의 준비 Drosophila 태아
2009년 3월 13일
라이브 영상 분석을위한 Drosophila의 배아를 준비, 간단한 저렴하고 효과적인 방법이 제공됩니다. 우리 프로토콜은 습도와 가스 교환을 제공하고 Drosophila의 배아를 압축하지 않습니다. 이 방법은 stereomicroscope 또는 수직 복합 현미경을 사용하여 Drosophila의 배아의 GFP 기반의 라이브 영상에 적합합니다.
안녕하세요. 제 이름은 Bruce Reed입니다. 저는 캐나다 온타리오주 워털루에 위치한 워털루 대학교 생물학과 조교수입니다. 오늘 저희는 생체 영상 분석을 위해 소프트리 배아를 준비하는 저희가 개발한 새로운 기술을 기록하기 위해 이 비디오 아카이브를 제작하고 있습니다.
초파리 배아를 이용한 라이브 이미징 분석을 수행할 때, 흔히 타임랩스 촬영을 사용하며 이는 수 시간 동안 지속될 수 있습니다. 따라서 배아가 탈수 및 저산소증으로부터 보호될 수 있는 기술을 확보하는 것이 중요합니다. 또한, 배아에 가해지는 압박을 방지할 수 있는 기술을 개발하고자 합니다.
마운팅과 관련하여, 저희가 고안한 방법은 '현수적(hanging drop) 준비법'이라 불리는 매우 간단하고 저렴하며 효과적인 방식입니다. 현수적 준비법은 실체 현미경이나 모든 정립 화합물 현미경을 이용한 배아의 생체 이미징 분석에 적합합니다. 이 타임랩스 영상은 현수적 프로토콜을 사용하여 준비된 8개의 GFP 발현 배아를 타임랩스 형광 현미경으로 촬영한 모습입니다.
이 이미징 시퀀스는 4시간 이상의 경과 시간을 나타냅니다. 움직임이 시작되는 것은 이 배아들이 생존 가능한 상태임을 보여줍니다. 이제 Hanging drop 프로토콜을 수행하는 방법에 대해 상세한 단계별 설명을 제공하겠습니다.
배아는 표준 포도 주스, 알 또는 플레이트에서 수집합니다. Fly max scientific equipment사의 자동화된 dsof FLA 배아 수집기를 사용하여, 자동 수집기로 미리 정해진 발달 단계의 배아들을 동기화하여 수집합니다. 배아를 수동으로 배치하기 위한 준비 단계로, 양면테이프 조각을 현미경 슬라이드에 부착하고 테이프의 뒷면 보호지를 제거합니다.
현탁 방울(hanging drop) 프로토콜에는 5 mm 두께의 폴리카보네이트 플라스틱 시트로 제작된 맞춤형 챔버가 필요합니다. 시트를 현미경 슬라이드 크기로 절단하고, 로터를 사용하여 3 mm 깊이의 홈을 만듭니다. 라이브 이미징 챔버의 습도 조절은 챔버의 웰 크기에 맞게 절단하여 증류수로 적신 티슈 조각을 사용하여 수행합니다.
Halo Carbon 오일은 가스 투과성이 있고 광학적으로 투명하기 때문에 초파리 배아의 실시간 이미징에 이상적입니다. Halo Carbon 오일 series 700과 series 56을 1:1 비율로 혼합하면 초파리 배아 작업에 적합한 점도가 됩니다. 배아는 정밀 핀셋이나 매우 가는 붓을 사용하여 포도당 아가 플레이트에서 수집할 수 있습니다.
배아는 서로 또는 포셉 팁에 달라붙습니다. 배아들이 뭉쳐서 덩어리를 형성하기 쉬우며, 포셉에 부착되기도 합니다.
팁을 이전에 준비한 장식 슬라이드의 테이프 점착면 위로 조심스럽게 내립니다. 실체 현미경으로 배아를 관찰하면서, 핀셋의 측면으로 배아를 가볍게 밀거나 쳐줍니다. 이때 내부의 유리막(vitelline membrane)을 파열시키지 않고 코로나(corone)만 터뜨려야 합니다.
이 과정에는 안정적인 손놀림과 인내심, 그리고 어느 정도의 연습이 필요합니다. 외막(outer corone)이 파열되면 탈염소화된 배아가 핀셋에 달라붙는 경향이 있습니다. 탈염소화된 배아가 테이프의 끈적한 표면에 닿지 않도록 주의하십시오.
테이프에서 빠르게 회수하는 것이 매우 어려울 수 있으므로, 염소 제거된 배아를 halo로 신속하게 옮기십시오. 커버슬립 위에 Carbon oil 방울을 떨어뜨립니다. 이를 가까이 두는 것이 좋습니다. 포셉의 끝을 halo Carbon oil 방울 표면에 접촉시키십시오.
다음 배아를 염색하기 전, 검은색 배경과 비스듬한 각도로 설정된 광섬유 조명원을 사용하여 배아가 포셉에서 오일 전송액으로 옮겨졌는지 육안으로 확인할 수 있습니다. 할로카본 오일(halo carbon oil) 내에서의 부력으로 인해 포셉에 묻은 오일을 닦아내는 것이 유용합니다. 처리된 배아들은 오일 방울 표면에 떠 있게 됩니다.
현탁 방울(hanging drop) 프로토콜에서 배아를 오일 방울 바닥으로 밀어낸 후 커버슬립을 빠르게 뒤집음으로써 배아의 위치와 방향을 조절할 수 있습니다. 라이브 이미징 챔버의 가습된 웰 위로 커버슬립을 뒤집어 덮습니다. 커버슬립이 뒤집히면 배아는 커버슬립의 아랫면에 밀착되어 놓이게 됩니다.
실체 현미경으로 배아의 정지 위치를 확인합니다. 위치가 적절하지 않은 경우, 해당 절차를 반복할 수 있습니다. 배아가 원하는 위치에 놓이면 커버 글라스를 테이프로 라이브 이미징 챔버에 고정합니다.
테이프에 구멍을 뚫어 챔버를 통기시킵니다. 이제 배아를 촬영할 준비가 되었습니다.
전체 스크립트를 보고 수천 개의 과학 동영상에 액세스하세요
개요
본 논문은 생체 이미징 분석을 위한 초파리(Drosophila) 배아 준비의 간단하고 효과적인 방법을 제시합니다. 이 프로토콜은 배아의 압착을 방지하면서 적절한 습도와 가스 교환을 보장하여, GFP 기반 이미징에 적합하도록 설계되었습니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경과학
- 생물학
- 영상 기술
배경
- Drosophila 배아의 라이브 이미징 분석은 일반적으로 타임랩스 획득 방식을 사용하여 수행됩니다.
- 배아는 장시간의 이미징 세션 동안 탈수와 저산소증에 취약합니다.
- 정확한 이미징을 위해서는 배아의 압착을 방지하는 기술이 필수적입니다.
- GFP 기반 이미징은 최적의 결과를 위해 특정 조건이 필요합니다.
연구 목적
- Drosophila 배아가 건조해지는 것을 방지하는 방법을 개발합니다.
- 이미징 과정 동안 적절한 가스 교환이 이루어지도록 합니다.
- 라이브 이미징 중 배아가 압착되는 것을 방지합니다.
사용된 방법
- 실시간 이미징을 위한 초파리 배아의 준비.
- 이미징 세션 중 습도 조절의 구현.
- 이미징을 위한 실체 현미경 또는 정립 복합 현미경의 사용.
- GFP 기반 이미징 기술의 적용.
주요 결과
- 이 방법은 배아를 위한 습도 유지와 가스 교환을 효과적으로 수행합니다.
- 배아가 압착되지 않은 상태로 유지되어 더 나은 이미징 품질을 얻을 수 있습니다.
- GFP 기반 이미징은 장기간에 걸쳐 선명한 결과를 제공합니다.
- 이 기술은 연구자들에게 간단하며 비용 효율적입니다.
결론
- 이 방법은 초파리 배아의 라이브 이미징 품질을 향상시킵니다.
- 본 방법은 해당 분야의 연구자들에게 신뢰할 수 있는 접근 방식을 제공합니다.
- 이 프로토콜은 다양한 실험실 환경에서 쉽게 채택될 수 있습니다.
자주 묻는 질문
산업적 관련성 요약
모델 생물체의 라이브 이미징은 초기 발굴 단계의 표적 검증 및 표현형 스크리닝에 있어 매우 중요합니다. 현적법(hanging drop protocol)은 장시간의 타임랩스 이미징 동안 배아의 생존력과 데이터 품질을 저하시키는 탈수, 저산소증 및 기계적 압착이라는 주요 한계점을 해결합니다. Drosophila 배아의 압착 없는 생리학적 유효 이미징을 가능하게 함으로써, 이 방법은 확장 가능하고 비용 효율적인 형식으로 유전자 및 약물학적 개입의 기전적 리스크 제거를 지원합니다.
바이오 제약 R&D의 전략적 응용
초기 발견 및 표적 검증
- 과학적 가치: 압축으로 인한 기계적 아티팩트 없이 조직 형태 형성 및 세포 접착과 같은 역동적인 과정에서의 유전자 조절 분석을 가능하게 합니다.
- 운용적 가치: 배아의 생존력을 4시간 이상 유지하여 유전자 기능 및 경로 역학의 종단적 관찰을 지원합니다.
- 예측적 가치: 스트레스 유도 표현형으로 인한 위양성을 줄여 표적 검증 분석의 신뢰도를 높입니다.
스크리닝 및 분석법 개발
- 과학적 가치: 환경적 변동성을 최소화하여 GFP 기반 생체 이미징을 위한 표준화되고 재현 가능한 플랫폼을 제공합니다.
- 운용적 가치: 고처리량 적응에 적합한 저비용의 접근 가능한 재료(할로카본 오일, 폴리카보네이트 챔버, 테이프)를 사용합니다.
- 분석 준비도: 오일 내 배아의 부력을 이용하여 위치 안정성을 유지함으로써, 타임랩스 획득 시 드리프트를 줄이고 신호 일관성을 향상시킵니다.
중개 및 전임상 연구
- 중개적 연속성: 인간 질병 모델과 관련된 보존된 발달 과정의 이미징을 지원하여 종 간 외삽을 용이하게 합니다.
- 기전적 위험 제거: 생리적 조건 하에서 세포 행동(예: 세포 사멸, 부착)을 관찰할 수 있어, 후속 전임상 모델에 대한 예측 신뢰도를 높여줍니다.
- 질병 관련 시스템: 질병 관련 GFP 리포터를 발현하는 Drosophila 배아를 사용하여 생체 내(in vivo) 경로 조절을 모니터링할 수 있습니다.
파이프라인 및 워크플로우 통합
현적법(hanging drop protocol)은 타겟 검증부터 리드 화합물 발굴까지의 발견 연속 과정에 적합하며, 특히 유전적으로 인코딩된 리포터의 역동적이고 압축되지 않은 이미징이 필요한 분석에 유용합니다.
- 발견 생물학: 배아 형태 발생에 미치는 유전자 넉다운 또는 과발현 효과를 직접 시각화함으로써 가설 검증을 지원합니다.
- 스크리닝: 화합물 또는 유전적 조건의 효과를 비교하는 데 필수적인 정량적, 시간 분해능 형광 리드아웃을 제공합니다.
- 분석학: 형태 측정 분석 및 표현형 정량화에 적합한 안정적이고 고품질인 타임랩스 데이터를 생성합니다.
- 중개 연구: Drosophila의 유전적 발견을 보존된 경로와 연결하여 척추동물 모델의 타겟 선정에 정보를 제공합니다.
- 기업적 재사용: 프로토콜의 단순성과 저렴한 비용 덕분에 표준화된 이미징 준비 방법으로서 여러 팀에 걸쳐 광범위하게 도입될 수 있습니다.
운영 및 기업 영향
- 과학적 가치: 압축 아티팩트를 제거하고 이미징 중 생리적 조건을 유지함으로써 예측 신뢰도를 향상시킵니다.
- 운영적 가치: 표준화된 습도 제어, 가스 교환 및 배아 취급을 통해 재현성을 보장합니다.
- 전략적 가치: 스크리닝 캠페인에서 생물학적 노이즈를 줄여 분석 민감도를 높이고 위양성률(false hit rates)을 낮춥니다.
- 포트폴리오 영향: 더 높은 정밀도의 표현형 데이터를 제공함으로써 타겟 검증 시 더욱 신뢰할 수 있는 go/no-go 결정을 가능하게 합니다.
실행 시 고려 사항
- 초파리 배아 취급 및 탈각(dechorionation) 기술에 대한 전문 지식이 필요합니다.
- 챔버 제작을 위한 할로카본 오일 및 기본적인 미세 가공 도구의 사용 가능 여부에 따라 달라집니다.
- 사용자 간의 배아 연령, 유전자형 및 마운팅 일관성의 표준화가 필요합니다.
- 다른 모델 시스템에 적용하려면 오일 부력과 챔버 기하학적 구조의 최적화가 필요할 수 있습니다.
- 실제적인 한계: 할로카본 오일 내에서 부력을 유지하는 배아에 가장 적합하며, 밀도가 더 높거나 접착성이 있는 세포 유형에는 적용할 수 없습니다.
바이오제약 FAQ
Chapters in this video
0:00
Title
0:15
Introduction
1:52
Step 1: Collect Embryos
2:24
Step 2: Prepare a Dechorionation Slide
2:51
Step 3: Prepare Imaging Chamber
3:32
Step 4: Place Halocarbon Oil on a Coverslip
4:05
Step 5: Picking Embryos From Plates
4:38
Step 6: Place Embryos onto Tape
5:01
Step 7: Roll Embryos to Remove the Chorion
6:15
Step 8: Transfer Embryos to Halocarbon Oil
6:47
Step 9: Push Embryos to Bottom of Oil
7:14
Step 10: Invert Coverslip on Live Imaging Chamber
7:38
Step 11: Secure Coverslip with Tape
