Zebrafish 전체 마운트 고해상도 더블 형광등 현장에서 하이브 리다이 제이션

이 절차를 통해 제브라피쉬 배아의 유전자 발현 패턴을 고해상도로 결정할 수 있으며, 안티센스 ribo probe를 상보적인 표적 mRNA에 하이브리드화합니다. 라벨링된 Ribo probe는 peroxidase 효소와 결합된 항체에 의해 인식됩니다. embryo에 aramide 결합 fluoro four를 첨가하면 peroxidase가 IDE를 매우 반응성이 높은 화합물로 전환합니다. 이는 fluoro four의 안정적인 침전으로 이어지며, 결합되지 않은 IDE는 세척되어 제거됨으로써 mRNA 분포의 세밀한 세포 내 패턴이 드러납니다.

뚜렷하게 표지된 프로브와 다른 티로움 형광 표지자(tyrom fluoro four)를 사용하면 두 번째 유전자의 발현을 관찰할 수 있어, 발현 양상을 상세하게 비교할 수 있습니다. 안녕하세요, 저는 예일 대학교 분자 세포 및 발생 생물학과의 Scott Holly 교수 연구실 소속 Tim Brent입니다. 오늘은 제브라피쉬 배아를 대상으로 한 전장 고해상도 이중 형광 인시튜 하이브리다이제이션(whole mount high resolution double fluorescent in situ hybridization) 절차를 보여드리겠습니다.

이 절차를 통해 제브라피쉬의 분절화를 연구합니다. 이제 시작하겠습니다. 파라포름알데히드 용액 내의 냉장 상태에서 하룻밤 동안 고정된 배아를 사용하여 절차를 시작하십시오.

성공적인 염색을 위해서는 이번 고정 과정에 갓 해동한 파라포름알데히드(paraformaldehyde) 스톡을 사용하는 것이 매우 중요합니다. 고정액을 제거하고 실온의 PBS에서 배아를 5분씩 두 번 세척하십시오. 그다음, 배아의 난막(chorion)을 제거하십시오.

배아를 유리 오목 플레이트에 놓습니다. 이때부터는 시계 수리용 핀셋을 사용하여 코리안(Corian)을 제거합니다. 화염 연마된 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 배아를 옮깁니다.

그렇지 않으면 배아가 일반 폴리프로필렌 팁에 달라붙게 됩니다. 탈염소 처리된 배아는 메탄올 농도를 점차 높여가며 일련의 세척 과정을 통해 옮겨집니다. 마지막 세척은 100% methanol에서 수행합니다.

마지막으로, 배아를 신선한 methanol에 넣고 -20 °C에서 하룻밤 동안 보관합니다. 다음 날, methanol 농도를 점차 낮추어 가며 일련의 세척 과정을 거친 후, PBST buffer로 5분씩 두 번 세척하여 배아를 옮깁니다. 그 다음, para formaldehyde를 사용하여 배아를 20분 동안 고정합니다.

PBST로 5분씩 2회 세척하여 짧은 고정 과정을 마칩니다. 이제 배아의 투과화 단계로 넘어갑니다. 고정된 배아를 protein ACE K와 함께 배양하여 투과성을 부여합니다. 이때 마이크로 원심분리 튜브를 옆으로 눕혀 놓으십시오.

소화 단계의 소요 시간은 배아의 연령에 따라 달라집니다. 예를 들어, 체절 형성 단계(somato agenesis stage)의 배아는 3~4분 동안 배양합니다. PBST로 짧게 헹군 후, PBST에서 5분 동안 한 번 세척합니다.

배아를 파라포름알데히드(paraformaldehyde)로 고정합니다. 마지막으로 배아를 PBST로 5분 동안 두 번 세척합니다. 이제 배아를 RNA 프로브로 하이브리드화할 준비가 되었습니다.

배아의 고정 및 투과화가 완료되었으므로, 65°C에서 5분간 high minus 배양을 통해 하이브리드화 과정을 시작합니다. 사용 전 HIIN 용액을 미리 가열하십시오. 그다음, 배아를 high plus에서 1시간 동안 배양합니다.

다시 한번, high plus 용액을 미리 가열해 두어야 함을 기억하십시오. 이제 hip plus 용액의 대부분을 제거하되, 배아가 완전히 잠기도록 50 µL는 남겨둡니다. 각 프로브를 1 µL씩 첨가하고 튜브를 가볍게 튕겨 섞어줍니다.

지금부터 튜브를 알루미늄 호일로 덮어줍니다. 플루오레세인은 빛에 민감하므로 65 °C에서 하룻밤 동안 배양하여 하이브리드화를 완료합니다. 이제 과잉 프로브를 제거하겠습니다.

염색 효율을 높이기 위해 계면활성제를 제거합니다. 다만, 계면활성제가 없으면 배아가 끈적거릴 수 있음에 유의하십시오. 50% form amide 2 XSSC 용액으로 30분씩 2회 세척합니다.

15분 동안 2X SSC 용액으로 한 번 세척합니다. 마지막으로 0.2X SSC로 각 30분씩 두 번 세척합니다. 다음으로, 각 프로브를 시각화하겠습니다.

이제 하이브리드화된 프로브의 검출을 시작할 수 있습니다. 플루오레세인 프로브가 dig-oxygen 프로브보다 덜 안정적이고 신호가 약하므로 플루오레세인 프로브를 먼저 검출하십시오. 먼저 maleic acid 완충액에 2% 차단 시약을 500 µL 섞어 실온에서 1시간 동안 블로킹합니다.

다음으로, 블로킹 용액으로 1:500으로 희석한 peroxidase 결합 anti-fluorescein 항체를 첨가합니다. 4 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 이때 마이크로 원심분리 튜브를 옆으로 눕혀 놓아야 합니다.

다음으로, fluoro four가 결합된 TSA TYROM IDE 또는 tyrom 신호 증폭 시스템을 사용하여 검출을 시작합니다. 항체에 부착된 horse radish peroxidase는 TY IDE를 반응성이 매우 높은 중간체로 전환합니다. 이 반응성 TY IDE는 항체와 매우 가까운 위치에 있는 잔기들과 공유 결합을 형성하여, fluoro four가 국소적으로 침착되게 합니다.

상온에서 1x 말레산 완충액으로 20분씩 4회 세척한 후, PBS로 2회 세척하십시오. 형광 TY IDE는 보관을 위해 이전에 DMSO에 용해시켜 두었습니다. 이 TSA 기질을 짧게 원심 분리하십시오.

다음으로, TSA 기질을 증폭 희석 버퍼에 1:50 비율로 희석합니다. 해당 용액을 배아에 첨가하고 45분 동안 배양합니다. 마이크로 원심분리 튜브를 옆으로 눕혀 둡니다.

이 배양 단계 동안, 메탄올 농도를 점진적으로 높여가며 10분씩 여러 번 세척 과정을 거쳐 배아를 전이합니다. 마지막 세척은 100% Methanol에서 10분 동안 수행하며, 항체의 peroxidase를 불활성화하기 위해 1% hydrogen peroxide 용액에서 30분 동안 배양합니다. 그렇지 않으면 dig oxygen in의 검출을 방해할 수 있습니다.

배아를 점진적으로 농도가 낮아지는 일련의 메탄올 세척 단계와 10분간 두 차례의 PBS 버퍼 세척 과정을 통해 프로브를 전이시킵니다. 이는 모든 메탄올이 완전히 제거되도록 하기 위함입니다. digoxigen 및 프로브의 항체 표지는 이전 항체 단계와 마찬가지로 블로킹(blocking)부터 시작합니다.

다음으로, anti dig oxy genin 항체를 1:1000로 희석하여 첨가합니다. 마이크로 원심분리 튜브를 눕힌 상태로 차가운 곳에서 하룻밤 동안 배양하고 다음 날 꺼냅니다. 실온에서 maleic acid 완충액으로 세척합니다.

그 다음 PBS로 빠르게 세척한 후, SCI five tyrom 기질을 준비합니다. 이를 1:50으로 희석하여 배아에 첨가합니다. 튜브를 옆으로 눕힌 상태로 45분 동안 배양합니다.

마지막으로, PBST로 3회 세척합니다. prop iodide를 이용한 최종 염색 단계로 핵을 표지합니다. 우선 2 XSSC로 5분씩 2회 세척을 수행하십시오.

다음으로 37°C에서 30분 동안 RNA로 처리합니다. 상온의 2 XSSC로 6회 세척한 후, propidium iodide 용액을 첨가하여 8분 동안 염색합니다. 2 XSSC로 6회 세척합니다.

배아를 파라포름알데히드(paraformaldehyde)로 20분 동안 고정합니다. 마지막으로, PBST로 5분씩 두 번 세척합니다. 관찰을 위한 배아 마운팅은 25% 및 50% 글리세롤(glycerol)에서 각각 10분 동안 두 번 배양하는 것으로 시작합니다.

다음으로, 샘플을 75% glycerol에 넣고 4 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 이 하룻밤 동안의 투명화 단계는 배아의 해부를 용이하게 합니다. 마지막으로, 배아에서 난황을 해부하여 제거합니다.

배경 형광을 줄이기 위해 배아를 현미경 슬라이드 위에 평평하게 고정하고 현미경으로 관찰하십시오. 이 이미지들은 10 somite 단계의 제브라피쉬 배아 후단부를 통과하는 단일 공초점 절편을 보여줍니다. 붉은색 염색은 digoxigenin으로 표지된 프로브와 TSA 시약을 사용하여 검출한 delta C mRNA를 나타냅니다.

녹색 염색은 fluorescein 표지 프로브로 검출된 her one mRNA를 나타냅니다. 그리고 TSA fluorescein 시약으로, propidium iodide로 염색된 핵은 이중 염색된 배아에서 청색으로 나타납니다.

독립적이거나 중첩되는 발현 영역을 명확하게 결정할 수 있습니다. 또한 이 과정은 다음과 같은 하이브리다이제이션 염색의 확대 이미지에서 볼 수 있듯이 mRNA의 세포 내 위치를 보여줍니다. 핵 내의 염색 점들은 해당 유전자의 활발한 전사를 나타냅니다.

다른 세포들은 mRNA의 세포질 국소화를 나타냅니다. 이중 염색된 배아에서는 두 유전자를 모두 전사하거나 어느 한 유전자만 전사하는 세포들을 관찰할 수 있습니다.

별도로, 저희는 제브라피시 배아의 전장 고해상도 이중 형광 인시튜 하이브리드화(fluorescent in situ hybridization) 수행 방법을 보여드렸습니다. 이 절차를 수행할 때 중요한 점은, 먼저 표준 알칼리성 포스파타아제(alkaline phosphatase) 매개 염색을 통해 프로브를 테스트한다는 것입니다. 깨끗하고 강한 신호를 나타내는 프로브는 형광 인시튜 하이브리드화에서도 잘 작동할 것입니다.

우리는 또한 프로피듐 요오드(propidium iodide) 염색 대신 beta catenin의 면역 국소화(immuno localization)를 성공적으로 사용했습니다. 이 변형법을 수행할 때는 하이브리드화 반응을 65°C 대신 55°C에서 진행합니다. 이것으로 모든 과정을 마칩니다.

시청해주셔서 감사하며, 실험에서 좋은 결과 있으시길 바랍니다.