Name: Zebrafish 전체 마운트 고해상도 더블 형광등 현장에서 하이브 리다이 제이션 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-03-25T00:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 31 s
Description: 배우세요 제브라피쉬 배아에서 고해상도 이중 형광 현장 하이브리다이제이션을 이용한 유전자 발현 패턴 분석 방법입니다. 이 기술은 두 유전자의 발현 영역 중첩을 정확히 확인하여 발달생물학 연구에 필수적인 도구를 제공합니다.

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우리는이 프로토콜을 개발 Dörthe Jülich, 제니퍼 라운드와 앤드류 마라의 기여를 인정하고 싶습니다. NICHD, 미국의 암 사회와 천의 월에서 제공하는 연구 지원합니다.

1. 정치 <ol><li> 4 박 배아 ° C PBS에 4 % paraformaldehyde (PFA)와. 문제를 해결 </li><li> 삭제 수정하고 실온 (RT)에서 2 X PBS 5 분 각각 씻으십시오. </li><li> 시계 제조인의 집게를 사용하여 유리 우울증 플레이트의 PBS에서 수동으로 dechorionate 배아. 그들은 폴리 프로필렌의 pipettes에 충실 수 있으므로 dechorionation 후, 배아는 불을 광택 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 전송됩니다. </li><li> 오분 각 25 %의 일련의 50 %와 PBS의 75 % 메탄올을 통해 배아를 전송합니다. </li><li> 100 % 메탄올로 액체를 교체, 새로운 메탄올로 교체 후 5 분 부화합니다. </li><li> 1 시간 최소 -20 ° C에서 장소 배아. (우리는 일반적으로 현장 하이브 리다이 제이션의 표준은 년 이상 보관 배아에서 작동합니다. 하룻밤 배아를 품어,하지만 우리는 현장 하이브리드화에 형광의 높은 해상도가 장기간 보관하여 분실 여부를 검사하지 않았습니다.) </li><li> 75 % 오분 각각 50 %, RT에서 PBST에서 25 %의 메탄올을위한 배아를 씻으십시오. RT에서 오분 PBST에서 각각에 대해 두 번 씻으십시오. </li><li> RT에서 PBS에 4퍼센트 PFA에 20 분 다시 수정. </li><li> RT에서 오분 PBST에서 각각에 대해 두 번 씻으십시오. </li></ol> PFA에 관한 참고 : 우리는 (시약의 표 참조) -20 º C에서 aliquots에 4% PFA를 저장합니다. 초기 고정을 위해, 우리는 이전에 해동 적이있다는 PFA를 사용합니다. 이후 fixations 들어, 우리는 종종 이전 해동했다는 PFA를 사용합니다. 초기 고정이 절차를 성공적으로 얼룩을 위해 중요한 것 같습니다. 2. PROTEINASE 및 POSTFIXATION <ol><li> 배아를 permeabilize하는 3~12분에 대한 RT에서 proteinase K (PBST에 5μg/ml)와 다이제스트. (부화 시간은 젊은 단계 더 구분으로 태아의 나이에 따라 달라집니다. 또한 효소의 배치에 따라 다릅니다.) somitogenesis 스테이지 배아의, 우리가 일반적으로 3~4분에 대한 permeabilize. 이 부화하는 동안, 우리는 측면에 microcentrifuge 관하다. </li><li> PBST에서 잠시 씻어 ​​PBST로 5 분 한 번 씻는다. </li><li> RT에서 PBS에 4퍼센트 PFA에 20 분 다시 수정. </li><li> RT에서 PBST로 5 분 각각 두 번 씻으십시오. </li></ol> 3. PREHYBRIDIZATION <ol><li> 65 º C에서 5 분 동안 태아를 품어 HYB -. </li><li> HYB에 최소한 1 시간 동안 65 º C에서 Prehybridize +. </li></ol> 4. 이종 교잡 <ol><li> 제외한 모든 preHYB 50 μl를 제거하지만, 완전히 빠져들 배아를 보관해야합니다. </li><li> 부드럽게 튜브 flicking하여 배아와 혼합 각 riboprobe 1-2 μl (digoxygenin 및 플루오레신 - 레이블 riboprobes)를 추가합니다. 프로브의 양은 일반적으로 20μl 프로브 합성 반응에서 1 2μl입니다. </li><li> 플루오레신가 빛을 민감한 것을 감안할 때, 튜브는 알루미늄 호일에 싸서 또는 기타이 시점에서 최소한의 빛에 노출되어야합니다. </li><li> 65 º C.에서 하룻밤 배아를 품어 </li></ol> 5. 프로브 제거 참고이 시점 전달 부족 세제의 솔루션을 제공합니다. 세제의 제거는 얼룩 반응을 도와 나타나지만 배아는 오히려 끈적이 될 원인 않습니다. <ol><li> riboprobe를 제거합니다. </li><li> 50 % formamide/2xSSC 65 º C에서 2 X 30 분 씻으십시오. </li><li> 2 X SSC 65 º C에서 15 분 동안 씻으십시오. </li><li> 0.2 X SSC 65 º C 30 분 씻으십시오. </li></ol> 6. 안티 플루오레신 항체 보육 <ol><li> 1X maleic 산성 버퍼 플러스 2% 차단 시약 (시약의 표 참조)의 솔루션을 500μl의 RT 적어도 1 시간 차단합니다. </li><li> 차단 솔루션의 1:500 희석에로 로체가 제공하는 안티 - 플루오레신 - POD 항체를, 추가합니다. </li><li> 4 º C.에 밤새 품어 이 부화하는 동안, 우리는 측면에 microcentrifuge 관하다. </li><li> 1X maleic 산성 버퍼 4 X 20 분 씻으십시오. 오분 PBS에서 각각에 대해 두 번 씻으십시오. </li></ol> 7. 플루오레신 - LABELLED 프로브 탐지 <ol><li> TSA 플러스 플루오레신 솔루션 30-60분을 품어. (반응하십시오. 얼룩 솔루션을하기 전에 TSA 기판 스핀 다운 tyramide 시약에게 퍼어킨 엘머 증폭 희석제 버퍼에 1시 50분을 희석.)이 부화하는 동안, 우리는 측면에 microcentrifuge 관하다. 반응 시간은 각 프로브에 대해 경험적으로 결정되어야합니다. 불행히도, 얼룩 반응은 기판이 형광 그대로 시각적으로 모니터링할 수 없으며, 하나는 얼룩 반응에 걸쳐 유비 쿼터스 녹색 형광을 볼 수 있습니다. </li><li> 30 %, 50 %, 75 % 및 PBS의 100 % 메탄올 10 분만에 각 씻으십시오. </li><li> 첫 번째 퍼옥시데이즈를 inactivate 30 분 메탄올에 1% H 2의 해결책 0 2에서 품어. </li><li> 75 % 50 % PBS에 30 % 메탄올 10 분만에 각 씻으십시오. 다음 십분 PBS에서 각각에 대해 두 번 씻는다. 그것은 중요하다는 것을 충족의 모든hanol이 제거됩니다. </li></ol> TYRAMIDE 신호 증폭주의 사항 : 우리는 퍼어킨 엘머 TSA 키트를 사용하여왔다. 우리는 알렉사 - Tyramide 기판은 퍼어킨 엘머 증폭 희석제 버퍼를 사용하여 잘 얼룩 발견하지만, 우리는 Invitrogen / 분자 프로브 키트와 함께 제공되는 얼룩 버퍼를 사용하여 성공을 없었어요. 마지막으로, 우리는 플루오레신와 알렉사 - 647은 영향을받지있는 동안 Cy5 형광이 이후 메탄올 / H 2 O 2 치료에 의해 ​​제거 것으로 나타났습니다. Cy3 또한 부정적인 그것이 구조적으로 관련되어 Cy5로 메탄올 / H 2 O 2 치료에 의해 ​​영향을받을 수 있습니다. 이러한 이유로, Cy3과 Cy5 TSA 반응은 현장 프로토콜에서 두 형광의 두 번째 얼룩 반응을 위해 사용해야합니다. 8. 안티 Digoxygenin 항체 인큐베이션 <ol><li> 1X maleic 산성 버퍼 플러스 2% 차단 시약의 용액에 RT 적어도 1 시간 동안 다시 배아를 차단합니다. </li><li> 위의 솔루션을 차단에서 1:1000 희석에 로체 제공한으로 방지 발굴 POD 항체 추가 </li><li> 4 º C.에 밤새 품어 이 부화하는 동안, 우리는 측면에 microcentrifuge 관하다. </li><li> 1X maleic 산성 버퍼 4 X 20 분 씻으십시오. 오분 PBS에서 각각에 대해 두 번 씻으십시오. </li></ol> 9. Digoxygenin - LABELLED 프로브 탐지 <ol><li> (얼룩 솔루션을하기 전에 TSA 기판 스핀 다운. 반응의 경우, 증폭 희석제 버퍼에 tyramide 시약 1시 50분을 희석) TSA에 30~60분 플러스 Cy5 솔루션을 품어이 부화하는 동안, 우리는 측면에 microcentrifuge 관하다. 반응 시간은 각 프로브에 대해 경험적으로 결정되어야합니다. </li><li> 십분 PBST 각 세 번 씻으십시오. </li></ol> 10. PROPIDIUM의 요오드화물 얼룩 <ol><li> 오분 2 X SSC에 각각에 대해 두 번 씻으십시오. </li><li> 37 30 분 배아를 품어 ° 10 μl RNAse (100μg/ml의 최종 농도에 대한)과 함께 50 μl 2 X SSCT에서 C. </li><li> 삼분 RT에서 2 X SSC에 각 6 번 씻으십시오. </li><li> 2 X SSC에 330μg/ml propidium 요오드화물의의 솔루션에 8 분 동안 배아를 얼룩. </li><li> 삼분 RT에서 2 X SSC에 각 6 번 씻으십시오. </li><li> RT에서 PBS에 4퍼센트 PFA에 20 분 수정. </li><li> RT에서 PBST로 5 분 각각 두 번 씻으십시오. </li></ol> 11. 설치 <ol><li> 십분 25% 각과 PBST에 50 % 글리세롤을위한 배아를 품어. 4 º C.에 75 % 글리세롤에서 하룻밤 지우기 </li><li> 우리는 해부하다와 deyolk 배아과 평면 현미경 슬라이드에 그들을 탑재합니다. 난황은 상당한 배경 형광을 생성할 수 있습니다. 절개는 배아가 gylcerol에 ovenight 해제 후 훨씬 쉽습니다. </li></ol> 솔루션 : <table border="1"><tbody><tr><td> PBST </td><td> PBS 플러스 0.1 % 트윈 </td><td></td></tr><tr><td> SSCT </td><td> SSC 플러스 0.1 % 트윈 </td><td></td></tr><tr><td> HYB - </td><td> 50 % 포름 아미드 5xSSC 0.1 % 트윈 - 20 </td><td></td></tr><tr><td> HYB + </td><td> HYB - 5mg/ml torula (효모) RNA 50μg/ml 헤파린 </td><td style="width: 300px;"> torula RNA는 RNA로의 proteinase K의 소화에 의해 준비가되어 이후 페놀 -, 페놀 - 클로로포름 - 및 클로로포름 - extraction.The RNA가 시켰던 및 DEPC - 처리된 물속에 녹아있다. </td></tr><tr><td> 1 X maleic 산성 버퍼 </td><td> 150mM maleic 산, 100mM NaCl (산도 7.5) </td><td></td></tr></tbody></table><img src="/files/ftp_upload/1229/Brend_Holley_Fig1.png" alt="그림 1" width="600" height="688" /> 그림 1. 원위치 하이브리드화의 전체 마운트 대표 결과가 이중 형광. (AC). 이미지는 10 - 체절 단계에서 zebrafish 배아의 후부 지역을 통해 하나의 공촛점 섹션을 표시합니다. 보기 맨 앞쪽에와 지느러미입니다. propidium 요오드화물의와 핵의 얼룩진 색 파란색입니다. (A) deltaC의 mRNA는 digoxygenin - 표시 riboprobe 및 TSA - Cy5 시약을 사용하여 검색했습니다. (B) her1 유전자의 mRNA 베꼈는데 것은 플루오레신 - 표시 riboprobe 및 TSA - 플루오레신 시약과 함께 발견되었다. (C) 녹색과 적색 채널을 병합하면 unambiguously 두 유전자의 서로 다른 또는 중복 유전자의 표현의 영역을 식별합니다. (D, E) her1 표현의 상세는이 절차의 높은 해상도를 보여주는. mRNA의 Subcellular 지방화 명확하게 분별 수 있습니다. 화살촉은 핵에 얼룩의 점에 의해 밝혀 적극적인 전송을 전시 세포를 나타냅니다. 화살표는 mRNA의 세포질 지방화를 보여주는 세포를 나타냅니다. her1 및 deltaC에 대한 (F, G) 더블 얼룩이 두 유전자 (흰색 화살촉) 또는 별도로 유전자 (빨간색과 녹색 화살촉) 중 하나를 해독 아르 세포를 보여줍니다.

<ol><li>Schulte-Merker, S., Ho, R. K., Herrmann, B. G., Nüsslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+protein+product+of+the+zebrafish+homologue+of+the+mouse+T-gene+is+expressed+in+nuclie+of+the+germ+ring+and+the+notochord+of+the+early+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The protein product of the zebrafish homologue of the mouse T-gene is expressed in nuclie of the germ ring and the notochord of the early embryo.</a> Development. 116, 1021-1027 (1992).</li>
<li>Jowett, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double+in+situ+hybridization+techniques+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Double in situ hybridization techniques in zebrafish.</a> Methods. 23, 345-358 (2001).</li>
<li>Jülich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((beamter%2FdeltaC+and+the+role+of+Notch+ligands+in+the+zebrafish+somite+segmentation%2C+hindbrain+neurogenesis+and+hypochord+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">beamter/deltaC and the role of Notch ligands in the zebrafish somite segmentation, hindbrain neurogenesis and hypochord differentiation.</a> Dev Biol. 286, 391-404 (2005).</li>
<li>Mara, A., Schroeder, J., Chalouni, C., Holley, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Priming%2C+Initiation+and+Synchronization+of+the+Segmentation+Clock+by+deltaD+and+deltaC%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Priming, Initiation and Synchronization of the Segmentation Clock by deltaD and deltaC.</a> Nat Cell Biol. 9, 523-530 (2007).</li>
<li>Lecuyer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+mRNA+localization+reveals+a+prominent+role+in+organizing+cellular+architecture+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Global analysis of mRNA localization reveals a prominent role in organizing cellular architecture and function.</a> Cell. 131, 174-187 (2007).</li>
</ol>

여기에 제시된 프로토콜은 일반적인 알칼라인 포스파타아제 매개 반응에서 30-45분간 염색 후 깨끗하고 강한 신호를 나타내는 프로브에 효과적입니다. 형광 인시튜 하이브리다이제이션(fluorescent in situ hybridization) 프로토콜을 수행하기 전, 당사는 항상 표준 비형광 프로토콜(프로브 합성 프로토콜과 함께 보충 자료로 제공됨)을 사용하여 프로브를 테스트합니다. 신호가 약한 프로브를 사용할 때는 형광 인시튜 하이브리다이제이션 프로토콜의 성공률이 낮았으나, 일부 경우에는 가능할 수도 있습니다. 당사는 형광 인시튜 하이브리다이제이션 프로토콜을 β-catenin 3의 면역국소화(immunolocalization)와 성공적으로 결합하였습니다. 이 변형법을 수행할 때는 낮은 온도에서 에피토프가 더 잘 보존되는 것으로 보이므로, HYB-, HYB+ 및 하이브리다이제이션 배양을 65°C 대신 55°C에서 진행합니다. 면역국소화 배양은 TSA 반응 후에 수행합니다.
<p class="jove_co...

<table><tbody><tr><td>Paraformaldehyde 16% 용액, EM 등급</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td>1.33x PBS에서 4%로 희석(최종 1x). 2ml씩 분주하여 &amp;#8211;20&amp;#x00B0;C에 보관</td></tr><tr><td>Proteinase K, recombinant PCR 등급</td><td>Roche Group</td><td>03115879001</td><td>증류수에 20mg/ml 스톡 용액을 제조. 1ml씩 분주하여 &amp;#8211;20&amp;#x00B0;C에 보관</td></tr><tr><td>Blocking Reagent</td><td>Roche Group</td><td>11096176001</td><td>1x maleic acid 완충액으로 10% 스톡 용액을 제조. 50ml씩 분주하여 &amp;#8211;20&amp;#x00B0;C에 보관. 여러 번의 동결-해동 과정 후에도 안정함.</td></tr><tr><td>Anti-Fluorescein-POD, Fab fragments</td><td>Roche Group</td><td>11426346910</td><td>분주하여 -20&amp;#x00B0;C에 보관. 사용 중인 분주액 하나는 4&amp;#x00B0;C에 보관.</td></tr><tr><td>Anti-Digoxigenin-POD, Fab fragments</td><td>Roche Group</td><td>11207739910</td><td>위와 동일.</td></tr><tr><td>TSA Plus Fluorescein 시스템</td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>NEL741001KT</td><td>TSA 시약의 각 바이알은 필요할 때만 준비. 60&amp;#x03BC;l DMSO에 용해. 4&amp;#x00B0;C에 보관.</td></tr><tr><td>TSA Plus Cyanine5 시스템</td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>NEL745001KT</td><td>위와 동일</td></tr><tr><td>TSA Plus Cyanine3 시스템</td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>NEL744001KT</td><td>위와 동일</td></tr><tr><td>TSA Kit #16 AlexaFluor647 tyramide (plus HRP-goat-anti-rabbit IgG)</td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td>T20926</td><td>tyramide 시약을 150&amp;#x03BC;l DMSO에 용해한 후 분주하여 &amp;#8211;20&amp;#x00B0;C에 보관.</td></tr><tr><td>RNase, DNase free</td><td>Roche Group</td><td>11119915001</td><td>500&amp;#x03BC;g/ml 용액으로 공급됨</td></tr><tr><td>Propidium Iodide</td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td>P-3566</td><td>증류수에 1mg/ml 용액으로 공급됨.</td></tr></tbody></table>

zebrafish 전체 마운트 고해상도 더블 형광등 현장에서 하이브 리다이 제이션

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

전체 마운트<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브 리다이 제이션은 발달 생물학에서 가장 널리 사용되는 기법 중 하나입니다. 여기서 우리는 고해상도 이중 형광을 제시<em&gt; 현장에서</em단일 유전자의 정확한 표현 패턴을 분석하는 두 유전자의 표현 도메인의 중복을 결정&gt; 하이브리드화 프로토콜. 프로토콜은 표준의 수정된 버전입니다<em&gt; 현장에서</em알칼리성 인산 가수 분해 효소와 같은 NBT / BCIP 빠른 레드와 같은 기판을 사용하여&gt; 하이브 리다이 제이션<sup&gt; 1,2</sup&gt;. 이 프로토콜은 tyramide 신호 증폭 (TSA)과 함께 표준 digoxygenin 및 플루오레신 라벨 프로브를 활용<sup&gt; 3</sup&gt;. 상용 TSA 키트는 녹색에서 멀리 빨간색 형광 방출로 유연하게 실험적인 디자인이 같은 propidium 요오드화물 또는 단백질에 대한 형광 immunohistochemistry 등 다양한 핵 얼룩,와 함께 사용할 수 있습니다. TSA 빠르게 covalently 표시 안티 센스 riboprobe의 인근에 moieties, 일반적으로 티로신 잔류물에 바인딩 반응 형광 기판을 생산하고 있습니다. 그 결과 얼룩 패턴은 mRNA의 subcellular 지방화에 고해상도 아르는 공촛점 현미경을 스캐닝 레이저를 사용하여 관찰할 수<sup&gt; 3,4</sup&gt;. 하나는 염색체 loci에서 초기 기록을 관찰 핵 및 세포질 얼룩을 구분하여 mRNA의 대뇌 피질의 현지화 등 다른 패턴을 시각화 수 있습니다. 의 연구<em&gt; Drosophila</em&gt; mRNAs의 약 70 %가 자주 인코딩 단백질의 기능과 상관 관계 subcellular 지방화의 특정 패턴을 전시 것을 나타냅니다<sup&gt; 5</sup&gt;. 3D 공촛점 데이터 세트의 컴퓨터 지원 재건과 결합하면, 우리의 프로토콜은 전체 척추의 배아에서 하위 셀룰러 해상도 mRNA 분포의 상세한 분석을 수 있습니다.

현장 하이브리드화의 전체 마운트 발달 생물학에서 가장 널리 사용되는 기법 중 하나입니다. 여기, 우리는 단일 유전자의 정확한 표현 패턴을 분석하는 두 유전자의 표현 도메인의 중복을 결정하는 현장 하이브리드화 프로토콜을 두 번 형광 높은 해상도를 제시한다. 우리는 조직 조직을 강조하기 위해 propidium 요오드화물 핵 카운터 얼룩이 포함됩니다.

Zebrafish 전체 마운트 고해상도 더블 형광등 현장에서 하이브 리다이 제이션

전장 조직 인시투 하이브리다이제이션(Whole mount in situ hybridization)은 발생 생물학에서 가장 널리 사용되는 기술 중 하나입니다. 본 연구에서는 고해상도 이중...

이 절차를 통해 제브라피쉬 배아의 유전자 발현 패턴을 고해상도로 결정할 수 있으며, 안티센스 ribo probe를 상보적인 표적 mRNA에 하이브리드화합니다. 라벨링된 Ribo probe는 peroxidase 효소와 결합된 항체에 의해 인식됩니다. embryo에 aramide 결합 fluoro four를 첨가하면 peroxidase가 IDE를 매우 반응성이 높은 화합물로 전환합니다. 이는 fluoro four의 안정적인 침전으로 이어지며, 결합되지 않은 IDE는 세척되어 제거됨으로써 mRNA 분포의 세밀한 세포 내 패턴이 드러납니다.뚜렷하게 표지된 프로브와 다른 티로움 형광 표지자(tyrom fluoro four)를 사용하면 두 번째 유전자의 발현을 관찰할 수 있어, 발현 양상을 상세하게 비교할 수 있습니다. 안녕하세요, 저는 예일 대학교 분자 세포 및 발생 생물학과의 Scott Holly 교수 연구실 소속 Tim Brent입니다. 오늘은 제브라피쉬 배아를 대상으로 한 전장 고해상도 이중 형광 인시튜 하이브리다이제이션(whole mount high resolution double fluorescent in situ hybridization) 절차를 보여드리겠습니다.이 절차를 통해 제브라피쉬의 분절화를 연구합니다. 이제 시작하겠습니다. 파라포름알데히드 용액 내의 냉장 상태에서 하룻밤 동안 고정된 배아를 사용하여 절차를 시작하십시오.성공적인 염색을 위해서는 이번 고정 과정에 갓 해동한 파라포름알데히드(paraformaldehyde) 스톡을 사용하는 것이 매우 중요합니다. 고정액을 제거하고 실온의 PBS에서 배아를 5분씩 두 번 세척하십시오. 그다음, 배아의 난막(chorion)을 제거하십시오.배아를 유리 오목 플레이트에 놓습니다. 이때부터는 시계 수리용 핀셋을 사용하여 코리안(Corian)을 제거합니다. 화염 연마된 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 배아를 옮깁니다.그렇지 않으면 배아가 일반 폴리프로필렌 팁에 달라붙게 됩니다. 탈염소 처리된 배아는 메탄올 농도를 점차 높여가며 일련의 세척 과정을 통해 옮겨집니다. 마지막 세척은 100% methanol에서 수행합니다.마지막으로, 배아를 신선한 methanol에 넣고 -20 °C에서 하룻밤 동안 보관합니다. 다음 날, methanol 농도를 점차 낮추어 가며 일련의 세척 과정을 거친 후, PBST buffer로 5분씩 두 번 세척하여 배아를 옮깁니다. 그 다음, para formaldehyde를 사용하여 배아를 20분 동안 고정합니다.PBST로 5분씩 2회 세척하여 짧은 고정 과정을 마칩니다. 이제 배아의 투과화 단계로 넘어갑니다. 고정된 배아를 protein ACE K와 함께 배양하여 투과성을 부여합니다. 이때 마이크로 원심분리 튜브를 옆으로 눕혀 놓으십시오.소화 단계의 소요 시간은 배아의 연령에 따라 달라집니다. 예를 들어, 체절 형성 단계(somato agenesis stage)의 배아는 3~4분 동안 배양합니다. PBST로 짧게 헹군 후, PBST에서 5분 동안 한 번 세척합니다.배아를 파라포름알데히드(paraformaldehyde)로 고정합니다. 마지막으로 배아를 PBST로 5분 동안 두 번 세척합니다. 이제 배아를 RNA 프로브로 하이브리드화할 준비가 되었습니다.배아의 고정 및 투과화가 완료되었으므로, 65°C에서 5분간 high minus 배양을 통해 하이브리드화 과정을 시작합니다. 사용 전 HIIN 용액을 미리 가열하십시오. 그다음, 배아를 high plus에서 1시간 동안 배양합니다.다시 한번, high plus 용액을 미리 가열해 두어야 함을 기억하십시오. 이제 hip plus 용액의 대부분을 제거하되, 배아가 완전히 잠기도록 50 µL는 남겨둡니다. 각 프로브를 1 µL씩 첨가하고 튜브를 가볍게 튕겨 섞어줍니다.지금부터 튜브를 알루미늄 호일로 덮어줍니다. 플루오레세인은 빛에 민감하므로 65 °C에서 하룻밤 동안 배양하여 하이브리드화를 완료합니다. 이제 과잉 프로브를 제거하겠습니다.염색 효율을 높이기 위해 계면활성제를 제거합니다. 다만, 계면활성제가 없으면 배아가 끈적거릴 수 있음에 유의하십시오. 50% form amide 2 XSSC 용액으로 30분씩 2회 세척합니다.15분 동안 2X SSC 용액으로 한 번 세척합니다. 마지막으로 0.2X SSC로 각 30분씩 두 번 세척합니다. 다음으로, 각 프로브를 시각화하겠습니다.이제 하이브리드화된 프로브의 검출을 시작할 수 있습니다. 플루오레세인 프로브가 dig-oxygen 프로브보다 덜 안정적이고 신호가 약하므로 플루오레세인 프로브를 먼저 검출하십시오. 먼저 maleic acid 완충액에 2% 차단 시약을 500 µL 섞어 실온에서 1시간 동안 블로킹합니다.다음으로, 블로킹 용액으로 1:500으로 희석한 peroxidase 결합 anti-fluorescein 항체를 첨가합니다. 4 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 이때 마이크로 원심분리 튜브를 옆으로 눕혀 놓아야 합니다.다음으로, fluoro four가 결합된 TSA TYROM IDE 또는 tyrom 신호 증폭 시스템을 사용하여 검출을 시작합니다. 항체에 부착된 horse radish peroxidase는 TY IDE를 반응성이 매우 높은 중간체로 전환합니다. 이 반응성 TY IDE는 항체와 매우 가까운 위치에 있는 잔기들과 공유 결합을 형성하여, fluoro four가 국소적으로 침착되게 합니다.상온에서 1x 말레산 완충액으로 20분씩 4회 세척한 후, PBS로 2회 세척하십시오. 형광 TY IDE는 보관을 위해 이전에 DMSO에 용해시켜 두었습니다. 이 TSA 기질을 짧게 원심 분리하십시오.다음으로, TSA 기질을 증폭 희석 버퍼에 1:50 비율로 희석합니다. 해당 용액을 배아에 첨가하고 45분 동안 배양합니다. 마이크로 원심분리 튜브를 옆으로 눕혀 둡니다.이 배양 단계 동안, 메탄올 농도를 점진적으로 높여가며 10분씩 여러 번 세척 과정을 거쳐 배아를 전이합니다. 마지막 세척은 100% Methanol에서 10분 동안 수행하며, 항체의 peroxidase를 불활성화하기 위해 1% hydrogen peroxide 용액에서 30분 동안 배양합니다. 그렇지 않으면 dig oxygen in의 검출을 방해할 수 있습니다.배아를 점진적으로 농도가 낮아지는 일련의 메탄올 세척 단계와 10분간 두 차례의 PBS 버퍼 세척 과정을 통해 프로브를 전이시킵니다. 이는 모든 메탄올이 완전히 제거되도록 하기 위함입니다. digoxigen 및 프로브의 항체 표지는 이전 항체 단계와 마찬가지로 블로킹(blocking)부터 시작합니다.다음으로, anti dig oxy genin 항체를 1:1000로 희석하여 첨가합니다. 마이크로 원심분리 튜브를 눕힌 상태로 차가운 곳에서 하룻밤 동안 배양하고 다음 날 꺼냅니다. 실온에서 maleic acid 완충액으로 세척합니다.그 다음 PBS로 빠르게 세척한 후, SCI five tyrom 기질을 준비합니다. 이를 1:50으로 희석하여 배아에 첨가합니다. 튜브를 옆으로 눕힌 상태로 45분 동안 배양합니다.마지막으로, PBST로 3회 세척합니다. prop iodide를 이용한 최종 염색 단계로 핵을 표지합니다. 우선 2 XSSC로 5분씩 2회 세척을 수행하십시오.다음으로 37°C에서 30분 동안 RNA로 처리합니다. 상온의 2 XSSC로 6회 세척한 후, propidium iodide 용액을 첨가하여 8분 동안 염색합니다. 2 XSSC로 6회 세척합니다.배아를 파라포름알데히드(paraformaldehyde)로 20분 동안 고정합니다. 마지막으로, PBST로 5분씩 두 번 세척합니다. 관찰을 위한 배아 마운팅은 25% 및 50% 글리세롤(glycerol)에서 각각 10분 동안 두 번 배양하는 것으로 시작합니다.다음으로, 샘플을 75% glycerol에 넣고 4 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 이 하룻밤 동안의 투명화 단계는 배아의 해부를 용이하게 합니다. 마지막으로, 배아에서 난황을 해부하여 제거합니다.배경 형광을 줄이기 위해 배아를 현미경 슬라이드 위에 평평하게 고정하고 현미경으로 관찰하십시오. 이 이미지들은 10 somite 단계의 제브라피쉬 배아 후단부를 통과하는 단일 공초점 절편을 보여줍니다. 붉은색 염색은 digoxigenin으로 표지된 프로브와 TSA 시약을 사용하여 검출한 delta C mRNA를 나타냅니다.녹색 염색은 fluorescein 표지 프로브로 검출된 her one mRNA를 나타냅니다. 그리고 TSA fluorescein 시약으로, propidium iodide로 염색된 핵은 이중 염색된 배아에서 청색으로 나타납니다.독립적이거나 중첩되는 발현 영역을 명확하게 결정할 수 있습니다. 또한 이 과정은 다음과 같은 하이브리다이제이션 염색의 확대 이미지에서 볼 수 있듯이 mRNA의 세포 내 위치를 보여줍니다. 핵 내의 염색 점들은 해당 유전자의 활발한 전사를 나타냅니다.다른 세포들은 mRNA의 세포질 국소화를 나타냅니다. 이중 염색된 배아에서는 두 유전자를 모두 전사하거나 어느 한 유전자만 전사하는 세포들을 관찰할 수 있습니다.별도로, 저희는 제브라피시 배아의 전장 고해상도 이중 형광 인시튜 하이브리드화(fluorescent in situ hybridization) 수행 방법을 보여드렸습니다. 이 절차를 수행할 때 중요한 점은, 먼저 표준 알칼리성 포스파타아제(alkaline phosphatase) 매개 염색을 통해 프로브를 테스트한다는 것입니다. 깨끗하고 강한 신호를 나타내는 프로브는 형광 인시튜 하이브리드화에서도 잘 작동할 것입니다.우리는 또한 프로피듐 요오드(propidium iodide) 염색 대신 beta catenin의 면역 국소화(immuno localization)를 성공적으로 사용했습니다. 이 변형법을 수행할 때는 하이브리드화 반응을 65°C 대신 55°C에서 진행합니다. 이것으로 모든 과정을 마칩니다.시청해주셔서 감사하며, 실험에서 좋은 결과 있으시길 바랍니다.

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