제에서,이 단계는 ThermoF에서 Orbi - 트랩 탠덤 질량 분석기에서 수행됩니다다른 모델 및 제조 업체의 악기가 쉽게이 시점에 설명된 방식으로 결합 수 있지만 isher (높은 질량 정확성, 단백질 검출을위한 빠른 듀티 사이클 일반적으로 강력한 운영 기능 선택). </li><li> 대량 spectrometric 분석에 대한 자세한 내용 및 기준은 이제 간단히 소개하는 부분이있다. 모든 펩티드는 반대 위상 나노 LC (Eksigent)와 펩티드가 3 μl / 분 유량에서 C18 리버스 위상 칼럼에 로드된되었다로 구분되었다. 모바일 위상 0.1 % 개미 산성과 물에 2 % ACN했습니다, 모바일 위상 B는 0.1 % 개미 산성과 ACN 20 %의 물이되었다. 펩티드는 220 NL / 분 5 분 이상 95 % B로 다음 90 분 이상 50 % B로 5 % B에서 선형 그라디언트를 사용 유량에있는 기둥에서 eluted, 그리고 마지막 5 분 지속적인 95 % B를 유지했다 . 스펙트럼은 MS / MS 검사에 대한 MS의 검색 및 LTQ 사용되는 Orbi - 트랩과 함께 데이터 종속 모드로 인수되었습니다. 펩티드는 Bioworks 소프트웨어 패키지에 통합된 SEQUEST 알고리즘을 사용하여 쥐의 IPI 데이터베이스 v.3.53에 대한 스펙트럼을 검색하여 확인되었다. 각 펩티드는 다음 기준을 충족 : XCorr ≥ 2 (+1), ≥ 3 (+2), ≥ 4 (3), 그리고 DeltaCN&gt; 0.1. 단백질 식별에 사용되는 모든 스펙트럼은 수동 검사 및 채 2 펩티드가 확인되었을 때 어떤 단백질 허용되지 않았습니다. 단 단백질은 GST - NULL 끌어 오기 다운즈 동안 네 개의 P2X2 끌어 오기 양지 각각 결석 다음 현재는 추가 분석을 위해 고려되었다. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1178/1178fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. P2X2 수용체의 subunit의 도식 표현. A.이 만화는 P2X2 수용체의 subunit의 토폴로지를 보여줍니다. cytosolic 도메인 N과 C 테르 미니 (Termini)로 구성되어 있습니다. P2X2 수용체 (적색)의 C - 말단은 분석 풀다운을위한 미끼로 사용되었습니다. 본 연구에서 사용되는 P2X2 수용체의 C - 말단의 B. 아미노산 서열은. <img src="/files/ftp_upload/1178/1178fig2.jpg" alt="" /> 그림 2. 플로우 차트와 표현에 사용되는 프로토콜의 시간 라인, 정화는 풀다운 및 단백질의 식별. 우리는 시간 라인 프로토콜의 개요를 보여줍니다. 성인 쥐 두뇌 lysate은 즉시 assays 풀다운을 위해 사용하기 전에 신선 준비했습니다. <img src="/files/ftp_upload/1178/1178fig3.jpg" alt="" /> 그림 3. 쥐의 두뇌에 P2X2 C - 터미 너스 네트워크의 이진 proteomic 분석의 도식 표현. GST 비즈에 바운드 GST 단백질과 융합 P2X2 수용체의 C - 말단은 assays 풀다운을 위해 사용되었다. 브레인 lysate 준비되었고 단백질은 재조합 단백질 고정화와 incubated했다. 언바운드 분율은 용해 버퍼로 세탁했다. 단백질은 질량 분광법으로 확인되었습니다. <img src="/files/ftp_upload/1178/Fig%204%20Singh%20et%20al.jpg" alt="" /> 그림 4. P2X2 수용체의 C - 말단의 바인딩 파트너의 식별. GST (파란색 상자)와 융합 수용체의 C - 말단과 상호 작용하는 단백질 putative의 스펙트럼을 보여주는 Sypro 스테인드 젤. 혼자 혼자 GST (노란색 상자)과 글루타티온 세파 로스 비즈에 대한 컨트롤 차선도 표시됩니다. 화살표 대량 분석법에 의해 더 분석을위한 excised되었습니다 독특한 밴드의 예를 나타냅니다.

<ol><li>Hille, B. Ion channels of excitable membranes. , 3rd edition, Sinauer Associates Inc. Sunderland Massachusetts, USA. (2001).</li>
<li>Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+physiology+of+P2X+receptors+and+ATP+signalling+at+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Molecular physiology of P2X receptors and ATP signalling at synapses.</a> Nat Rev Neurosci. 2, 165-174 (2001).</li>
<li>Egan, T. M., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+calcium+ions+to+P2X+channel+responses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Contribution of calcium ions to P2X channel responses.</a> J Neurosci. 24, 3413-3420 (2004).</li>
<li>Burnashev, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+permeability+of+ligand-gated+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Calcium permeability of ligand-gated channels.</a> Cell Calcium. 24, 325-332 (1998).</li>
<li>Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Calcium signaling.</a> Cell. 131, 1047-1058 (2007).</li>
<li>Levitan, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+protein+complexes+associated+with+neuronal+ion+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Signaling protein complexes associated with neuronal ion channels.</a> Nat Neurosci. 9, 305-310 (2006).</li>
<li>Khakh, B. S., North, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P2X+receptors+as+cell-surface+ATP+sensors+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">P2X receptors as cell-surface ATP sensors in health and disease.</a> Nature. 442, 527-532 (2006).</li>
<li>Roger, S., Pelegrin, P., Surprenant, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facilitation+of+P2X7+receptor+currents+and+membrane+blebbing+via+constitutive+and+dynamic+calmodulin+binding%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Facilitation of P2X7 receptor currents and membrane blebbing via constitutive and dynamic calmodulin binding.</a> J Neurosci. 28, 6393-6401 (2008).</li>
<li>North, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+physiology+of+P2X+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Molecular physiology of P2X receptors.</a> Physiol Rev. 82, 1013-1067 (2002).</li>
<li>Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((International+union+of+pharmacology.+XXIV.+Current+status+of+the+nomenclature+and+properties+of+P2X+receptors+and+their+subunits.%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Rev%22%5BJournal%5D)">International union of pharmacology. XXIV. Current status of the nomenclature and properties of P2X receptors and their subunits.</a> Pharmacol Rev. 53, 107-118 (2001).</li>
<li>Young, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+shape%2C+architecture+and+size+of+P2X4+receptors+determined+using+fluorescence+resonance+energy+transfer+and+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Molecular shape, architecture and size of P2X4 receptors determined using fluorescence resonance energy transfer and electron microscopy.</a> J Biol Chem. 283, 26241-26251 (2008).</li>
<li>Edmondson, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinase+C+epsilon+signaling+complexes+include+metabolism-+and+transcription%2Ftranslation-related+proteins%3A+complimentary+separation+techniques+with+LC%2FMS%2FMS%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Protein kinase C epsilon signaling complexes include metabolism- and transcription/translation-related proteins: complimentary separation techniques with LC/MS/MS.</a> Mol Cell Proteomics. 1, 421-433 (2002).</li>
<li>Evans, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthosteric+and+allosteric+binding+sites+of+P2X+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Orthosteric and allosteric binding sites of P2X receptors.</a> Eur Biophys J. 38, 319-327 (2009).</li>
</ol>

이온 채널은 필수적인 멤브레인 단백질의 주요 클래스입니다. 그들은 선택적으로 플라즈마 막 걸쳐 자신의 전기 그라디언트 아래 이온의 움직임을 허용 물이 가득 모공이 포함되어 있습니다. 개방과 폐쇄 상태 사이의 이온 채널 게이트. 게이팅 단계 P2X의 리간드 게이 티드 이온 채널의 경우에는 송신기 (예 : ATP)에 의해 트리거됩니다, 또는 그것은 다른 단백질과 상호 작용에 의해 규제 수 있습니다. 지난 10 년간은 P2X 수용체가 ATP 13 바인딩하는 방법에 대한 우리의 이해의 증가를 목격하고 있지만 P2X 기능 조절에 보조 단백질의 역할은 덜 잘 이해 남아있다. 이 프로토콜에 설명된 접근 방식은 (첫 단계) C - 말단 세포와 상호 작용하는 단백질을 검사하여 P2X2 수용체에 의해 형성 신호 단지를 식별하도록 설계되었습니다. P2X2 수용체 신호 단지의 전체지도는 이러한 매혹적인 채널의 pathophysiology에 많이 필요한 통찰력을 제공할 것입니다.

<table><tbody><tr><td>아세토니트릴</td><td>시약</td><td>JT Baker</td><td>9829-02</td><td></td></tr><tr><td>아크릴아마이드</td><td>시약</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0156</td><td></td></tr><tr><td>암피실린</td><td>시약</td><td>VWR international</td><td>VW1507-01</td><td></td></tr><tr><td>탄산수소암모늄</td><td>시약</td><td>Fluka</td><td>09830</td><td></td></tr><tr><td>과황산암모늄 (APS)</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>아데노신 삼인산 (ATP)</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7699</td><td></td></tr><tr><td>브래드포드 시약</td><td>시약</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0006</td><td></td></tr><tr><td>브로모페놀 블루</td><td>시약</td><td>Fisher Scientific</td><td>B-392</td><td></td></tr><tr><td>코마시 블루 R-250</td><td>시약</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>Sc-24972</td><td></td></tr><tr><td>디티오트레이톨 (DTT)</td><td>시약</td><td>EMD Millipore</td><td>3860</td><td></td></tr><tr><td>에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA)</td><td>시약</td><td>VWR international</td><td>VW1474-01</td><td></td></tr><tr><td>에틸렌글리콜 tetraacetic acid (EGTA)</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E8145</td><td></td></tr><tr><td>개미산</td><td>시약</td><td>EMD Millipore</td><td>11670-1</td><td></td></tr><tr><td>Glutathione Sepharose 4B 비드</td><td>시약</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5132-01</td><td></td></tr><tr><td>염산 (HCl)</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>이소프로필-베타-D-티오갈락토피라노사이드 (IPTG)</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>15502</td><td></td></tr><tr><td>이오도아세트아미드</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I1149</td><td></td></tr><tr><td>루리아-버타니(Luria-Bertani, LB) 배지</td><td>시약</td><td>EMD Millipore</td><td>1.00547.5007</td><td></td></tr><tr><td>류펩틴</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L8511</td><td></td></tr><tr><td>라이소자임</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>62971</td><td></td></tr><tr><td>황산마그네슘 (MgSO4)&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨 (NaCl)</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>플루오린화 나트륨 (NaF)</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7920</td><td></td></tr><tr><td>오르토바나듐산 나트륨 (Na&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;음성 해설&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6508</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P40</td><td>시약</td><td>Fluka</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>페닐메탄설포닐플루오라이드 (PMSF)</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>프로테아제 억제제 정제</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8820</td><td></td></tr><tr><td>단백질 표준물질 </td><td>시약</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0305</td><td></td></tr><tr><td>사코실(Sarkosyl)</td><td>시약</td><td>Acros Organics</td><td>61207</td><td></td></tr><tr><td>스크류 캡 바이알</td><td>도구</td><td>Agilent Technologies</td><td>5182-0866</td><td></td></tr><tr><td>소듐 도데실 황산염</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4509</td><td></td></tr><tr><td>SYPRO&amp;#174; Ruby 단백질 겔 염색</td><td>시약</td><td>Bio-Rad</td><td>170-3125</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N&amp;rsquo;,N&amp;rsquo;-테트라메틸에틸렌디아민 (TEMED)</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>트립신</td><td>시약</td><td>Promega Corp.</td><td>V5111</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5927</td><td></td></tr><tr><td>물</td><td>시약</td><td>버딕(Burdick) &amp;및 Jackson</td><td>365-4</td><td></td></tr><tr><td>LTQ-Orbitrap 탠덤 질량 분석기</td><td>도구</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>나노 액체 크로마토그래피 시스템</td><td>도구</td><td>에크시전트(Eksigent)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>B-Mercaptoethanol&amp;#8211;에탄올</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td></td><td>EMD Millipore</td><td>GX0185-6</td><td></td></tr></tbody></table>

p2x2 리간드 - 게이 티드 양이온 채널과 상호 작용하는 단백질을 확인하는 proteomics

Proteomics to Identify Proteins Interacting with P2X2 Ligand-Gated Cation Channels

리간드 - 게이 티드 이온 채널은 신경계 1 시냅스 커뮤니케이 션을 기초. 포유 동물에서 리간드 - 문이 채널의 세 가족이 있습니다 cys 루프, 글루 탐 산염 - 게이 티드과 P2X 수용체 채널 2. 각각의 경우에 송신기의 바인딩은 이온들이 전기 그라디언트를 흘러이를 통해 기공의 개통에 이르게한다. 많은 리간드 - 문이 채널은 또한 하류 채널 개방 시간을 초과할 수 있습니다 역할 5 (예 : 유전자 규정)을 신호가 칼슘 이온 3, 4에 투과 수 있습니다. 따라서 리간드 - 문이 채널 몇 밀리초에서 일에 이르기까지 광범위한 시간 단위 이상의 신호 수 있습니다. 그것이 자신이 단백질에 의해 규제하는 방법 리간드 - 게이 티드 이온 채널을 이해하기 위해 필요하며, 어떻게 이러한 단백질이 중요한 역할을 감안할 때하면 신호를 조정할 수 있습니다. 최근 연구 많은 경우 전부는 아니 채널이 단백질 신호 단지 6 일부가 될 수있다하는 것이 좋습니다. 이 문서에서 우리는 P2X2 수용체 cytosolic 도메인의 C - 말단 부분에 바인딩 단백질을 식별하는 방법에 대해 설명합니다. P2X 수용체는 ATP - 게이 티드 양이온 채널이 일곱 subunits (P2X1 - P2X7)로 이루어져 있습니다. P2X 수용체 널리들이 흥분성의 시냅스 전송 및 신경 전달 물질 릴리스 7 presynaptic 촉진을 중재 두뇌에 표현됩니다. P2X 수용체는 고르기가 아닌 고르기 세포에서 발견의 연결 신호, 염증과 심장 혈관 기능 8 키 역할을 중재하고 있습니다. P2X2 수용체는 신경계 9 풍부하고 본 연구의 초점입니다. 각 P2X의 subunit는 세포외 지역 7 세포내 N과 C 테르 (그림 1A) 7로 구분이 멤브레인 스패닝 세그먼트를 (TM1 &amp; TM2) 소유로 생각됩니다. P2X의 subunits 10 (P2X1 - P2X7)는 아미노산 수준 11시 30~50% 시퀀스 상동을 보여줍니다. P2X 수용체가 ionotropic 수용체 중에서 가장 단순한 stoichiometry는 단지 세 subunits를 포함합니다. P2X2의 C - 말단 120 아미노산 (그림의 1B)로 구성되어 있으며, P2X2 수용체는 신호 단지의 일부가 될 수있는 가설을 지원하는 여러 단백질 도킹 합의 사이트가 포함됩니다. 몇 가지 기능이 P2X2 수용체 9 C - 말단에 기인하고 있지만 그러나, 연구는 분자 파트너 설명도 없어 그 전체 길이 C - 말단을 통해이 단백질의 세포 내쪽으로 몇 가지. 이 방법은 종이에 우리는 전체 길이 P2X2 수용체의 C - 말단과 상호 작용하는 단백질을 식별할 수있는 proteomic 방법을 설명합니다.

우리는 ATP - 문이 P2X2 수용체의 전체 길이 C 터미 너스에 바인딩 뇌 단백질을 식별하는 간단한 프로토콜을 설명합니다. 모든 P2X 수용체에 대한 확장 및이 방법의 체계적인 응용 프로그램은 P2X 수용체 신호의 더 나은 이해로 이어질 것으로 예상된다.

P2X2 리간드 - 게이 티드 양이온 채널과 상호 작용하는 단백질을 확인하는 Proteomics

리간드 개폐 이온 통로는 신경계의 시냅스 통신을 담당합니다1. 포유류에는 세 가지 가족의 리간드 개폐 통로가 있습니다: cys ...

이 절차는 세균 용해 후 GST 융합 단백질로 설계된 P2X receptor 또는 P2X2의 재조합 C 말단을 과발현시키는 것으로 시작합니다. 정제된 단백질을 glutathione sepharose 4B 비드와 함께 배양하고, Bradford법을 사용하여 농도를 측정합니다. 다음으로, 정제된 쥐 뇌 용해물 유래 단백질을 glutathione sepharose 비드에 결합된 P2X2 수용체의 C 말단과 함께 배양하며, SDS-PAGE 겔 전기영동 및 절단을 통해 P2X2 수용체의 C 말단에 결합된 단백질 복합체를 분리한 후 질량 분석법으로 확인합니다.안녕하세요, 저는 캘리포니아 대학교 로스앤젤레스(UCLA) 생리학과 JIT K 연구실의 Harpring입니다. 안녕하세요, 저는 캘리포니아 대학교 로스앤젤레스(UCLA) 마취과학과 Tom Vka 연구실의 Sarah Walburn입니다. 오늘은 P2X2 수용체의 CTS를 분리 및 정제하는 과정을 보여드리겠습니다.우리는 이 단백질들을 사용하여 적색 뇌의 내부를 식별하며, 저희 실험실에서는 이 단백질들을 이용해 P2X2 수용체에 미치는 기능적 결과에 대해 연구합니다. 그럼 시작해 보겠습니다. P2X2 수용체의 세포질 도메인은 N-말단과 C-말단으로 구성됩니다.P2X2 수용체의 C 말단을 풀다운 분석(pull down assay)의 베이트(bait)로 사용하며, 이는 본 상호작용 연구에 사용된 P2X2 수용체 C 말단의 서열로도 표시됩니다. P2X2 수용체의 전체 길이 C 말단을 발현시키기 위해, 일반적인 분자 생물학적 기법을 사용하여 수용체 C 말단의 코팅 서열인 353번부터 472번 잔기를 pGEX-4T-1 플라스미드에 삽입하십시오.그런 다음 재조합 플라스미드를 발현을 위해 e coli strain BBL 21에 형질전환시킵니다. 재조합 플라스미드를 포함하는 박테리아를 37 °C의 LB 배지에서 배양합니다. 배양액의 600 nm에서의 광학 밀도가 0.6에서 0.8 사이가 되면.1 mM IPTG로 배양물을 유도하고 37 °C에서 3시간 동안 배양합니다. 3시간의 배양이 끝나면, 배양물에서 1 mL 분액을 취하여 추후 분석을 위해 보관합니다. 남은 배양물을 4 °C에서 5,000 ×g로 15분간 원심분리한 후, 상층액을 제거하고 펠릿을 20 mL의 saline tris EDTA 완충액에 재부유시킵니다. 재부유된 펠릿을 50 mL falcon 튜브로 옮깁니다.이제 현탁액을 5,000 Gs에서 15분 동안 원심분리하여 반건조 펠릿을 수집하고, 이를 -70 °C에서 하룻밤 동안 냉동합니다. 다음 날, 냉동된 펠릿을 40 mL의 얼음처럼 차가운 용해 버퍼(lysis buffer)에 재현탁한 후, 재현탁된 펠릿이 유지되는 동안 30분 동안 얼음에 둡니다. 3 mL의 glutathione sepharose 4B 비드를 준비합니다.먼저 비즈를 20 milliliters의 PBS와 20 milliliters의 TPBS로 세척합니다. 그 다음, 비즈를 순수한 PBS로 세척하고 1 milliliter PBS에 재현탁합니다. 용해 버퍼(lysis buffer)에 들어있는 박테리아 현탁액을 액체 질소에서 동결-해동합니다.냉동 시료를 얼음 위에서 배양하여 해동시킨 후, 다시 액체 질소에 넣어 급속 냉동시켰습니다. 이 단계를 3회 반복하였습니다. 다음으로, 얼음 위에서 동결-해동 현탁액을 초음파 처리합니다.초음파 처리 후, 박테리아 현탁액을 4% Triton X 110, millimolar magnesium sulfate 및 2 millimolar ATP가 포함된 용액과 함께 얼음 위에서 30분 동안 배양합니다. 그다음 용해물을 4°C에서 20,000 Gs로 15분 동안 원심 분리하여 상층액을 회수합니다. 펠릿을 버리기 전에, 세포질과 막의 단백질을 분석하기 위해 상층액이 포함된 펠릿의 소량을 채취합니다.상층액과 비드를 4°C에서 1시간 또는 하룻밤 동안 함께 배양합니다. 배양 후, 비드를 500 Gs에서 5분간 원심 분리합니다. 상층액의 대부분은 버리되, 결합되지 않은 단백질 분율을 확인하기 위해 소량의 샘플을 보관합니다. 펠릿화된 비드를 25 mL의 TPBS로 5회 세척하며, 세척 대조군으로 사용하기 위해 각 세척액의 일부를 보관합니다.마지막으로, 비드와 PBS를 50% w/v 슬러리 상태로 재현탁하여 4 °C에서 보관합니다. 단백질 농도는 제조사의 지침에 따라 Bradford assay를 사용하여 추정할 수 있으며, 500 µg/mL일 것으로 예상됩니다. 전체 뇌 용해물(whole brain lysates)에서 P2X2 CT GST의 결합 파트너를 확인하기 위해, 글루타치온 코팅 비드에 고정된 CT GST를 미끼(bait)로 사용하는 풀다운 분석(pull down assay)을 대조군으로 수행합니다.이후 GST Knoll Rat Brainin 용해물이라 지칭할, 비드에 결합된 GST 단독 시료를 미끼로 사용하십시오. GST 융합 단백질 결합 분석을 위해 표준 프로토콜과 용해 버퍼를 사용하여 시료를 준비하였으며, Bradford 분석을 통해 단백질 농도를 15 mg/mL로 추정하였습니다. 분석을 시작하기 전에.해동된 뇌 용해물을 GST 비즈와 함께 반응시킨 후, 30 µL의 GST 비즈와 함께 4 °C에서 1시간 동안 인큐베이션하여 용해물을 사전 제거(Pre-clear)합니다. 4 °C에서 1000 ×g로 10분 동안 원심 분리하여 비즈를 가라앉힙니다. 상층액을 회수하고, 그중 소량을 대조군으로 보관합니다.이제 전처리(pre-cleared)된 가용화 단백질 100 µg이 포함되어야 하는 용해물(lysate)의 부피를 계산하고, 이 부피의 용해물을 10 µg의 GST 결합 비드 및 10 µg의 P two X two CT GST 결합 비드와 혼합하십시오. 용해 버퍼를 사용하여 최종 부피를 200 µL로 맞춥니다. 용해물과 비드 혼합물을 4 °C의 로테이터에서 하룻밤 동안 배양하십시오.다음 날, 비즈를 1000 Gs에서 5분 동안 원심 분리하여 상층액을 제거합니다. 1 mL의 용해 버퍼(lysis buffer)로 비즈를 3회 세척합니다. 그 후, 수정된 50 µL의 용해 버퍼를 비즈에 첨가하고, 이 버퍼 내에서 비즈를 5분 동안 가열합니다.가열한 시료를 5,000 GS에서 5분 동안 원심 분리하고, 해당 샘플을 10% SDS page 젤에서 전기영동합니다. P two X two CT 관련 단백질을 GST Nola 베이트(bait)를 사용하여 회수한 단백질과 비교합니다. 분석의 마지막 결정적인 단계는 질량 분석법을 통한 식별을 위해 젤에서 분리된 단백질을 추출하는 것입니다.케라틴 오염을 줄이기 위해서는 전 과정 동안 먼지가 없는 환경을 유지하는 것이 매우 중요합니다. 먼저 깨끗한 면도날을 사용하여 젤에서 밴드를 절단하십시오. 그런 다음 밴드를 세 개의 작은 구역으로 잘게 나누고, GST의 젤 영역에 해당하는 라벨이 부착된 마이크로 원심분리 튜브에 각 밴드를 넣으십시오.밴드 염색 여부와 관계없이 풀다운(pull down)을 수행하지 않은 레인 또한 동일한 방식으로 절제해야 합니다. 염색 감도 수준 이하의 단백질이 누락되지 않도록, 겔 조각을 50 mM 암모늄 바이카보네이트(ammonium bicarbonate) 200 µL와 50% v/v 아세토니트릴(acetonitrile)의 혼합액과 섞은 후, 상온에서 15분 동안 튜브를 볼텍싱(vortex)합니다.볼텍싱 후 세척액을 제거하고 이를 반복합니다. 마지막 세척액을 제거하고 200 µL의 acetonitrile을 첨가하여 겔 조각들을 탈수시킵니다. 겔 조각들은 수축하며 색이 불투명해져야 합니다.2분 이내에 아세토니트릴을 제거하고 겔 조각들을 건조합니다. 스피드백(speed vac)을 사용하여 10분간 건조한 후, 겔 조각들을 새로 조제한 10 mM DTT 10 mM TEP 용액에 넣어 배양합니다. 용액의 부피는 통상 약 30 µL이며, 겔 조각들이 충분히 잠길 수 있는 양이어야 합니다.겔 조각들을 56 °C 가열 블록 내의 환원 용액에서 30분 동안 환원시킵니다. 그다음, DTT TEP 용액을 제거하고 이를 100 µL의 500 mM 탄산수소암모늄(50% Acetonitrile 함유) 세척 용액으로 교체한 후 10분 동안 볼텍싱합니다. 볼텍싱 후 탄산수소암모늄 세척액을 흡입하여 제거하고, 겔 조각을 탈수시키기 위해 200 µL의 Acetonitrile로 교체합니다. 겔 조각은 2분 이내에 수축하며 색이 불투명하게 변해야 합니다.알킬화 후, 유리 설프히드릴기를 처리하기 위해 아세토니트릴을 갓 제조한 100 mM iodoacetamide 용액 100 µL로 교체합니다. 이 혼합물을 상온의 암소에서 25분 동안 배양합니다. 배양 후, iodoacetamide 용액을 제거하고 50 mM 중탄산암모늄 및 50% 아세토니트릴 200 µL를 사용하여 5분간 볼텍싱하며 겔 조각을 세척합니다.이 세척 단계를 한 번 더 반복합니다. 마지막 세척액을 제거하고 젤 조각들을 200 µL의 아세토나이트릴에서 10분 동안 배양합니다. 아세토나이트릴을 제거하고 speed vac을 사용하여 샘플을 건조시킵니다.이 단계에서 겔 조각들은 트립신 소화 준비가 완료되었습니다. 약 20 nanograms/µL의 작동 농도인 트립신 용액 30 µL를 처리하고 얼음 위에서 10분 동안 배양합니다.젤 조각이 충분히 팽창해야 합니다. 과량의 trypsin 용액을 제거하고 재수화된 젤 입자를 30 µL의 50 mM 중탄산암모늄(ammonium bicarbonate)에 담급니다. 37 °C에서 12~16시간 동안 소화를 진행시킨 후, 5 µL의 5% formic acid를 가해 trypsin을 비활성화하고 소화를 중단시킵니다.그런 다음 튜브를 15분 동안 볼텍싱하고, 볼텍싱 후 튜브를 짧게 원심분리하여 액체를 튜브 바닥으로 모은 뒤, 소화된 펩타이드가 포함된 이 용액을 라벨이 부착된 깨끗한 0.5 mL 튜브로 옮깁니다. 다음으로 50% acetonitrile에 0.1% formic acid가 포함된 추출 용액 약 30 µL를 겔 조각에 덮고 10~15분 동안 볼텍싱합니다. 이 추출 용액을 새 0.5 mL 튜브에 추가합니다.이 단계를 반복합니다. 추출 용액을 새로운 half mill tube로 옮긴 후, 하룻밤 동안 소화시킨 용액과 두 가지 추출 용액이 들어 있는 half mill tube를 speed vac에서 약 30 µL까지 농축합니다. 이제 이 펩타이드 용액은 LC-MS/MS 분석을 위한 준비가 완료되었습니다.단백질을 C 18 역상 컬럼을 이용한 역상 나노 LC로 분리하고, MS 스캔에는 orbitrap을, MS to MS 스캔에는 LTQ를 사용하는 데이터 의존적 모드로 스펙트럼과 데이터를 획득합니다. Bioworks 소프트웨어 패키지에 통합된 sequester 알고리즘을 사용하여 데이터를 rat IPI 데이터베이스와 대조함으로써 단백질을 식별한 다음, 4개의 샘플 반복 실험 각각에 존재하고 GST에서는 나타나지 않는 단백질의 스펙트럼만 수동으로 검토합니다. 풀다운(pull down)이 수행되지 않은 시료는 추가 분석 대상에서 제외해야 합니다.P2X2 수용체의 C-말단과 상호작용하는 것으로 추정되는 단백질들의 스펙트럼을 보여주는 Cipro 염색 젤입니다. 파란색 상자로 표시된 GST 융합 단백질, 노란색 상자로 표시된 GST 단독 대조군 레인, 그리고 글루타치온 S-전이효소(glutathione S-transferases) 단독 처리 결과가 함께 나타나 있습니다.화살표는 질량 분석법을 이용한 추가 분석을 위해 절단한 고유 밴드의 예를 나타냅니다. 지금까지 P2X2 수용체의 CTO를 발현하고 정제하는 방법을 살펴보았습니다. 또한, 풀다운 분석을 수행하고 단백질 상호작용 인자를 식별하는 방법도 확인하였습니다.본 절차를 수행할 때는 샘플의 케라틴 오염을 줄이기 위해 장갑과 헤어넷을 착용하는 것이 중요하다는 점을 기억하십시오. 이것으로 모든 과정을 마칩니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

proteomics-to-identify-proteins-interacting-with-p2x2-ligand-gated

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

세포 투과 crosslinker DSP [dithiobis - (succinimidyl 프로피 온산)] 일시적 안정화와 불안 정한 상호...

불안 정한 다중 단백질 단지의 분리에 의해 생체내에 제어 세포 간 연결 및 단백질 자기 동질 크로마 토그래피

생화학 적 방법은 막 단백질의 생체 내 단백질 - 단백질 상호 작용 (PPI)를 식별하기 위해 설명된다. 이 방법은 단백질 교차 결합, 친화력 정화 및 질량 분석을 결합하여 거의 모든 세포 유형이나 유기체에 적응할 수있다. 이 방법을 과도 프로톤 펌프 억제제의도 식별이 가능하게된다.

막 척추 : 막 단백질의 단백질 - 단백질 상호 작용을 식별 할 수있는 생화학 적 도구 생체

광학적 바이오 센서 기술은 살아있는 세포에서 세포막 근처 질량의 변화를 감지 한 개별 세포와 세포 집단 모두에서 세포 반응을 수행 할 수있다. 이 프로토콜은 이러한 접근법을 사용하여 그대로 세포에서 G-단백질 결합 수용체에 의해 칼륨 채널의 변조의 검출에 대해서 설명한다.

G-단백질 결합 수용체에 의해 칼륨 채널의 변조를 감지하기 위해 라벨이없는 광 바이오 센서의 사용

단백질은 서로 상호 작용하며 이러한 상호 작용은 단백질의 기능을 대부분 결정합니다. 단백질 상호 작용 파트너는 디하이드로폴레이트 환원효소 단백질-단편 보완 분석법(DHFR-PCA)을 기반으로 하는 효모 적합성 분석을 사용하여 생체 내에서 고처리량으로 식별할 수 있습니다.

살아있는 세포의 단백질 조각 보완 분석 (PCA)에 의해 게놈 전체 단백질 - 단백질 상호 작용 상영

설명된 세포 분석 결과 CXC chemokine 수용 체 4 (CXCR4)의 식별을 위해 설계 되었습니다-상호 작용 하거나 에이전트는 억제 자극, 경쟁적으로 또는 allosterically, 세포내 캘리포니아2 + 릴리스 CXCR4 활성화에 의해 시작.

운동 형광 기반 Ca2 + 동원 분석 결과 G 단백질 결합 된 수용 체 주 작동 근, 길 항 근, 그리고 Allosteric 변조기를 식별 하

여기, 우리는 높은 처리량 프로토콜 화면 extracellular 단백질 microarrays 소설 수용 체 ligand 상호 작용의 식별을 제시. 우리는 또한 단백질 microbead 복합물을 사용 하 여 일시적인 단백질-단백질 상호 작용의 탐지를 강화 하는 방법을 설명 합니다.

세포 외 단백질 Microarray 기술은 낮은 친 화력 수용 체 Ligand 상호 작용의 높은 처리량 검색

단일 셀 감도 제공, 실시간 cytometry은 유일 하 게 라이브 문화의 복합 수용 체 기능을 계량 적합 합니다. 성숙한 신경 조상 세포를 사용 하 여, P2X7 수용 체 기능 칼슘 유입 칼슘 표시기 염료, ethidium 평범한 사람 통풍 관, 그리고 형광 라텍스 비즈를 사용 하 여 식 균 작용에 의해 막 횡단 기 공 형성에 의해 감지를 통해 평가 했다.

칼슘 유입, 기 공 형성 및 성숙한 신경 조상 세포 수용 체 P2X7에 의해 식 균 작용을 조사 하기 위해 실시간 라이브 셀 Cytometry

이 프로토콜은 세포 환경에서 실시간으로 수용체에 대한 아데닌 뉴클레오티드 결합을 측정하는 방법을 제시합니다. 결합은 트리니트로페닐 뉴클레오티드 유도체와 비표준 형광 아미노산으로 표지된 단백질 사이의 Förster 공명 에너지 전달(FRET)로 측정됩니다.

온전한 기능성 막 단백질에 대한 뉴클레오티드 결합을 실시간으로 측정

MRGPRX2 수용체를 통해 비만 세포를 활성화할 수 있는 짧은 펩티드 라이브러리를 생성하기 위한 기술이 기재되어 있다. 관련 기술은 쉽고 저렴하며 다른 세포 수용체로 확장 될 수 있습니다.

엔지니어링 된 HEK 세포를 사용하여 MRGPRX2를 활성화하는 펩티드 스크리닝

여기에서는 화학 프로브 및 질량 분석법을 사용하여 천연 세포 및 조직에서 질병 특이적 단백질-단백질 상호 작용을 포착하고 식별할 수 있는 프로토콜을 제시합니다. 결과 상호 작용 데이터 세트는 전용 웹 기반 플랫폼을 통해 분석되어 질병과 관련된 동적 네트워크 기능 장애 및 경로 변경을 밝힙니다.

질병에서 기능 장애 단백질-단백질 상호 작용 매핑

직접 lncRNA-단백질 상호작용을 식별하는 자외선 기반 ChIRP 방법.

LncRNA와 직접 상호작용하는 단백질을 검증 가능한 확인을 위한 자외선 기반 ChIRP 방법 - 배양된 세포부터 마우스 고환까지"

배우세요 P2X2 수용체 C말단과 상호작용하는 뇌 단백질을 GST 풀다운 및 질량분석법으로 식별하는 프로토콜입니다. 이 방법은 P2X 수용체 신호전달 메커니즘 연구에 활용됩니다.

P2X2 리간드 - 게이 티드 양이온 채널과 상호 작용하는 단백질을 확인하는 Proteomics

더 많은 동영상 탐색