Name: 단백질 Ubiquitination의 감지 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-19T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: 배우세요 단백질 유비퀴티네이션 검출 방법을 배양 세포와 시험관 내 실험에 적용하여 질병 관련 단백질 수정 연구에 활용하세요. 이 프로토콜은 면역침전 및 웨스턴 블롯팅 기법을 포함합니다.

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재생 의료 보조금 RS1 - 00331-1 캘리포니아 연구소 RL1 - 00682-1 (Z. 장에), 미국 파킨슨병이 작품은 NIH 보조금 RO1 DC006497, RO1 NS057289하고, PO1 ES016738 (Z. 장)를 지원했습니다 질병 협회 (Z. 장 및 YS 츄)을, 그리고 파킨슨병 연구에 대한 마이클 J. 폭스 재단 (Z. 장).

교양 세포에서 단백질의 ubiquitination 검색 <ol><li> 관심 단백질과 (에피토프 - 태그의 버전) ubiquitin을 표현 plasmids와 Transfect 교양 세포. </li><li> 전체 세포 용해 완충액 (2 % SDS, 150 MM NaCl, 10 MM 트리스 - HCL, pH를 8.0) 2mM 나트륨 orthovanadate, 50 MM 나트륨 불화, 그리고 프로 테아제 억제제와 함께.하십시오 </li><li> 접시 당 100 μl 세포 용해 완충액 (6cm 요리)와 세포를 Lyse. 큰 접시를 사용하는 경우, 적절하게 볼륨을 조절할 수 있습니다. 소용돌이는 음식을 신중하게 용해 버퍼가 성장 세포의 전체 영역을 커버하도록. </li><li> 휴대 스크레이퍼로 세포를 수집하고 1.5 ML eppendorf 튜브에 세포 lysates를 전송할 수 있습니다. 10 분 끓인 즉시 뜨거운 접시에 튜브를 놓습니다. </li><li> sonication 장치와 전단은 세포. </li><li> 희석 버퍼의 900ul (10 MM 트리스 - HCL, pH를 8.0, 150 MM NaCl, 2 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 1 %의 트리톤) 추가합니다. 회전 30-60 분 4 ° C에서 샘플을 품어. </li><li> 30 분 20,000 XG에서 희석 샘플을 스핀. 새로운 eppendorf 튜브에 뜨는 결과를 전송합니다. 펠렛을 방해하지 않도록주의하십시오. </li><li> 단백질 농도를 측정. </li><li> 호환 버퍼 (50 % 슬러리)의 목표 단백질에 대한 단백질 또는 G - 아가로 오스 비드 - 복합 항체를 준비합니다. P - 200 피펫 팁의 좁은 끝을 잘라 immunoprecipitation을위한 준비 세포 lysates의 500-1,500 μg에 수지 14-20 μl를 전송합니다. 높은 transfection 효율과 전지, 500 μg 충분합니다. 낮은 transfection 효율 세포에 대한 더 많은 단백질이 필요합니다. </li><li> ° C 하룻밤 회전 4 셀 lysate - 비드 혼합물을 품어. </li><li> 5 분 5,000 XG에 비즈를 스핀 다운. 뜨는을 대기음. 세탁 버퍼 (10 MM 트리스 - HCL, pH를 8.0, 1 M NaCl, 1 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 1 % NP - 40)가 두 번있는 수지를 씻으십시오. </li><li> 30 초에 대한 20,000 XG에서 마지막 시간 동안 비즈를 스핀. 잔여 세척 버퍼를 기음과 2X SDS 로딩 버퍼와 수지를 끓여. </li><li> 분석 immunoblotting에 대한 SDS - PAGE 젤로 샘플을로드합니다. </li><li> 각각의 항체와 ubiquitin과 대상 단백질 감지. immunoblotting을 위해, 우리는 일반적으로 첫번째 ubiquitin 감지합니다. 막은 다음 단백질 시켰던를 감지하는 데 사용됩니다. </li></ol> 체외의 ubiquitination 분석을 통해 대상 단백질의 ubiquitination의 감지 <ol><li> 배 ubiquitination 버퍼를 (100 MM 트리스 - HCL, pH를 7.5, 25 MM MgCl2, 2.5 MM DTT, 10 MM ATP)합니다. 최대 6 개월에 대해 -20 ° C에서 작은 aliquots에 저장합니다. 일부 프로토콜은 또한 ATP 재생 1,2에 대한 버퍼로 크레아틴 인산염과 크레아틴 키나제를 추가합니다. </li><li> 각 반응은 다음을 포함하는 혼합물을 준비 : <table border="1"><tbody><tr><td> μl 8 </td><td> 배 ubiquitination 버퍼 </td></tr><tr><td> 250 NG </td><td> ubiquitination E1 </td></tr><tr><td> 500 NG </td><td> ubiquitination E2 </td></tr><tr><td> 0.5 μg </td><td> ubiquitin </td></tr><tr><td> 0.5 μg </td><td> 관심 단백질 </td></tr><tr><td></td><td> 40 μl 전체 볼륨을 물 </td></tr></tbody></table> 컨트롤로, E1, E2, 또는 ubiquitin 중의 부재에서 유사한 반응을 준비합니다. </li><li> ° C 1시간 이상 37 혼합물을 품어. </li><li> SDS - PAGE 샘플 버퍼를 추가하여 반응을 중지하고 10 분에 대한 샘플을 끓여. </li><li> 분석 immunoblotting에 대한 SDS - PAGE 젤로 샘플을로드합니다. </li><li> 각각의 항체와 ubiquitin과 대상 단백질 감지. </li></ol>

<ol><li>Xiong, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PINK1%2C+and+DJ-1+form+a+ubiquitin+E3+ligase+complex+promoting+unfolded+protein+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">PINK1, and DJ-1 form a ubiquitin E3 ligase complex promoting unfolded protein degradation.</a> J Clin Invest. 119, 650-660 (2009).</li>
<li>Xirodimas, D. P., Saville, M. K., Bourdon, J. C., Hay, R. T., Lane, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mdm2-mediated+NEDD8+conjugation+of+p53+inhibits+its+transcriptional+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mdm2-mediated NEDD8 conjugation of p53 inhibits its transcriptional activity.</a> Cell. 118, 83-97 (2004).</li>
<li>Didier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNF5%2C+a+RING+finger+protein+that+regulates+cell+motility+by+targeting+paxillin+ubiquitination+and+altered+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">RNF5, a RING finger protein that regulates cell motility by targeting paxillin ubiquitination and altered localization.</a> Mol Cell Biol. 23, 5331-5345 (2003).</li>
<li>Laney, J. D., Hochsetrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unit+14.5+Analysis+of+Protein+Ubiquitination%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Unit 14.5 Analysis of Protein Ubiquitination.</a> Current Protocols in Protein Science. , 14.5.1-14.5.11 (2002).</li>
</ol>

저자들은 공개할 사항이 없습니다.

이 프레 젠 테이션에서, 우리가 처음 교양 포유 동물 세포에 대한 관심의 단백질에 ubiquitin 수정을 감지 허가 단계를 설명했다. 하지 않은 covalently 상호 작용하는 단백질에 대한 관심의 단백질에 특별히 ubiquitination를 감지하기 위해, 우리는 세포 용해, immunoprecipitation과 1,3 세척을위한 엄격한 조건을 사용합니다. 안티 ubiquitin immunoblotting 다음과 같은 거친 상태로 표적 단백질의 immunoprecipitation 감지 Ubiquitination은, 따라서 대상 단백질에 구체적으로 가능성이 높습니다. 실험 절차 중에 단백질 deubiquitination을 방지하기 위해, 같은 N - ethylmaleimide과 ubiquitin 알데히드와 같은 deubiquitinating 효소 억제제는 모든 버퍼 4 추가할 수 있습니다. 그러나, 그것은 deubiquitination 효소는 10 분 끓는 절차 후에 ...

단백질 ubiquitination의 감지

Detection of Protein Ubiquitination

Ubiquitination, 단백질을 타겟으로 polypeptide ubiquitin의 공유 결합 첨부 파일 세 효소의 집합으로 실시하는 핵심 posttranslational 수정합니다. 그들은 ubiquitin - 활성화 효소 E1, ubiquitin - 결합 효소 E2, 그리고 ubiquitin ligase의 E3를 포함합니다. E1과 E2, E3 ubiquitin ligases 디스플레이 기판 특이성을 달리. 한편, 수많은 deubiquitylating 효소는 polyubiquitinated 단백질을 처리하는 역할을합니다. Ubiquitination 단백질의 안정성, 휴대 현지화, 그리고 생물 학적 활동의 변화가 발생할 수 있습니다. ubiquitination / deubiquitination 경로 또는 변경 ubiquitin 시스템 기능에 관련된 유전자의 돌연변이 같은 암, neurodegeneration, 그리고 신진 대사 장애의 다양한 유형으로 다양한 인간 질환과 관련된 있습니다. 대상 단백질의 변경 또는 정상 ubiquitination의 감지는 이러한 질병의 pathogenesis에 대한 더 나은 이해를 제공할 수 있습니다. 여기, 우리는 교양 세포에 단백질 ubiquitination을 감지 프로토콜 설명<em&gt; 생체내에</em&gt; 테스트 튜브<em&gt; 체외에서</em&gt;. 이 프로토콜은 또한 sumolyation 및 neddylation 같은 다른 ubiquitin과 같은 작은 분자 수정을 감지하는 데 유용합니다.

Ubiquitination 세 효소의 집합으로 실시하는 핵심 posttranslational 수정합니다. 이 수정에 관여 유전자의 돌연변이가 여러 가지 인간의 질병와 관련된 있습니다. 여기, 우리는 교양 세포에 단백질 ubiquitination을 감지 프로토콜 설명<em&gt; 생체내에</em&gt; 테스트 튜브<em&gt; 체외에서</em&gt;.

단백질 Ubiquitination의 감지

폴리펩타이드인 유비퀴틴을 표적 단백질에 공유 결합으로 부착하는 과정인 유비퀴틴화(ubiquitination)는 일련의 ...에 의해 수행되는 핵심적인 번역 후 조절(posttranslational modification)입니다.

안녕하세요, 버밍햄 의료 연구소(Birmingham Institute for Medical Research) Jo 교수 연구실의 Chu입니다. 오늘은 단백질의 뉴에이션(new uation)을 검출하는 절차를 보여드리겠습니다. 저희 연구실에서는 이 절차를 사용하여 파킨슨병 또는 UBI 3 리가드와 그 기질을 연구하고 있습니다.그럼 시작해 보겠습니다. 이 프로토콜을 시작하려면, 표적 단백질과 에피토프 태그가 붙은 유비퀴틴을 모두 발현하는 플라스미드를 세포에 형질전환하십시오. 세포를 약 40시간 동안 배양한 후, 실험대로 이동하여 세포를 용해하기 위해 액체 배지를 흡입하여 제거하고 PBS로 세포를 두 번 세척하십시오.다음으로, 6 cm 플레이트당 2% SDS가 포함된 세포 용해 버퍼 100 µL를 첨가하여 세포를 용해합니다. 버퍼가 세포를 완전히 덮을 수 있도록 각 플레이트를 부드럽게 흔들어 줍니다. 그 다음, 세포 스크레이퍼를 사용하여 용해된 세포를 수집하고 1.5 mL 에펜도르프 튜브로 옮깁니다.튜브를 즉시 가열 블록에 올려놓고 용해된 세포를 10분 동안 가열하여 단백질을 추가로 변성시키고 용해합니다. 가열 후, 초음파 분쇄기를 사용하여 세포와 DNA를 절단합니다. 이 단계는 세포 용해물의 점도를 낮추어 줍니다.초음파 처리 후, 900 µL의 희석 버퍼를 첨가하고 샘플을 4 °C에서 30분에서 60분 동안 회전 혼합합니다. 배양 후, 수용성 단백질을 얻기 위해 희석된 샘플을 4 °C에서 20,000 Gs로 30분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 펠렛이 섞이지 않도록 주의하며 상층액을 새 에펜도르프 튜브로 옮깁니다.마지막으로, 여기에서 사용하고 있는 것과 같은 변형된 Lowry 분석법과 같은 방법을 통해 상층액의 단백질 농도를 측정하십시오. 이제 면역침전법을 사용하여 상층액 내의 다른 단백질로부터 목적 단백질을 분리할 준비가 되었습니다. 면역침전의 첫 번째 단계는 목적 단백질에 대한 항체가 결합된 비드를 준비하는 것입니다.시판되는 항체 접합 비드(antibody conjugated beads)를 사용하거나 가교제를 사용하여 자체적으로 고정화 항체를 만들 수 있습니다. 본 영상에서와 같이, 아미노 침전 반응을 설정하기 위해 호환 버퍼에서 고정화 항체를 준비하여 50% 슬러리를 만듭니다. P 200 피펫 팁의 좁은 끝부분을 자르고, 14 ~ 20 µL의 레진을 500 ~ 1500 µg의 준비된 세포 용해물에 옮깁니다.세포의 transfection 효율에 따라 사용할 세포 용해물(cell lysate)의 양을 조절하십시오. 세포 용해물-비드 혼합물을 4°C에서 하룻밤 동안 회전시키십시오. 이 과정 동안 비드 결합 항체가 표적 단백질에 특이적으로 결합하게 됩니다.다음 날, 4°C에서 5,000 Gs로 5분 동안 원심분리하여 단백질을 펠렛(pellet)화합니다. 단백질이 비드에 결합된 상태에서 상층액을 흡입하여 제거하고, 5,000 Gs로 5분 동안 원심분리하는 과정을 통해 고염 세척 완충액으로 레진을 두 번 세척합니다. 4°C에서 마지막으로 20,000 Gs로 30초 동안 원심분리한 후 남아 있는 세척 완충액을 흡입하여 제거합니다.목표 단백질을 정제했으므로, 이제 SDS-PAGE 겔을 통해 단백질을 분석할 차례입니다. 먼저, 단백질을 변성시키고 음전하를 띠게 하기 위해 비드 레진에 2배 농도의 SDS 로딩 버퍼를 넣고 가열하십시오. 준비된 샘플을 SDS-PAGE 겔에 로딩하십시오.실험실의 웨스턴 블롯팅 프로토콜에 따라 젤 L에서 단백질을 멤브레인으로 이동시킵니다. 그다음 유비퀴틴 또는 표적 단백질에 대한 항체로 블롯을 프로빙하고, 필름으로 멤브레인을 현상하여 유비퀴틴화된 단백질을 시각화합니다. 지금까지 배양 세포에서 단백질 유비퀴틴화를 검출하는 방법을 살펴보았습니다.동일한 실험을 시험관 내(in vitro)에서 수행할 수 있습니다. 이 반응의 총 부피는 40 µL이며, PCR 튜브에서 진행할 수 있습니다. 각 반응을 다음과 같이 준비하십시오.먼저 TP와 환원제 DIO three etol, DTT가 포함된 UBIQUITINATION 버퍼를 5배량 첨가합니다. 다음으로 유비퀴틴화 효소 E one과 E two를 첨가합니다. 기질, ubiquitin 및 표적 단백질을 첨가합니다.대조군으로서 물을 사용하여 전체 반응 부피를 40 µL로 맞춥니다. ubiquitin E1, E2 또는 표적 단백질이 없는 상태에서 유사한 반응을 준비합니다. 혼합물을 37 °C에서 1시간 이상 배양합니다.SDS page 샘플 버퍼를 첨가하여 반응을 중단시킵니다. 샘플을 10분 동안 가열합니다. 샘플을 SDS page 겔에 로딩하고 in vivo 실험에서와 동일하게 면역 블로팅 분석을 진행합니다.본 프로토콜의 결과 예시입니다. 파킨슨병. 여기서는 파킨슨병 관련 단백질이 분석 대상 단백질입니다. 또한 4번 레인은 유비퀴틴화된 parin을 보여줍니다.여러 실험 조건, 변형되지 않은 표적 단백질인 parin의 세포 내 발현 수준, 그리고 각 조건에서 고려되어야 할 ubiquitin을 비교하기 위해, 전형적인 강한 스미어(smear) 또는 래더(ladder) 형태가 변형되지 않은 parin의 분자량 위쪽에 나타나 있습니다. 이는 in vitro parin 유비퀴틴화의 예시로, 친화성 정제된 parin을 사용하여 재조합 E1, E2 및 biotin 태그 ubiquitin 존재 하에 in vitro 유비퀴틴화 분석을 수행하였습니다. biotin-유비퀴틴화된 parin은 streptavidin HRP로 검출되었습니다. 유비퀴틴화된 Parin은 변형되지 않은 parin의 분자량 위쪽에 래더 형태로 나타납니다. 레인 1, 2, 4는 각각 ubiquitin, E1, E2 및 parkin이 포함되지 않은 대조군입니다.지금까지 배양 세포에서 단백질 백신화를 검출하는 방법을 살펴보았습니다. 이 절차를 수행할 때는 세포 용해물을 매우 정밀한 조건에서 준비하고, 표지 항체를 추가하기 전에 세포 용해물을 희석하는 것이 중요하다는 점을 기억하십시오. 이것으로 모든 과정을 마치겠습니다.시청해 주셔서 감사합니다. 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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이 동영상은 복합 펩타이드 혼합물에서 잔류 디글리신 펩타이드를 포함하는 유비퀴틴닐화 펩타이드를 추출하고 정제하는 방법을 설명합니다. 제시된 방법은 단백질의 원래 유비퀴틴(ubiquitination) 부위를 확인하는 데 도움이 될 수 있습니다.

유비퀴틴화 펩타이드의 면역친화성 기반 추출: 정제된 펩타이드 분획에서 유비퀴틴 태그 펩타이드를 선택적으로 추출하는 기술

현재 프로토콜은 기능적 상동 deubiquitinating 효소의 활성을 측정하는 방법을 자세히 설명. 전문화 된 프로브에 공유 효소를 검출하고 수정할 수 있도록. 이 방법은 새로운 치료 표적을 식별하는 잠재력을 보유하고있다.

세포주 및 조직 샘플에서 Deubiquitinating 효소의 활성을 측정 방법

우리는 복잡한 생물학적 샘플에서 유비퀴틴화 된 단백질에서 유래 한 diGly 펩티드의 정제, 검출 및 식별방법을 제시합니다. 제시된 방법은 유비퀴티노메 분석의 깊이 수준에 대하여 공표된 방법을 재현가능하고 견고하며 능가합니다.

펩타이드 농축 및 질량 분광법에 의한 단백질 유비퀴틴화 부위 검출

유비퀴틴화는 세포 과정에서 중요한 역할을 하는 번역 후 수정이며, 듀비퀴틴화에 의해 긴밀하게 조정됩니다. 두 반응의 결함은 인간의 병리를 뒷받침합니다. 우리는 정제 된 구성 요소를 사용하여 시험관 내에서 유비퀴틴화 및 듀비퀴틴화 반응을 수행하기위한 프로토콜을 제공합니다.

체외 유비퀴틴화 및 뉴클레오소말 히스톤의 이중화 율법의 비퀴틴화 어설션

이 프로토콜은 치료 또는 표현형과 같은 특정 조건과 관련된 이러한 종류의 번역 후 수정 (PTM)의 변경을 식별하기 위해 유비퀴틴 (Ub) 및 유비퀴틴 -좋아요 (Ubls) 특정 프로테오옴을 확립하는 것을 목표로합니다.

유비퀴틴 및 유비퀴틴과 같은 종속 적 번역 후 수정 및 중대한 변경 식별 프로파일링

이 방법은 유비퀴틴 체인 토폴로지의 글로벌 변화에 대한 평가를 설명합니다. 평가는 질량 분광계 기지를 둔 표적 proteomics 접근의 응용에 의해 수행됩니다.

병렬 반응 모니터링에 의한 유비퀴틴 연쇄 분석

우리는 포유동물 세포에서 특정 기질 및 E3 유비퀴틴 리가아제의 유비퀴틸화 검정을 위한 상세한 프로토콜을 제공한다. HEK293T 세포주는 단백질 과발현을 위해 사용되었고, 폴리유비퀴틸화된 기질은 면역침전에 의해 세포 용해물로부터 정제되고, SDS-PAGE에서 분해되었다. 면역블롯팅은 이러한 번역 후 변형을 시각화하기 위해 사용되었다.

포유동물 세포 용해물에서 E3 유비퀴틴-리가아제에 의한 기질 유비퀴틸화의 평가

프로토콜은 p53 종양 억제 단백질을 예로 사용하여 포유류 세포로부터 유비퀴틴화된 단백질을 정제하는 단계별 방법을 설명합니다. 유비퀴틴화된 p53 단백질은 엄격한 비변성 및 변성 조건 하에서 세포로부터 정제하였다.

포유류 세포에서 유비퀴틴화된 p53 단백질의 정제

본 프로토콜은 토포이소머라제 억제제 및 포름알데히드에 의해 유도된 유비퀴틸화, SUMOylation 및 ADP-리보실화를 포함하여 DNA-단백질 가교결합(DPC) 및 번역 후 변형(PTM)을 검출하고 정량화하는 변형된 방법을 강조하여 DPC 및 그 PTM의 형성 및 복구에 대한 연구를 허용합니다.

DNA-단백질 가교 및 번역 후 변형의 정량적 검출

여기에 사용된 실험은 중국 전통 의학의 소분자와 단백질 표적 간의 상호 작용을 예측하고 검증하기 위해 프로브 기술과 결합된 분자 도킹 방법을 보여줍니다.

분자 도킹 및 탈유비퀴틴 효소 프로브 기술을 기반으로 UCHL3 활성을 억제하기 위한 전통 한의학 화합물 스크리닝

유비퀴틴화는 세포 내 단백질 기능의 중요한 조절자입니다. 여기서는 포유류 세포에서 기질 단백질 유비퀴틴화 수준을 검출하는 두 가지 세포 용해 방법을 설명하고, 유비퀴틴화 수준 분석에 미치는 효과를 비교합니다. HEK293T 세포 내 단백질 과발현은 일시적 형질전환에 의해 유도되었고, 유비퀴틴화된 단백질은 웨스턴 블롯 분석을 통해 검출되었습니다.

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배우세요 단백질 유비퀴티네이션 검출 방법을 배양 세포와 시험관 내 실험에 적용하여 질병 관련 단백질 수정 연구에 활용하세요. 이 프로토콜은 면역침전 및 웨스턴 블롯팅 기법을 포함합니다.

단백질 Ubiquitination의 감지

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