Name: ES 세포 - 파생 Neuroepithelial 셀 문화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2006-11-30T00:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: 배우세요 ES 세포에서 SDIA를 이용해 신경상피 전구체를 유도 분화하는 방법을. 이 기술은 신경 조직 공학 및 재생의학 연구에 활용됩니다.

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1 단계 <ol><li> 플레이트 mitomycin - C의 α - 멤 미디어 젤라틴 코팅 (30 분 0.01 %) 6 잘 접시에 70,000 / cm2의 밀도에 MS5 세포 (2.5 시간 10 μg / ML) ggrowth - 저해. </li><li> 세포 부착과 monolayer를 (야간 성장 이상) 형성되면, SRM로 전환합니다. </li><li> 수동으로 27과 주사기를 사용하여 ES 세포 배양 ½ G 바늘에서 ES 세포 식민지를 분리. </li><li> MS5 전지 (6 자 판 당 보통 2-3 식민지)에 저밀도에서 1 ML 파란색 팁 및 플레이트와 함께 신중하게 식민지를 Tritrurate. </li></ol> 참고 : ES 세포도 collagenase 또는 트립신 효소를 사용하여 전파에서 촬영하실 수 있습니다. 2 단계 <ol><li> 로제트 함유 식민지 양식까지 14~21일에 대한 MS5 모이통에서 ES 세포를 성장. </li></ol> 참고 : 변경 미디어 자주. rosettes은 식민지와 300-500 NG / ML 노긴는 SRM (3)에 추가하는 경우에는 자신의 형성이 크게 향상 될 수의 바깥 가장자리에 일반적으로있다. 차별 프로토콜에서는, SRM은 N2 - A 매체와 교환 수 있으며, 세포 사양 (2-5) 홍보 성장 또는 기타 요인과 함께 보충. 3 단계 <ol><li> 격리하고 27로 rosettes을 선택 ½ G 바늘을 현미경. </li></ol> 참고 : 절단 및 MS5 stromal 세포를 채취하지 마십시오. 식민지가 rosettes 모여있다면, 어떤 사람은 전체 식민지를 분리하실 수 있습니다. 4 단계 <ol><li> rosettes의 클러스터를 대기음, 폴리 - L - ornithine (0.001 %)과 fibronectin (1 μg / ML) 또는 laminin (1 μg / ML) 코팅 6 우물에 1 ML 파란색 팁 및 플레이트 그들과 함께 신중하게 tritrurate N2 - A 미디어는 일반적으로 bFGF (20 NG / ML)과 보완. rosettes는 개혁과 확장됩니다. </li></ol> 참고 : 셀 생존을 향상시키기 위해, 하나는 플레이트 방울의 작은 클러스터는 세포 밀도를 증가 수 있습니다. 이 단계는 또한 세포 사양 (2-5) 촉진 추가 성장이나 다른 요소와 N2 - 미디어를 보완하여 수정할 수 있습니다.

<ol>
	<li>Kawasaki, H., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+midbrain+dopaminergic+neurons+from+ES+cells+by+stromal+cell-derived+inducing+activity.">Induction of midbrain dopaminergic neurons from ES cells by stromal cell-derived inducing activity.</a> Neuron. 28, 31-40 (2000).</li><li>Perrier, A. L., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+midbrain+dopamine+neurons+from+human+embryonic+stem+cells.">Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 12543-12548 (2004).</li><li>Pruszak, J., Isacson, O., Sullivan, S., Cowan, C., Eggan, K. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+dopaminergic+neurons.">Directed differentiation of human embryonic stem cells into dopaminergic neurons.</a> Human Embryonic Stem Cells: The Practical Handbook. , (2007).</li><li>Pruszak, J., Sonntag, K. C., Aung, M. H., Sanchez-Pernaute, R., Isacson, O. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Markers+and+methods+for+cell+sorting+of+human+embryonic+stem+cell-derived+neural+cell+populations.">Markers and methods for cell sorting of human embryonic stem cell-derived neural cell populations.</a> Stem Cells. 25, 2257-2268 (2007).</li><li>Sonntag, K. C., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+yield+of+neuroepithelial+precursors+and+midbrain-like+dopaminergic+neurons+from+human+embryonic+stem+cells+using+the+bone+morphogenic+protein+antagonist+noggin.">Enhanced yield of neuroepithelial precursors and midbrain-like dopaminergic neurons from human embryonic stem cells using the bone morphogenic protein antagonist noggin.</a> Stem Cells. 25, 411-418 (2007).</li><li>Kawasaki, H., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+dopaminergic+neurons+and+pigmented+epithelia+from+primate+ES+cells+by+stromal+cell-derived+inducing+activity.">Generation of dopaminergic neurons and pigmented epithelia from primate ES cells by stromal cell-derived inducing activity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 1580-1585 (2002).</li><li>Ko, J. Y., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cell-derived+neural+precursors+as+a+continuous,+stable,+and+on-demand+source+for+human+dopamine+neurons.">Human embryonic stem cell-derived neural precursors as a continuous, stable, and on-demand source for human dopamine neurons.</a> J Neurochem. 103, 1417-1429 (2007).</li><li>Hong, S., Kang, U. J., Isacson, O., Kim, K. S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+precursors+derived+from+human+embryonic+stem+cells+maintain+long-term+proliferation+without+losing+the+potential+to+differentiate+into+all+three+neural+lineages,+including+dopaminergic+neurons.">Neural precursors derived from human embryonic stem cells maintain long-term proliferation without losing the potential to differentiate into all three neural lineages, including dopaminergic neurons.</a> J Neurochem. , (2007).</li><li>Zhang, S. C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+subtype+specification+from+embryonic+stem+cells.">Neural subtype specification from embryonic stem cells.</a> Brain Pathol. 16, 132-142 (2006).</li><li>Pankratz, M. T., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+neural+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+via+an+obligated+primitive+anterior+stage.">Directed neural differentiation of human embryonic stem cells via an obligated primitive anterior stage.</a> Stem Cells. 25, 1511-1520 (2007).</li><li>Lazzari, G., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+derivation+of+neural+rosettes+from+cloned+bovine+blastocysts:+a+model+of+early+neurulation+events+and+neural+crest+specification+in+vitro.">Direct derivation of neural rosettes from cloned bovine blastocysts: a model of early neurulation events and neural crest specification in vitro.</a> Stem Cells. 24, 2514-2521 (2006).</li><li>Pomp, O., Brokhman, I., Ben-Dor, I., Reubinoff, B., Goldstein, R. S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+peripheral+sensory+and+sympathetic+neurons+and+neural+crest+cells+from+human+embryonic+stem+cells.">Generation of peripheral sensory and sympathetic neurons and neural crest cells from human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 23, 923-930 (2005).</li></ol>

저자들은 공개할 사항이 없습니다.

이 프로토콜은 SDIA을 사용하여 인간의 ES 세포에서 neuroepithelial 세포를 생성 및 분리의 여러 단계를 보여줍니다. 이 방법의 응용 프로그램은 매니폴드이며 (예 : 1, 2, 5-9) 지정 뉴런을 생산하기 위해 많은 프로토콜에서 사용되고 있습니다. rosettes는 앞쪽에 표현형 (2, 5, 10)과 신경 튜브 세포를 닮은 또한 신경 크레스트 progenitors (11, 12)를 포함하는 것으로 생각되고 있습니다. 그들이 정의된 문화 환경에있는 특정 요인에 의해 패턴 될 수 있기 때문에 또한, 그들은 소성의 특정 수준을 유지합니다. 따라서 SDIA 파생 신경 progenitors 그들 ES 세포 분화의 패러다임에서 다른 신경 세포 인구의 유도를위한 유용한 도구 제작의 중심과 주변 신경 시스템에서 다양한 세포 유형으로 상승을 줄 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>L-Glutamine</td><td></td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>alpha-MEM</td><td></td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>12571</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/streptomycin</td><td></td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Knockout-DMEM</td><td></td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>10829</td><td></td></tr><tr><td>Knockout serum replacement</td><td></td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>10828</td><td></td></tr><tr><td>MEM nonessential amino acid solution</td><td></td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>12383</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td></td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11330</td><td></td></tr><tr><td>N2-A supplement</td><td></td><td>Stem Cell Technologies</td><td>07152</td><td></td></tr><tr><td>Mitomycin-C</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0503</td><td></td></tr><tr><td>Gelatine type-A</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>poly-L-ornithine</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4957</td><td>0.01% 용액</td></tr><tr><td>Laminin</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-2020</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2006</td><td></td></tr><tr><td>Basic fibroblast growth factor (bFGF)</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>13256</td><td></td></tr><tr><td>27 1/2 G 바늘이 장착된 1 mL 주사기</td><td></td><td>BD Biosciences</td><td>309623</td><td></td></tr><tr><td>N2-A 배지</td><td>배지</td><td></td><td></td><td>DMEM/F12 + 1% N2-A supplement</td></tr><tr><td>혈청 대체 배지 (SRM)</td><td>배지</td><td></td><td></td><td>Knockout-DMEM + 20% Knockout serum replacement + 1% MEM nonessential amino acid solution + 2 mM L-glutamine</td></tr><tr><td>&amp;alpha;-MEM 배지</td><td>배지</td><td></td><td></td><td>&amp;alpha;-MEM + 10% FBS + 2 mM L-glutamine + 1% penicillin/streptomycin</td></tr><tr><td>MS5</td><td>세포주</td><td></td><td></td><td>기질 세포</td></tr><tr><td>현미경</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>6-웰 플레이트</td><td></td><td></td><td></td><td>조직 배양용</td></tr></tbody></table>

es 세포 - 파생 neuroepithelial 셀 문화

ES Cell-derived Neuroepithelial Cell Cultures

ES 세포들이 새로운 치료법의 개발을위한 매력적인 도구를 만들어 모든 세균 레이어에서 세포로 차별화할 가능성이있다. 일반적으로 ES 세포의 분화 먼저 다음 증식과 성숙 세포 phenotypes로 차별화된 수있는 미숙 전구 세포를 생성하는 개념을 따르고 있습니다. 첫째, 성숙한 신경 세포에 미숙 neuroepithelial 엽 성의 전구 물질 둘째, 그들의 분화의 유도 및 확장 : 이것은 또한 신경 세포의 개발은 두 가지 주요 단계를 다음과하는, ES 세포 - 파생 neurogenesis 적용됩니다. ES 세포로부터 신경 progenitors을 생산하는 일반적인 방법은 neuroectoderm 포함한 모든 세균 레이어에서 세포의 분화를 보여 embryoid 몸 (EB) 형성에 따라 달라집니다. neuroepithelial 셀 개발을 유도하기 위해 대안과 더 효율적인 방법은 두개골 골수 - 유래 stromal 세포 (1) 공동 culturing의 ES 세포에 의해 얻을 수 stromal 세포 - 파생 유도 활동 (SDIA)를 사용합니다. , EB 형성과 SDIA 둘 다 신경 유사 것으로 생각되고 있습니다 로제트 같은 구조의 개발, 튜브 및 / 또는 신경 능선과 같은 progenitors를 공개. 신경 엽 성의 전구 물질은 정의 문화 조건을 사용하여 특정 뉴런과 glia 세포로 확장하고 더욱 차별, 격리 수 있습니다. 여기, 우리는 stromal 세포 라인 MS5 (2-5)와 함께 공동 문화 실험에서 세대와 같은 rosettes의 절연을 설명합니다.

stromal 세포 - 파생 유도 활동 (SDIA)를 사용하여 배아 줄기 (ES) 세포 neuroepithelial 엽 성의 전구 물질의 유도.

ES 세포 - 파생 Neuroepithelial 셀 문화

ES 세포는 모든 배엽의 세포로 분화할 수 있는 잠재력을 가지고 있어 새로운 치료법 개발을 위한 매력적인 도구가 됩니다. ...

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

여기 마우스 표피 신경 능선의 줄기 세포를 (에피 NCSC) 분리하기 위해 방법을 보여줍니다. 기술과 관련된 마이크로 해부, 수염 모공 볼록한 분리하고 조직 문화에 그것을 placeing. 사일 - 에피 NCSC 3 이내 하층에 팽창의 explants에서 이민을 시작합니다.

마우스 표피 신경 크레스트 줄기 세포 (에피 NCSC) 문화

폐기 인간의 태아 대뇌 피질의 조직에서 신경 줄기 세포의 격리와 문화에 대한 간단하고 신뢰할 수있는 방법을 설명합니다. 알려진 인간의 신경 장애에서 파생된 문화가 같은 약리 효능을 평가하기위한 플랫폼을 제공뿐만 아니라, 병적인 세포 및 분자 공정의 특성에 사용될 수 있습니다.

폐기 인간 태아 두피 조직에서 신경 줄기 세포의 생성

인간 neuroprogenitor 세포 (NPC들)은 증식 조건 하에서 확장 하였다. 의 NPC는 neurotrophins과의 조합의 존재에 신경이 풍부한 문화로 분화되었다. 신경 세포 마커는 면역 형광 염색으로 검출되었다. 뉴런의 순수한 인구를 분리하기 위해,의 NPC는 PEN 막 슬라이드에 차별화 된 레이저 캡처 미세 절제를 행 하였다.

문화의 차별화 된 인간 Neuroprogenitor 세포에서 신경 세포의 레이저 캡처 미세 절제

성인의 뇌에서 수확 한 신경 줄기 세포는 신경 시스템 개발의 기초 연구에서 재생 의학의 잠재적 인 임상 응용 프로그램을 탐험에 이르기까지 다양한 애플리케이션에 활용 증가하고있다. 이 실험 결과를 소리를하는 것이 중요합니다 이러한 세포를 성장하는 데 사용되는 분리 및 배양 조건에서 엄격한 통제를한다.

성인 쥐의 뇌의 기존 및 비 인습적 인 지역에서 신경 줄기 세포 성장

분화된 인간 신경 줄기세포(hNSCs)에서 miRNA의 변화를 특성화하기 위한 목적으로 3차원 시스템에서의 hNSC 분화, miRNA PCR 어레이에 의한 microRNA 발현 변화 평가, miRNA 표적 예측을 위한 컴퓨터 분석 및 이중 루시페라제 분석에 의한 검증에 대해 설명합니다.

3 차원 문화, 마이크로 RNA의 분석 및 추정 적 표적 유전자에 인간의 신경 줄기 세포 라인의 차별화

유도 만능 줄기 세포의 생성은자가 이식의 유도에 대한 매혹적인 전망을 제공합니다. 그러나, 만능 상태와 힘든 다시 차별화를 통해 진행은 여전히​​ 임상 번역을 방해한다. 여기에서 우리는 성인 인간 섬유 아세포의 유도와 유도 된 신경 전구 세포에 자신의 직접 변환과 신경 계통에 후속 차별화를 설명합니다.

성인 인간 섬유 아세포의 유도 및 확장 신경 전구 세포에 자신의 직접 변환

상피에서 중간엽으로의 전이(EMT)는 암이 침습적이 될 수 있도록 합니다. EMT를 조사하기 위해 혈청과 효소가 없는 신경줄기세포(NSC) 기반 체외 모델을 설명합니다. 이 표준화된 시스템을 통해 세포 이동, 유전자 및 단백질 발현에 대한 정량적 및 정성적 평가를 수행할 수 있습니다. 이 모델은 신약 개발에 적합합니다.

약 발견에 적합 EMT 조사를위한 효소 - 및 혈청이없는 신경 줄기 세포 배양 모델

여기서 제시된 것은 인간 배아 줄기 세포의 단일 세포 배양및 이들의 후속 분화를 신경 전구 세포로 의하기 위한 프로토콜이다. 이 프로토콜은 간단하고 견고하며 확장 가능하며 약물 스크리닝 및 재생 의학 응용 분야에 적합합니다.

인간 배아 줄기 세포의 단세포 배양을 이용한 효율적인 신경 분화

제시된 프로토콜은 작은 분자 화합물의 neurite 아웃성장 분석 및 신경 독성 평가를 위한 방법을 설명합니다.

인간 신경 전구 세포 유래 뉴런을 가진 Neurite 아웃growth 분석 및 신경 독성 평가

여기에서는 성체 쥐 뇌실 영역에서 분리된 확장된 신경 줄기 세포(NSC)에서 유전자 전달 효율성을 향상시키도록 설계된 핵절충 시스템에 대해 설명합니다. 이 연구 결과는 이 방법이 NSC의 유전자 섭동을 크게 개선하여 기존 transfection 프로토콜의 효과를 능가하고 세포 생존율을 향상시킨다는 것을 보여줍니다.

Isolation, Expansion, and Nucleofection of Neural Stem Cells from Adult Murine Subventricular Zone

우리는 마우스 배아 줄기 세포에서 두개골 신경 능선 세포를 생성하기 위해 재현 가능한 크기의 신경구를 생성하는 3차원(3D) 체외 분화 프로토콜을 제시합니다. 우리는 이 방법론이 이전 프로토콜에 비해 변동성을 줄이고 두개골 신경 능선 세포 발달을 연구하기 위한 다중 분석에 어떻게 사용할 수 있는지 보여줍니다.

Cranial Neural Crest Cells Multiplexed Assay를 위한 3차원 In Vitro Differentiation Protocol

배우세요 ES 세포에서 SDIA를 이용해 신경상피 전구체를 유도 분화하는 방법을. 이 기술은 신경 조직 공학 및 재생의학 연구에 활용됩니다.

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