세계 S. cerevisiae의에서 organelle 형태를 연구하기 위해 높은 처리량 방법

이 절차는 먼저 세포주를 배양한 다음 새로운 플레이트에 어레이를 핀으로 찍어내어 CP one GFP 어레이를 준비하는 것으로 시작합니다. 동시에 DMA의 신선한 복사본을 준비합니다. 다음으로 ACP one GFP 어레이를 DMA와 교배시키고 이배체를 선택하며, 이후 이를 포자 형성 배지에서 포자 형성시킵니다.

5일 후, Myotic 자손을 LRK 배지에서 발아시키며, 여기에서는 MAT A 반수체만 성장합니다. 두 번의 추가 선택 과정을 통해, ACP one GFP와 can mycin 유전자가 결손된 반수체 세포를 회수합니다. 마지막으로, 플레이트에서 개별 균주를 직접 선택하여 공초점 현미경으로 미토콘드리아 형태를 관찰할 수 있습니다.

안녕하세요, 저는 브리티시 컬럼비아 대학교 생명과학연구소 세포 및 발생생물학과의 Law 연구실 소속 Chap T입니다. 안녕하세요, 저도 Law 연구실의 Jesse Chao입니다. 오늘은 로봇 시스템을 이용하여 효모의 다양한 돌연변이 배경에 GFP 마커를 도입하는 고처리량 방법을 보여드리겠습니다.

본 실험실에서는 D, 소포체 및 미토콘드리아와 같은 세포소기관의 형태를 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다. 그럼 시작하겠습니다. 본 프로토콜에서는 두 가지 서로 다른 효모 균주를 사용합니다.

CP one GFP는 ACP one의 C 말단에 GFP 태그가 붙은 균주로, 플라스미드 PKT 1 28을 이용한 PCR 매개 상동 재조합을 통해 생성되었습니다. 균주 배경은 BY 7 0 4 3입니다. 또한, 비필수 유전자의 결실 돌연변이 약 5, 000종으로 구성된 어레이인 DMA 균주 또는 결실 돌연변이 어레이(deletion mutant array)를 사용합니다.

이 모든 비필수 유전자들은 G four 18에서 넉아웃되었습니다. 어레이의 균주 배경은 BY 47 41입니다. ACP one GFP 세포의 배양을 시작하려면, 5 mL의 하룻밤 배양한 ACP one GFP 배양액을 hiss 플레이트에 분주하십시오.

화염이나 생물학적 흄 후드를 사용하여 플레이트를 충분히 건조시킵니다. 건조가 완료되면 플레이트를 30°C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 배양 후, 로봇을 사용하여 A CP one GFP 균주를 플레이트당 1,536개의 콜로니로 배열합니다.

동시에, 복제 도말법(replica pinning)을 사용하여 DMA의 신선한 복사본을 4개의 YPDG 플레이트에 준비합니다. 그 후, 균주가 성장할 때까지 플레이트를 30 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. DMA를 복제 도말하고 콜로니를 YPD 플레이트에 덮어씌워 GFP를 발현하는 A CP 균주를 제작한 후, 플레이트를 30 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다.

SD hiss G four 18 플레이트에 복제 도말하여 배양한 후, 전개된 세포를 선택하기 위해 플레이트를 30 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 포자 형성 및 발아를 시작하기 위해, 먼저 이배체를 YPDG four 18 플레이트에 복제 도말하여 다음 단계의 포자 형성 효율을 높입니다. 30 °C에서 하루 동안 배양한 후, 감수분열 포자의 형성을 유도하기 위해 탄소 및 질소원 수준을 낮춘 강화 포자 형성 배지에 이배체를 복제 도말합니다.

다음으로, 플레이트를 25 °C에서 최소 5일 동안 배양합니다. 배양 후, 콜로니를 LRK 배지로 복제 도말하여 감수분열 자손인 매트를 발아시킵니다. 이 배지는 포자로부터 태블릿 세포의 발아를 유도하며, GFP 대립유전자와 단일 돌연변이 대립유전자를 모두 가진 세포를 선별하기 위해 플레이트를 30 °C에서 2일 동안 배양합니다.

Matt A 세포를 lade G four 18 배지에서 복제 도말하여 유전자 결실을 보유한 haplo 세포를 선별하고, 이 플레이트들을 30 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음으로, mat a 감수분열 자손을 L-H-R-K-G four 18 배지에 복제 도말하여 ACP one GFP를 함께 보유한 단일 돌연변이체의 성장을 선별하며, 30 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다.

그 후 플레이트를 4 °C에서 최대 3개월 동안 보관할 수 있습니다. 플레이트에서 CP one GFP를 발현하는 원하는 돌연변이체를 직접 시각화하려면, 먼저 플레이트에서 원하는 콜로니를 분리하십시오. 해당 세포를 30 °C의 YPD 또는 SD hiss 배지에서 초기 로그 단계까지 배양하십시오.

마지막으로, GFP 필터 세트가 장착된 공초점 현미경을 사용하여 돌연변이체를 시각화합니다. 이 공초점 이미지에서는 미토콘드리아 형태를 연구하기 위해 ACP one GFP 마커를 가진 돌연변이체와 야생형을 공초점 현미경으로 시각화하였습니다. 이 특정 돌연변이체는 파괴된 미토콘드리아 표현형을 나타내므로 추가 연구를 위한 적절한 후보가 됩니다. 우리는 로봇 시스템을 사용하여 결실 돌연변이 어레이에 다클론 마커인 ACP one GFP를 효율적으로 도입하는 방법을 보여드렸습니다.

이 절차를 수행할 때는 배지를 새로 제조하고 플레이트가 충분히 건조될 수 있도록 시간을 두는 것이 중요합니다. 습기가 너무 많으면 응결수가 형성되어 오염 가능성이 높아집니다. 또한, 모든 선택 배지가 정확하게 제조되었는지 다시 한번 확인해야 하며, 이는 본 프로토콜에서 매우 중요한 사항입니다.

이 절차는 다른 유형의 마커에도 사용할 수 있습니다. 예를 들어, ER을 시각화하기 위해 본 연구실에서는 일상적으로 air 11 및 GSP 마커를 사용합니다. 이것으로 모든 과정을 마칩니다.

시청해주셔서 감사합니다. 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.