Name: 의 준비 Drosophila 태아 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-03-13T00:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: 학습하세요 Drosophila 태아의 공중 드롭 프로토콜을 사용한 라이브 영상 준비 방법을. 탈수와 저산소를 방지하며 압박 없이 GFP 기반 장시간 촬영이 가능한 간단하고 경제적인 기술입니다.

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우리는 기꺼이 디스커버리 그랜트뿐 아니라 연구 도구 및 자연 과학, 캐나다 공학 연구 협의회 (NSERC)에서 악기 부여를 통해 BHR 지원을 인정합니다. 또한 H.오다와 예제 라이브 영상 시퀀스에 사용되었습니다 유전 주식을 제공하는 블루밍턴 Drosophila 주식 센터를 인정합니다.

준비 <ol><li> 표준 포도 - 쥬스 한천 플레이트 4 배아를 수집합니다. 그것은 자동 Drosophila 에그 콜렉터 (Flymax 첨단 장비 회사)를 이용하시면 편리합니다. 동기를 사용하면 배아 컬렉션 원하는 발달 단계에서 배아의 충분한 숫자를 얻기 위해 수행되어야합니다 dechorionations의 수를 줄일 수 있습니다 개최. </li><li> 현미경 슬라이드에 양면 테이프의 조각을 부착하여 dechorionation 슬라이드를 준비하며 테이프에서지지를 제거합니다. </li><li> 챔버의 잘 적응하기 위해 조직의 일부를 절단하여 라이브 영상 챔버를 준비합니다. 우물에 조직을 넣고 증류수로 젖었어. </li><li> 1시 1분의 비율로 혼합 할로 카본 오일 (할로 카본 제품 주식 회사) 점도 시리즈 700 및 시리즈 56. 혼합물은 저장하고 무기한 사용할 수 있습니다. </li><li> coverslip (22 X 40mm, 제 2)의 표면에 할로 카본 오일의 여러 작은 방울을 넣으십시오. 볼륨 중요한 것은 아니지만 20-40 μl의 순서에 있어야합니다. </li></ol> 절차 <ol><li> stereomicroscope의 도움으로 중 보석의 포셉 한 쌍의 (제 5) 또는 아주 좋은 페인트 브러쉬를 사용하여 포도 주스 - 한천 플레이트에서 배아를 수집합니다. 배아는 서로와 포셉 &#39;팁에 충실하는 경향이, 그들은 쉽게 대단히 짧은 시간에 모여 있습니다. </li><li> stereomicroscope의 도움으로 부드럽게 dechorionation 슬라이드에있는 테이프의 표면에 포셉의 조언을 준수해야 태아의 대단히 짧은 시간을 낮추십시오. </li><li> 다시 stereomicroscope를 사용하여 부드럽게 안쪽 vitelline 막 (vitelline 막이 터진 경우 배아가 파열됩니다) rupturing없이 외부 밀랍 chorion을 열고 침입하기 위해 포셉의 측면으로 배아를 슬쩍 찌르다 또는 뇌졸중. </li><li> 외부 chorion가 파열되면 chorion에서 배아를 애타게, dechorionated 배아는 포셉의 표면을 준수하는 경향이있다. 테이프의 표면에 dechorionated 배아를 만지지 않도록 조심 해요. </li><li> 마자 배가 dechorionated이므로, 빨리 coverslip에 할로 카본 오일의 이전 준비 드​​롭로 전송할 수 있습니다. 할로 카본 오일 드롭의 표면에 dechorionated 배아를 가지고 포셉의 팁을 터치 - 이것은 기름에 포셉에서 배아를 d​​islodges. </li><li> 오일 드롭 배아의 전송을 확인합니다. 이것은 당신이 검정색 배경을 통해 업무와 경사 각도에서 설정 광섬유 조명 소스를 사용하는 제공된 육안으로 수행할 수 있습니다. </li><li> 다른 배아를 d​​echorionate하기 전에, 포셉로부터 기름을 청소하십시오. 기름에 코팅 집게는 dechorionation 더 어렵게 chorion 표면에 적은 구입했습니다. </li><li> Dechorionated 배아는 할로 카본 기름에 부력이 있습니다. 포셉 또는 페인트를 사용하고 stereomicroscope를 통해 보는 동안, 오일 드롭의 하단에 배아를 밀고하고 원하는 위치에 배열. </li><li> 신속 라이브 이미징 챔버 잘 통해 coverslip을 반전. 태아가 원하는 방향으로 coverslip에 대한 쉬고 있는지 확인합니다. 기름에서 부력으로 인해 태아는 이제 coverslip의 낮은 표면으로부터 떠 것입니다. 테이프와 라이브 이미징 챔버로 coverslip을 수정. 테이프가 coverslip의 끝에와 라이브 이미징 챔버 잘의 끝 사이의 간격을 펼쳐져있는 지역의 테이프에 구멍을 절단하여 챔버를 환기. </li><li> 직립 형광 현미경 또는 형광 stereomicroscope 이제 이미지 배아를 사용할 수 있습니다. </li></ol>

<ol><li>Kiehart, D. P., Galbraith, C. G., Edwards, K. A., Rickoll, W. L., Montague, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+forces+contribute+to+cell+sheet+morphogenesis+for+dorsal+closure+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Multiple forces contribute to cell sheet morphogenesis for dorsal closure in Drosophila.</a> J. Cell Biol. 149, 471-490 (2000).</li>
<li>Schock, F., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+processes+associated+with+germ+band+retraction+in%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Cellular processes associated with germ band retraction in.</a> , 248-2429 (2002).</li>
<li>Reed, B. H., Wilk, R., Schock, F., Lipshitz, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin-dependent+apposition+of+Drosophila+extraembryonic+membranes+promotes+morphogenesis+and+prevents+anoikis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Integrin-dependent apposition of Drosophila extraembryonic membranes promotes morphogenesis and prevents anoikis.</a> Curr. Biol. 14, 372-380 (2004).</li>
<li>Wieschaus, E. p, Nusslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWieschaus%2C+Ep+%22Drosophila%3A+a+practical+approach%22">Drosophila: a practical approach</a>. Roberts, D. B. , IRL Press Limited. Oxford, England. 199-227 (1986).</li>
</ol>

우리는 우리가 매달려 드롭 프로토콜을 호출 라이브 영상 분석에 대한 Drosophila의 배아를 준비하는 새로운 방법을 설명합니다. 불행히도, 거꾸로 현미경으로 작업하는 경우 매달려 놓기 프로토콜을 사용하는 것은 불가능합니다. 이 경우에는 sandwiching 기술은 (같은 추상적 위에서 설명한) 사용하고 배아의 압축 우려 남아 있어야합니다. 세포 모양과 크기가 morphogenetic 운동과 관련된 세력을 계산하기 위해 측정 실험에서, 똑바로 현미경 및 매달려 드롭 프로토콜의 사용은 감소 배아 압축 것이 바람직 때문에입니다. 또한, 매달려 드롭 프로토콜을 사용하여 감소 배아 압축 sandwiching 기술이 평평 표면을 제시 반면 배아의 둥근 undistorted 표면을 표현의 결과가 있습니다. 공촛점 현미경을 사용하면 그것이 수집 그러므로 필요한 sandwiching 방법 대 매달려 드롭 프로토콜을 사용하는 경우 (스택 당 조각) 광범위한 Z - 스택. Z - 스택 당 조...

현미경 슬라이드, coverslips (22 X 40mm, 번호 2), 양면 테이프, 보석의 포셉 (더몬트 스타일 번호 5 : 표준 장비 및 매달려 드롭 프로토콜을 사용하여 라이브 영상을위한 배아를 준비하는 데 필요한 자료는 다음과 같은 항목을 포함 ), 할로 카본 오일 시리즈 56 및 시리즈 700 (할로 카본 제품 주식 회사), 유틸리티 나이프 단일 에지 면도날, 조직 종이, 가위, 증류수, 범용 테이프, 그리고 20-40 μl를 전달하기위한 적합한 pipet. 라이브 영상 프로토콜은 또한 사용자 정의 만든 라이브 영상 챔버가 필요합니다. 이것은 5mm가 표준 현미경 슬라이드 (75 X 25mm)의 크기에 폴리 카보 네이트 플라스틱 시트를 생각 절단 및 슬라이드 (20 X 55mm)에 3mm 깊은 우울증을 생성하기 위해 로터를 사용하여 준비가되어 있습니다. stereomicroscope (현미경을 해부) 및 광섬유 조명 소스도 필요에 액세스할 수 있습니다.

의 준비 drosophila</em공중 드롭 프로토콜을 사용하여 라이브 영상을위한> 태아

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

그린 형광 단백질 (GFP) timelapse 라이브 영상 그러한 조직 morphogenesis, 세포 - 세포 부착, 또는 세포 사망과 같은 동적 프로세스의 유전자 조절을 연구위한 강력한 기법입니다 기반. GFP를 표현 Drosophila의 배아는 즉시 중 입체 또는 공촛점 현미경을 사용하여 몇 군데 있습니다. 살아있는 영상 프로토콜의 목표는 탈수와 hypoxia로 해로운 영향을 최소화하는 것입니다. 라이브 영상 분석을위한 Drosophila의 배아를 준비 이전 프로토콜 할로 카본의 기름에 dechorionated 배아를 삽입하고 할로 카본 가스 투과 막과 coverslip 사이에 그들을 sandwiching 참여했습니다<sup&gt; 1-3</sup&gt;. 이러한 방식으로 장착 배아를 통해 압축의 도입은 morphogenesis의 biomechanical 기반의 분석을위한 바람직하지 않은 복잡을 나타냅니다. 우리가 매달려 드롭 프로토콜, 라이브 영상 중에 태아의 생존에 좋은 결과를 전화 배아를 압축하는 것이 필요하지 않습니다 우리의 방법. 간단히, 매​​달려 드롭 프로토콜은 습기 챔버를 통해 위치에 고정 차례입니다 coverslip,에서 일시 중지되었습니다 할로 카본 오일 드롭 태아의 위치를​​ 포함합니다. 가스 교환을 제공하고 탈수를 방지하는 것 외에도,이 협정 timelapse 취득하는 동안 위치에서 벗어나 표류에서 그들을 방지하기 위해 할로 카본 오일에서 태아의 부력을 활용합니다. 이 동영상은 매달려 드롭 프로토콜을 사용하여 라이브 영상에 대한 Drosophila의 배아를 수집하고 준비하는 방법을 자세히 설명합니다. 이 프로토콜은 stereomicroscopy 또는 수직 복합 형광 현미경을 사용하여 영상 dechorionated 배아에 적합합니다.

라이브 영상 분석을위한 Drosophila의 배아를 준비, 간단한 저렴하고 효과적인 방법이 제공됩니다. 우리 프로토콜은 습도와 가스 교환을 제공하고 Drosophila의 배아를 압축하지 않습니다. 이 방법은 stereomicroscope 또는 수직 복합 현미경을 사용하여 Drosophila의 배아의 GFP 기반의 라이브 영상에 적합합니다.

의 준비 Drosophila</em공중 드롭 프로토콜을 사용하여 라이브 영상을위한> 태아

녹색 형광 단백질(GFP) 기반의 타임랩스 라이브 이미징은 ...와 같은 동적인 과정의 유전적 조절을 연구하는 강력한 기술입니다.

안녕하세요. 제 이름은 Bruce Reed입니다. 저는 캐나다 온타리오주 워털루에 위치한 워털루 대학교 생물학과 조교수입니다. 오늘 저희는 생체 영상 분석을 위해 소프트리 배아를 준비하는 저희가 개발한 새로운 기술을 기록하기 위해 이 비디오 아카이브를 제작하고 있습니다.초파리 배아를 이용한 라이브 이미징 분석을 수행할 때, 흔히 타임랩스 촬영을 사용하며 이는 수 시간 동안 지속될 수 있습니다. 따라서 배아가 탈수 및 저산소증으로부터 보호될 수 있는 기술을 확보하는 것이 중요합니다. 또한, 배아에 가해지는 압박을 방지할 수 있는 기술을 개발하고자 합니다.마운팅과 관련하여, 저희가 고안한 방법은 '현수적(hanging drop) 준비법'이라 불리는 매우 간단하고 저렴하며 효과적인 방식입니다. 현수적 준비법은 실체 현미경이나 모든 정립 화합물 현미경을 이용한 배아의 생체 이미징 분석에 적합합니다. 이 타임랩스 영상은 현수적 프로토콜을 사용하여 준비된 8개의 GFP 발현 배아를 타임랩스 형광 현미경으로 촬영한 모습입니다.이 이미징 시퀀스는 4시간 이상의 경과 시간을 나타냅니다. 움직임이 시작되는 것은 이 배아들이 생존 가능한 상태임을 보여줍니다. 이제 Hanging drop 프로토콜을 수행하는 방법에 대해 상세한 단계별 설명을 제공하겠습니다.배아는 표준 포도 주스, 알 또는 플레이트에서 수집합니다. Fly max scientific equipment사의 자동화된 dsof FLA 배아 수집기를 사용하여, 자동 수집기로 미리 정해진 발달 단계의 배아들을 동기화하여 수집합니다. 배아를 수동으로 배치하기 위한 준비 단계로, 양면테이프 조각을 현미경 슬라이드에 부착하고 테이프의 뒷면 보호지를 제거합니다.현탁 방울(hanging drop) 프로토콜에는 5 mm 두께의 폴리카보네이트 플라스틱 시트로 제작된 맞춤형 챔버가 필요합니다. 시트를 현미경 슬라이드 크기로 절단하고, 로터를 사용하여 3 mm 깊이의 홈을 만듭니다. 라이브 이미징 챔버의 습도 조절은 챔버의 웰 크기에 맞게 절단하여 증류수로 적신 티슈 조각을 사용하여 수행합니다.Halo Carbon 오일은 가스 투과성이 있고 광학적으로 투명하기 때문에 초파리 배아의 실시간 이미징에 이상적입니다. Halo Carbon 오일 series 700과 series 56을 1:1 비율로 혼합하면 초파리 배아 작업에 적합한 점도가 됩니다. 배아는 정밀 핀셋이나 매우 가는 붓을 사용하여 포도

the-preparation-drosophila-embryos-for-live-imaging-using-hanging

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

Drosophila의 hemocytes은 개발 배아의 전체를 통해 분산. 이 프로토콜은 찬란 표시된 hemocytes와 배아를 사용하여 이러한 마이 그 레이션을 마운트 및 이미지하는 방법을 보여줍니다.

라이브 영상 Drosophila melanogaster 배아 Hemocyte 마이 그 레이션

여기 스테인드에 대한 마운트 프로토콜을...

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개별 준비 Drosophila</em라이브 이미징을위한> 계란 회의소

SAC는 자매 chromatids의 mitotic의 분리를 모니터링의 신호를 시작하는 곳이 kinetochore입니다. 방법으로 염색체 운동과 함께 kinetochore 단백질과 그 조정 중 하나의 모집 및 매출을 시각화하기 위해 설명되어...

생활에서 보여주는 동적 Kinetochore 단백질 행동과 염색체 모션으로 Mitotic 검사 점 유학<em&gt; Drosophila</em&gt; Syncytial 태아

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여기에서 우리는 사멸 세포 간극의 역학을 공부하는 효과적인 방법을...

사멸 세포 간극의 이미지를하는 동안 라이브<em&gt; 초파리</em&gt; 배아

이 프로토콜은 살아있는 초파리 번데기 눈 신경 상피를 이미징하는 효율적인 방법을 제시합니다. 이 방법은 조직의 움직임과 불균일한 토폴로지를 보상하고, 여러 GFP 태그가 지정된 접합 단백질을 사용하여 세포 경계의 시각화를 향상시키며, 쉽게 조립할 수 있는 이미징 장비를 사용합니다.

의 라이브 영상 초파리 번데기 눈

여기에 제시된 프로토콜은 플레이트 기반의 고함량 이미저를 사용하여 배아 발달 중에 여러 Drosophila 배아를 마이크로주입하고 동시에 이미지화하는 프로토콜이다.

자동 고함량 분석기를 사용하여 수행된 살아있는 세포 현미경 검사법을 위한 Drosophila 배아 준비 및 미세 주입

광 시트 기반 형광 현미경 검사는 발달 생물학에서 가장 가치있는 도구입니다. 비교 연구의 주요 문제는 주변 분산입니다. 우리의 프로토콜은 여러 표본의 동시 라이브 이미징을위한 실험 프레임 워크를 설명하고, 따라서, 적극적으로이 문제를 해결.

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여기서, 우리는 후기 배아 초파리 남성 생식선을 생생하게 이미지화하는 데 필요한 해부 프로토콜을 제공한다. 이 프로토콜은 정상적인 조건 하에서 또는 트랜스제닉 또는 약리학적 조작 후에 동적 세포 과정의 관찰을 허용할 것이다.

후기 배아 초파리 고나드의 해부와 라이브 이미징

이 프로토콜은 기존의 GFP/mCherry-tag 접근법을 사용하여 검출하기 어려운 저농도 단백질 또는 번역 후 변형의 실시간 이미징을 가능하게 하는 맞춤형 항체 기반 형광 라벨링 및 초기 초파리 배아에 주입하는 방법을 설명합니다.

형광 항체 주입을 통한 살아있는 초파리 배아의 저농도 단백질 및 번역 후 변형 시각화

학습하세요 Drosophila 태아의 공중 드롭 프로토콜을 사용한 라이브 영상 준비 방법을. 탈수와 저산소를 방지하며 압박 없이 GFP 기반 장시간 촬영이 가능한 간단하고 경제적인 기술입니다.

의 준비 Drosophila 태아

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