2009년 7월 22일
자유롭게 동물 행동의 신경 활동 패턴의 비침습 측정은 고속 videography와 neurophysiological 레코딩을 결합하여 얻을 수 있습니다.
신경 및 근육장 전위의 기록용. 한 쌍의 수조 전극의 전자 기록은 고속 비디오 기록과 동기화되어 랩톱 모니터에 표시됩니다. 어린 가재를 작은 수족관에 넣고 5 분 동안 적응시킵니다.
녹음이 시작된 후 실험자는 휴대용 프로브로 동물을 만지고 그에 따른 행동 및 생리적 반응을 측정한 다음 분석합니다. 안녕하세요, 저는 메릴랜드 대학교 칼리지 파크 심리학과의 Y Savaha 박사입니다. 오늘 우리는 자유롭게 행동하는 동물의 비침습적 신경 및 근육장 전위를 기록하는 절차를 보여 드리겠습니다.
우리는 실험실에서 이 절차를 사용하여 어린 가재의 탈출 반응 중에 활성화되는 신경 회로를 식별합니다. 시작하겠습니다. 기록 전극을 구성하기 시작하기 위해 절연 구리선의 한쪽 끝에서 0.5-1mm의 절연체가 벗겨집니다.
이 과정은 무독성 접착제를 사용하여 한 쌍의 기록 전극을 만들기 위해 두 번째 동일한 와이어에서 반복됩니다. 기록 전극은 얇은 벽으로 된 유리 기록 챔버 내부에 부착됩니다. 기록 전극은 챔버의 양쪽 짧은 측면의 중앙에서 서로 마주보고 위치합니다.
다음으로, 접지선은 한쪽 끝의 절연체를 2-3 센티미터씩 벗겨내어 판매합니다. 이 끝에서 더 긴 와이어 조각으로. 접지 전극은 기록 전극에 수직인 기록 챔버의 긴 측면 중 하나에 위치합니다.
녹음실은 길이 8.5cm, 너비 2cm, 높이 5cm여야 합니다. 다음으로, 자극 프로브는 한 쌍의 미세한 와이어 전극이 장착된 유리 퍼펫으로 만들어집니다. 전극 팁은 동물이 프로브에 닿을 때 전자 신호를 생성하기 위해 노출됩니다.
이를 통해 자극 시간을 정확하게 측정할 수 있습니다. 수조 기록 전극, 프로브 및 접지선은 세포 외 증폭기에 연결됩니다. 먼저 수조 전극을 증폭기에 연결합니다.
다음으로 프로브를 증폭기에 연결합니다. 마지막으로 앰프의 접지를 통해 저음과 프로브를 접지합니다. 증폭기의 출력은 BNC 케이블을 사용하여 브레이크아웃 박스 및 데이터 수집 보드에 연결됩니다.
챔버는 동물에게 견인력을 제공하기 위해 자갈로 채워져 있습니다. 챔버는 이제 탈이온수로 채워졌습니다. 약 18메가옴의 고저항의 물을 사용하여 기록 전극, 접지선 및 자극 프로브의 구성을 완료할 때 최적의 결과를 얻을
수 있습니다.실험을 시작하기 전에 실험 녹음을 수행하는 방법을 볼 수 있습니다. 고속 비디오 카메라는 구즈넥 조명기를 사용하여 측면 보기를 제공하기 위해 녹음실에 수직으로 배치됩니다. 레코딩 챔버 내부의 밝기는 브레이크아웃 박스와 데이터 수집 보드를 사용하여 조정됩니다.
비디오 촬영은 전자 녹음과 동기화됩니다. 실험자가 녹음을 시작할 준비가 되면 외부 핸드 스위치 트리거가 비디오와 데이터 수집을 동기화하기 시작합니다. 실험을 시작하기 위해 한 마리의 동물을 챔버에 넣고 5분 동안 적응시킵니다.
동물이 적응하면 외부 핸드 스위치 트리거에 의해 동기화된 비디오 및 데이터 수집이 시작됩니다. 초당 1000프레임의 프레임 속도로 녹화된 비디오와 전자장 전위는 25킬로헤르츠의 주파수로 기록됩니다. 그래서 우리는 여기를 보고 있습니다.
여기서 각 프레임은 1밀리초 길이이며 다시 말하지만, 위쪽 트레이스는 동물의 신경 근육 반응입니다. 아래쪽 트레이스는 프로브입니다. 다음은 프로브의 편향으로, 이것이 동물이 맞았을 때임을 나타냅니다.
그리고 여기 동물의 신호가 있습니다. 여기서 큰 편향에 선행하는 신경 신호, 즉 근육과 근육이 수축합니다 자극 프로브를 사용하여 탈출 꼬리 뒤집기는 머리나 복부에 대한 다양한 강도의 단일 탭에 의해 유도됩니다. 이 프로세스는 다양한 동작 상황에서 꼬리 뒤집기를 살펴보기 위해 반복됩니다.
마지막으로, 광자 모션 도구 소프트웨어를 사용하여 기록 세션 동안 얻은 데이터를 분석하여 각 활성화된 신경 회로에서 발생하는 동물의 움직임의 특성을 결정합니다. 다음은 어린 가재의 머리 또는 꼬리에 전달되는 촉각 자극에 대한 반응으로 탈출 꼬리 뒤집기에 대한 일련의 단일 고속 비디오 프레임과 해당 전기장 녹음을 살펴 봅니다. 이 궤적에서, 머리에 가해지는 강한 촉각 자극은 내측 거대 회로에 의해 제어되는 꼬리 뒤집기를 불러일으켰다.
거대 뉴런의 기록된 스파이크와 그에 따른 큰 위상 편향은 거대 뉴런 활동에 의해 매개되는 꼬리 뒤집기의 모호하지 않은 식별을 가능하게 합니다. 비디오 트레이스에 표시된 후진 이동은 활성화된 신경 회로의 정체성을 결정합니다. 다음은 측면 거대 회로에 의해 매개되는 꼬리 뒤집기입니다.
강한 촉각 자극을 가한 후 꼬리를 위로 올리고 앞으로 움직이는 움직임이 비디오에서 보입니다. 거대한 스파이크와 큰 위상 초기 편향을 표시하는 동기화된 전자 추적과 함께 활성화된 신경 회로의 정체성을 결정합니다. 이 비디오는 GI가 아닌 회로에 의해 제어되는 테일 플립을 보여줍니다.
보다 점진적인 촉각 자극이 동물의 흉부에 전달되었습니다. 비디오에 포착된 움직임은 활성화된 회로를 명확하게 식별할 수 없지만 전자 기록은 거대한 스파이크가 없으며 활성화된 회로를 식별하는 훨씬 더 작은 편향으로 구성됩니다. 여기에서 세 가지 유형의 탈출 꼬리 플립 모두에 대한 대기 시간 측정을 볼 수 있습니다.
프로브 접촉과 생리적 반응 사이의 시간을 7마리의 동물에 대해 측정했습니다. 거대 매개 꼬리 플립은 GI가 아닌 꼬리 플립보다 훨씬 빠르게 유도됩니다. 우리는 방금 어린 회색 물고기가 촉각 자극에서 탈출할 때 생성되는 신경 및 근육 장 전위를 기록하는 방법을 보여주었습니다.
이 절차를 수행할 때 연구 질문에 맞게 프로토콜을 조정하는 것이 중요합니다. 예를 들어, 고속 비디오가 필요하거나 필요하지 않을 수 있으며 비디오를 베이스 녹음과 동기화해야 할 수도 있고 필요하지 않을 수도 있습니다. 새로운 종을 처음 테스트할 때 가재의 배스 전극에서 녹음된 내용을 확인하기 위해 독립적인 측정이 필요합니다.
이는 복부 신경 코트 주위에 한 쌍의 전극을 임시로 이식하여 수행할 수 있으며, 이식된 전극의 녹음을 수조 전극의 녹음과 비교하여 챔버 크기를 조정하는 것도 중요합니다. 녹음실은 가능한 한 작아야 하지만 동물의 자연스러운 행동을 제한해서는 안 됩니다. 그게 다야.
지켜봐 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.
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이 연구는 자유롭게 행동하는 어린 가재의 신경 및 근육 전위를 비침습적으로 기록하는 절차를 시연합니다. 전자 기록과 고속 비디오를 동기화함으로써 연구자들은 행동 및 생리학적 반응을 분석할 수 있습니다.
Establishing causal links between neural circuit activity and natural behavior remains a critical challenge in target validation for CNS drug discovery. This non-invasive electrophysiological approach enables unambiguous identification of specific neural circuits driving defined behavioral outputs in unrestrained models, supporting mechanistic de-risking of therapeutic hypotheses. By correlating precise neural signatures with ethologically relevant behaviors, the method enhances predictive confidence in early discovery stages where behavioral phenotypes inform target selection and pathway interrogation.
The method integrates into early discovery workflows by providing mechanistic insights that bridge neural activity measurements with behavioral phenotyping, informing target validation and lead identification decisions prior to preclinical investment.