Name: 세계 S. cerevisiae의에서 organelle 형태를 연구하기 위해 높은 처리량 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-03-02T00:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 29 s
Description: 학습하세요 효모 S. cerevisiae에서 오르가넬 형태를 연구하는 고처리량 방법을. GFP 마커를 5,000개 비필수 유전자에 동시 도입하여 돌연변이 선별 효율을 높이고 공초점 현미경으로 미토콘드리아 구조를 관찰합니다.

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이 작품은 생명 공학 및 생물 과학 연구위원회 (부여 31/C15982), 건강 연구의 캐나다 연구소, 혁신, 브리티시 컬럼비아 기술 개발 기금에 대한 캐나다 재단 CJR로 건강 연구에 대한 마이클 스미스 재단 (부여에 의해 지원되었다 로웬), 그리고 시력을 위해 싸웠습니다.

재료 및 방법 : <ol><li> 효모 종자 : <ul><li> Acp1 - GFP (GFP : : 그의) : Acp1의 C - 말단 GFP - 태그는 플라스미드 pKT128을 (GFP 및 HIS5를 포함)를 사용하여 PCR - 중재 상동 재조합에 의해 생성되었다. 긍정적인 transformants은 공촛점 현미경과 식민지 PCR에 의해 확인되었다. 분 연구소 (통과 분, 2006)에서 : 스트레인 배경 BY7043 (STE2pr - lue2 lyp1Δ his3Δ1 leu2Δ0 ura3Δ0 met15Δ0 MAT 알파 can1Δ)되었습니다. </li><li> 삭제 돌연변이 어레이 (DMA) (XXX : KanR) : 그것은 중요하지 않은 유전자의 약 5000 삭제 돌연변이의 배열입니다. 이러한 불필요한 유전자의 모든 G418에 기절했다. 배열의 변형 배경은 BY4741 (마타 his3_1 leu2_0 met15_0 ura3_0)입니다. 우리 DMA 원래 분이 연구실에서했다. </li></ul></li><li> DMA에 Acp1 - GFP를 통합 : GFP 배열을 만들기위한 다음과 같은 프로토콜은 수정과 합성 유전자 분석 (SGA) 기술 (통과 분, 2006)에서 적응됩니다. 복제 달아 단계의 모든 로봇 시스템을 arraying 싱어 로터 고밀도를 사용하여 수행할 수 있습니다. 또는, 수동 달아 또는 액체 기반의 고밀도 arraying 로봇이 사용할 수 있습니다. 약어 : YPD, 효모 추출물 - 펩톤 - 덱스 트로 오스, SD, 합성 중퇴, LRK, 루 / ARG /리스 중퇴 미디어, LHRK, 루 / 그 / ARG /리스 중퇴 미디어 준비 <ol><li> YPD 접시에 하룻밤 Acp1 - GFP 문화의 5 ML를 따르고하여 Acp1 - GFP 세포의 잔디를 성장. 접시 불꽃 또는 생물 학적 퓸 후드에서 충분히 건조하도록 허용합니다. </li><li> 30 ˚ C 하룻밤에 번호판을 품어. </li><li> 판 당 1,536 식민지로 로봇, 배열 Acp1 - GFP의 변형을 사용합니다. 동시에, 복제 YPD + G418 판을 달아하여 DMA의 새로운 사본을 준비합니다. </li><li> 30 ˚ C 하룻밤에 번호판을 품어. 번식 및 diploid 선택 </li><li> 복제 달아 및 YPD 접시에 식민지를 통해 부설하여 DMA와 Acp1 - GFP의 변형을 친구. </li><li> 30 ˚ C 하룻밤에 번호판을 품어. </li><li> diploid 세포를 (마타 / MATalpha)을 선택 그의 + G418 플레이트 - SD에 복제 판 식민지. </li><li> 30 ˚ C 하룻밤에 번호판을 품어. Sporulationg 및 발아 </li><li> meiotic 포자의 형성을 유도하기 위해 탄소와 질소 원의 감소 수준을 포함하고 향상된 sporulation 미디어에 복제 판 diploid 식민지. </li><li> 25 ˚ C 오일 최소 번호판을 품어. </li><li> LRK 미디어에 복제 - 도금 식민지로 마타 meiotic progenies를 발아하고 ˚ C 이틀 동안 30 번호판을 품어. </li><li> 이 미디어는 포자에서 haploid 세포의 발아를 유도합니다. LUE2 여는 독서 프레임 (ORF)가 마타 특정 STE2 프로 모터에 통합되어 있기 때문에, germinated 모든 haploids는 마타 것입니다. 두 대립 유전자의 선택 </li><li> 이제 GFP의 allele과 단일 돌연변이 allele을 모두 선택하는 것이 필요합니다. 이것을 달성하기 위해, 마타 전지은 복제 도금 유전자 삭제를 (XXX : kanR) 휴대 haploid 세포에 대한 선택 LRK + G418 미디어로. </li><li> 30 ˚ C 하룻밤에 번호판을 품어. </li><li> 마지막으로, 마타 meiotic progenies은 복제 도금 단일 돌연변이의 성장 (XXX : kanR :)에 대한 선택 LHRK + G418 미디어에 또한 Acp1 - GFP 은닉 (GFP를 : 그). 이 번호판은 ˚ C 최대 3 개월까지 4 저장할 수 있습니다. </li></ol> GFP 배열을 만들기위한 다음과 같은 프로토콜은 수정과 합성 유전자 분석 (SGA) 기술 (통과 분, 2006)에서 적응됩니다. 복제 달아 단계의 모든 로봇 시스템을 arraying 싱어 로터 고밀도를 사용하여 수행할 수 있습니다. 또는, 수동 달아 또는 액체 기반의 고밀도 arraying 로봇이 사용할 수 있습니다. 약어 : YPD, 효모 추출물 - 펩톤 - 덱스 트로 오스, SD, 합성 중퇴, LRK, 루 / ARG /리스 중퇴 미디어, LHRK, 루 / 그 / ARG /리스 중퇴 미디어 준비 </li><li> 현미경 : <ol><li> 판에서 직접 Acp1 - GFP를 표현 원하는 돌연변이 (들)을 선택하십시오. </li><li> 30 세포를 성장 ° YPD 또는 SD의 C - 초기 로그 단계에 그의 미디어. </li><li> GFP의 filterset를 사용 공촛점 현미경으로 시각화. 예상 결과의 예를 그림 1에 표시됩니다. </li></ol></li></ol> SGA 미디어 : 이 프로토콜에 사용되는 성장 미디어 (YPD)와 선택 미디어 (SD)는 정기적으로 효모 분자 생물학에서 사용됩니다. 자세한 설명을 위해 (앰버그 외., 2005) 효모의 방법을 참조하십시오. LRK, LHRK 미디어 (400 ML의 총) <table border="0"><tbody><tr><td> 순서에 추가 </td><td> 양 </td></tr><tr><td> 암모늄 황산과 효모 질소베이스 </td><td> 2.7 g </td></tr><tr><td> 아미노산혼합 </td><td> 0.8 g </td></tr><tr><td> 한천 </td><td> 8g </td></tr><tr><td> DH 2 O </td><td> 360 ML </td></tr><tr><td colspan="2"> 압력솥 </td></tr><tr><td> 20 % 덱스 트로 오스 </td><td> 40 ML </td></tr><tr><td colspan="2"> 65 쿨 ˚ C </td></tr><tr><td> 100 MG / ML canavanine </td><td> 0.2 ML </td></tr><tr><td> 100 MG / ML thialysine </td><td> 0.2 ML </td></tr><tr><td colspan="2"> 믹스, 플레이트 50 ML을 따르다 </td></tr></tbody></table> LRK, LHRK + G418 미디어 (400 ML의 총) <table border="0"><tbody><tr><td> 순서에 추가 </td><td> 양 </td></tr><tr><td> 암모늄 황산없이 효모 질소베이스 </td><td> 0.7 g </td></tr><tr><td> 아미노산 믹스 </td><td> 0.8 g </td></tr><tr><td> Monosodium 글루 탐 산염 </td><td> 0.4 </td></tr><tr><td> 한천 </td><td> 8g </td></tr><tr><td> DH 2 O </td><td> 360 ML </td></tr><tr><td colspan="2"> 압력솥 </td></tr><tr><td> 20 % 덱스 트로 오스 </td><td> 40 ML </td></tr><tr><td colspan="2"> 65 쿨 ˚ C </td></tr><tr><td> 100 MG / ML canavanine </td><td> 0.2 ML </td></tr><tr><td> 100 MG / ML thialysine </td><td> 0.2 ML </td></tr><tr><td> 200 MG / ML G418 </td><td> 0.4 ML </td></tr><tr><td colspan="2"> 믹스, 플레이트 50 ML을 따르다 </td></tr></tbody></table> 강화 sporulation 미디어 (400 ML의 총) <table border="0"><tbody><tr><td> 순서에 추가 </td><td> 양 </td></tr><tr><td> 칼륨 아세테이트 </td><td> 4g </td></tr><tr><td> 효모 추출물 </td><td> 0.4 g </td></tr><tr><td> 우선당 </td><td> 0.2 g </td></tr><tr><td> Sporulation 아미노산 믹스 </td><td> 0.04 g </td></tr><tr><td> 한천 </td><td> 8g </td></tr><tr><td> DH 2 O </td><td> 360 ML </td></tr><tr><td colspan="2"> 압력솥 </td></tr><tr><td colspan="2"> 65 쿨 ˚ C </td></tr><tr><td> 200 MG / ML G418 </td><td> 0.4 ML </td></tr><tr><td colspan="2"> 믹스, 플레이트 50 ML을 따르다 </td></tr></tbody></table>

<ol><li>Amberg, D. C., Burke, D., Strathern, J. N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAmberg%2C+DC+%22Methods+in+yeast+genetics+%3A+a+Cold+Spring+Harbor+Laboratory+course+manual%22">Methods in yeast genetics : a Cold Spring Harbor Laboratory course manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2005).</li>
<li>Tong, A. H., Boone, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+genetic+array+analysis+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Synthetic genetic array analysis in Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods Mol Biol. 313, 171-192 (2006).</li>
</ol>

이 방법은 여러 가지 돌연변이 배경에 mitochondrial 마커, Acp1 - GFP를 통합할 효율적으로 도움이 될 수 있습니다. 그것은 로봇 시스템의 사용에 의존하고, 쉽게 어떤 로봇 시스템과 함께 사용하기 위해 채택 수 있습니다. 이 절차는 마커의 다른 유형을 통합 사용할 수 있습니다. 예를 들어, ER을 시각화하기 위해, 우리는 정기적으로 마커 Erg11 - GFP를 사용합니다. 우리의 대표 이미지, 돌연변이 및 Acp1 - GFP 메이커와 야생 유형 visualiz 에드는 mitochondria 형태를 연구하기 위해 공촛점 현미경에 의해했다. 돌연변이 중단 mitochondrial 표현형을 보여, 따라서 자세한 조사를 위해 좋은 후보자이다.

<table><tbody><tr><td>SGA 배지</td><td></td><td></td><td>본 프로토콜에서 사용된 성장 배지(YPD)와 LRK 및 LHRK를 포함한 합성 결핍 배지(SD), 그리고 농축 포자 형성 배지는 효모 분자생물학에서 통상적으로 사용됩니다. 자세한 설명은 Methods in Yeast (Amberg et al., 2005)를 참조하십시오.</td></tr></tbody></table>

세계 s. cerevisiae의에서 organelle 형태를 연구하기 위해 높은 처리량 방법

A high-throughput method to globally study the organelle morphology in S. cerevisiae

단백질 지방화 또는 organelle의 형태를 검사하기 위해 높은 처리량 방법은 단백질 상호 작용을 공부를위한 효과적인 도구이며 분자 경로의 포괄적인 이해를 얻을 수 있습니다. Saccharomyces의 cerevisiae에서 중요하지 않은 유전자 삭제 배열의 발달과 함께, 우리는 전세계 endoplasmic reticulum (ER)과 mitochondria 사용하여 GFP (또는 변형) - 마커 서로 다른 유전자 배경처럼 다른 organelles의 형태를 공부할 수 있습니다. 그러나, 각 단일 돌연변이에 결합 GFP 표식이 개별적으로 노동 집약적인 과정입니다. 여기, 우리는 정기적으로 저희 연구실에서 사용하는 절차를 설명합니다. 고밀도 효모 배열과 약물 선택 기법을 처리하는 로봇 시스템을 사용함으로써, 우리는 상당히 시간이 필요 단축 및 재현성을 향상시킬 수 있습니다. 간단한, 우리는 로봇 복제 달아하여 4,672 불필요한 유전자 삭제 돌연변이의 고밀도 배열 GFP - 태그 mitochondrial 마커 (Apc1 - GFP)을 교차. diploid 선택, sporulation, 발아 및 듀얼 마커 선택을 통해, 우리는 두 대립 유전자를 복구합니다. 결과적으로, 각 haploid 단일 돌연변이의 게놈 로커스에서 통합 Apc1 - GFP가 포함되어 있습니다. 이제, 우리는 모두 중요하지 않은 돌연변이 배경으로 mitochondria의 형태를 공부할 수 있습니다. 이 높은 처리량 접근 방식을 사용, 우리는 편리하게 연구와 게놈 전체 설정에서 상속 및 organelles의 형성에 관련된 경로와 유전자를 윤곽을 그리다 수 있습니다.

GFP - 퓨전 단백질은 널리 공촛점 현미경에 의해 organelles을 시각화하는 데 사용됩니다. 그러나, organelles의 형태에 영향을 변이에 대한 검사는 일반적으로 개별적인 돌연변이 유발이 필요하며 시간이 소요됩니다. 여기, 우리는 동시에 효모 거의 5000이 아닌 필수적인 유전자에 organelle - GFP 표식을 통합하는 방법을 보여줍니다.

세계 S. cerevisiae의에서 organelle 형태를 연구하기 위해 높은 처리량 방법

단백질 국소화 또는 세포소기관 형태를 조사하기 위한 고속 분석법(high-throughput methods)은 단백질 상호작용을 연구하는 효과적인 도구이며 ... 에 도움이 될 수 있습니다.

이 절차는 먼저 세포주를 배양한 다음 새로운 플레이트에 어레이를 핀으로 찍어내어 CP one GFP 어레이를 준비하는 것으로 시작합니다. 동시에 DMA의 신선한 복사본을 준비합니다. 다음으로 ACP one GFP 어레이를 DMA와 교배시키고 이배체를 선택하며, 이후 이를 포자 형성 배지에서 포자 형성시킵니다.5일 후, Myotic 자손을 LRK 배지에서 발아시키며, 여기에서는 MAT A 반수체만 성장합니다. 두 번의 추가 선택 과정을 통해, ACP one GFP와 can mycin 유전자가 결손된 반수체 세포를 회수합니다. 마지막으로, 플레이트에서 개별 균주를 직접 선택하여 공초점 현미경으로 미토콘드리아 형태를 관찰할 수 있습니다.안녕하세요, 저는 브리티시 컬럼비아 대학교 생명과학연구소 세포 및 발생생물학과의 Law 연구실 소속 Chap T입니다. 안녕하세요, 저도 Law 연구실의 Jesse Chao입니다. 오늘은 로봇 시스템을 이용하여 효모의 다양한 돌연변이 배경에 GFP 마커를 도입하는 고처리량 방법을 보여드리겠습니다.본 실험실에서는 D, 소포체 및 미토콘드리아와 같은 세포소기관의 형태를 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다. 그럼 시작하겠습니다. 본 프로토콜에서는 두 가지 서로 다른 효모 균주를 사용합니다.CP one GFP는 ACP one의 C 말단에 GFP 태그가 붙은 균주로, 플라스미드 PKT 1 28을 이용한 PCR 매개 상동 재조합을 통해 생성되었습니다. 균주 배경은 BY 7 0 4 3입니다. 또한, 비필수 유전자의 결실 돌연변이 약 5, 000종으로 구성된 어레이인 DMA 균주 또는 결실 돌연변이 어레이(deletion mutant array)를 사용합니다.이 모든 비필수 유전자들은 G four 18에서 넉아웃되었습니다. 어레이의 균주 배경은 BY 47 41입니다. ACP one GFP 세포의 배양을 시작하려면, 5 mL의 하룻밤 배양한 ACP one GFP 배양액을 hiss 플레이트에 분주하십시오.화염이나 생물학적 흄 후드를 사용하여 플레이트를 충분히 건조시킵니다. 건조가 완료되면 플레이트를 30°C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 배양 후, 로봇을 사용하여 A CP one GFP 균주를 플레이트당 1,536개의 콜로니로 배열합니다.동시에, 복제 도말법(replica pinning)을 사용하여 DMA의 신선한 복사본을 4개의 YPDG 플레이트에 준비합니다. 그 후, 균주가 성장할 때까지 플레이트를 30 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. DMA를 복제 도말하고 콜로니를 YPD 플레이트에 덮어씌워 GFP를 발현하는 A CP 균주를 제작한 후, 플레이트를 30 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다.SD hiss G four 18 플레이트에 복제 도말하여 배양한 후, 전개된 세포를 선택하기 위해 플레이트를 30 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 포자 형성 및 발아를 시작하기 위해, 먼저 이배체를 YPDG four 18 플레이트에 복제 도말하여 다음 단계의 포자 형성 효율을 높입니다. 30 °C에서 하루 동안 배양한 후, 감수분열 포자의 형성을 유도하기 위해 탄소 및 질소원 수준을 낮춘 강화 포자 형성 배지에 이배체를 복제 도말합니다.다음으로, 플레이트를 25 °C에서 최소 5일 동안 배양합니다. 배양 후, 콜로니를 LRK 배지로 복제 도말하여 감수분열 자손인 매트를 발아시킵니다. 이 배지는 포자로부터 태블릿 세포의 발아를 유도하며, GFP 대립유전자와 단일 돌연변이 대립유전자를 모두 가진 세포를 선별하기 위해 플레이트를 30 °C에서 2일 동안 배양합니다.Matt A 세포를 lade G four 18 배지에서 복제 도말하여 유전자 결실을 보유한 haplo 세포를 선별하고, 이 플레이트들을 30 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음으로, mat a 감수분열 자손을 L-H-R-K-G four 18 배지에 복제 도말하여 ACP one GFP를 함께 보유한 단일 돌연변이체의 성장을 선별하며, 30 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다.그 후 플레이트를 4 °C에서 최대 3개월 동안 보관할 수 있습니다. 플레이트에서 CP one GFP를 발현하는 원하는 돌연변이체를 직접 시각화하려면, 먼저 플레이트에서 원하는 콜로니를 분리하십시오. 해당 세포를 30 °C의 YPD 또는 SD hiss 배지에서 초기 로그 단계까지 배양하십시오.마지막으로, GFP 필터 세트가 장착된 공초점 현미경을 사용하여 돌연변이체를 시각화합니다. 이 공초점 이미지에서는 미토콘드리아 형태를 연구하기 위해 ACP one GFP 마커를 가진 돌연변이체와 야생형을 공초점 현미경으로 시각화하였습니다. 이 특정 돌연변이체는 파괴된 미토콘드리아 표현형을 나타내므로 추가 연구를 위한 적절한 후보가 됩니다. 우리는 로봇 시스템을 사용하여 결실 돌연변이 어레이에 다클론 마커인 ACP one GFP를 효율적으로 도입하는 방법을 보여드렸습니다.이 절차를 수행할 때는 배지를 새로 제조하고 플레이트가 충분히 건조될 수 있도록 시간을 두는 것이 중요합니다. 습기가 너무 많으면 응결수가 형성되어 오염 가능성이 높아집니다. 또한, 모든 선택 배지가 정확하게 제조되었는지 다시 한번 확인해야 하며, 이는 본 프로토콜에서 매우 중요한 사항입니다.이 절차는 다른 유형의 마커에도 사용할 수 있습니다. 예를 들어, ER을 시각화하기 위해 본 연구실에서는 일상적으로 air 11 및 GSP 마커를 사용합니다. 이것으로 모든 과정을 마칩니다.시청해주셔서 감사합니다. 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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