Name: 신경 세포와 Glia 개발 연구 랫 두뇌 집계 문화의 준비 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-30T23:59:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: 배우세요 E16 랫 태아 뇌에서 신경 전구세포를 분리하여 집계 배양하는 방법을. 이 기술은 신경세포와 신경교세포로의 분화 과정을 연구하는 데 활용됩니다.

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이 연구는 텍사스 A &amp; M 대학에서 시작 펀드로 일부 자금되었습니다

절개 전에 준비 수술 도구 : 압력솥의 모든 해부 가위와 집게를 소독 Coverslip 청소 : <ol><li> 최소 24 H에 대한 33% HCL에 1L 잔디 비커의 모든 coverslips을 (24 잘 접시 직경 15mm) 소크 </li><li> 모든 잔류 HCL을 제거 가끔 흔들어 10 분 물을 실행하는 와시 </li><li> Millipore 물로 헹굼 </li><li> 물을 배수하다 </li><li> 95~98% 에탄올에 coverslips 소크 </li><li> 플랫 플레이트와 공기의 깨끗한 조직 전송 coverslips은 coverslips을 건조 </li><li> 알루미늄 호일과 압력솥와 커버, 유리 비커에 coverslips을 전송 참고 : Coverslips이 단계에서 저장할 수 있습니다 </li><li> 문화 접시에 개인 coverslip를 놓습니다. 코팅 준비 </li></ol> Coverslip 코팅 : <ol><li> PBS 및 필터 - 소독 (0.22 μm의)와 폴리 - D - 라이신 100 X 주식 (PDL, -20 ° C에서 aliquots로 저장 PBS에서 알부민 0.5 % 소 혈청에서 10 MG / ML을) 희석 </li><li> 37 2 H 1 X PDL 솔루션 (~ 0.15 ML / cm 2) · 인큐베이터에서 C와 외투 coverslips </li><li> PDL 솔루션을 제거하고 완전히 멸균 ddH 2 O 건조 coverslips 3 번 씻어 </li></ol> 참고 : coverslips / 각 해부에 대한 번호판 충분한 문장. PDL - 코팅 coverslips 4에서 몇 주 동안 저장할 수 있습니다 ° C. 미디어 솔루션 해부 매체 (DM)는 10 MM의 HEPES (Invitrogen 15,630)과 보충 (HBSS, Invitrogen 14175) 무균 얼음 차가운 행크의 밸런스드 소금 솔루션 (W ​​/ O 칼슘 2 +, MG 2 +)를 사용합니다. 누계 문화 미디어 : 2% B27, 1 X 사토, 0.5 MM 나트륨 pyruvate, 0.75mM GlutaMAX, 60μg/ml N - acetylcysteine, 5 μg / ML : DMEM/NBB27 매체 DMEM / Neurobasal를 (권 1시 1분 권)를 포함 인슐린, 10nM D - 비오틴, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신. 집계 문화 매체의 100 ML하려면 50 ML DMEM (W / O pyruvate / 글루타민, Invitrogen 11,960) 50 ML Neurobasal 매체 (Invitrogen 211034), 375 μl GlutaMax (100 X, Invitrogen 35,050), 5.5 MG 나트륨 pyruvate를 섞어 (시그마 P2256), 2 ML B27 (Invitrogen 17,504)는, 6.3 MG N - acetylcysteine​​ (시그마 A8199), 사토 주식 1 ML, D - 비오틴 주식 (4000 X 주식 40 25 μl를 (100 X 주식은 아래 참조) PBS에서 μm의는 -20에서 aliquots ° C. 시그마 B4639), 인슐린 100 μl (1000 X 주식, -20에서 aliquots로 저장 0.01N HCL 5 MG / ML ° C, 시그마 16,634), 1 ML 페니실린로 저장 / 스트렙토 마이신 (100 X 주식, Invitrogen 15140)은, 필터 소독 및 저장 4 ° C. 사토 100 X 주식 솔루션 : 주식의 40 ML을하려면 다음과 같이 혼합 400가, 400 밀리그램의 BSA (시그마 A9647), progesterone 10 μl (25 MG / ML 에탄올은 같은 MG APO - 트랜스페린 (시그마 T2252) 저장된 40 ML의 Neurobasal -20에서 aliquots ° C. 시그마 P8783), 64 MG putrescine (시그마 P7505), 그리고 나트륨 selenite (-20에서 aliquots로 저장 PBS에서 30 μm의, ° C, 시그마 S5​​261) 40 μl. -20 ° C.에 aliquots로 사토 재고 솔루션, 그리고 상점을 소독 필터 신경 도금 매체 (PM) : Neurobasal 매체, 2퍼센트 B27, 2mM 글루타민 (100x 주식, -20 ° C, Invitrogen 25,030에 저장된 aliquots), 25μM 글루탐산 (100 주식, -20 ° C에 저장된 aliquots), 1 % 페니실린은 / 스트렙토 마이신. 신경 세포의 문화 매체 (CM) : Neurobasal 매체, 2퍼센트 B27, 2mM 글루타민 (100x 주식, -20 ° C에 저장된 aliquots), 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신. 5 FdU 주식 : Neurobasal 매체 100x 재고, 1mM 5 - 플루오로 - 2&#39; - deoxyuridine (시그마 F0503) and1mM 유리딘 (시그마 U3003). 필터 -20 ° C.에 살균 및 aliquots로 저장 Papain의 소화 솔루션 (이전 해부 신선한 확인) : <ol><li> 4ml DM의 3.2 MG L - 시스테인 (시그마 C - 7352)를 디졸브 </li><li> 37 1N NaOH (산도 검사 스트립에서 테스트)와 물을 욕조에 장소 주변 7.4으로 산도를 조절 ° C 참고 : 오른쪽 조직 소화하기 전에 다음 단계를 (아래 참조) 수행합니다. </li><li> 20 단위 / ML의 최종 농도 papain 추가 </li><li> (0.22mm) 소독 필터, 그리고 37 물 목욕에서 개최 ° C </li></ol> 트립신 억제제 솔루션 (이전 해부 신선한 확인) : <ol><li> 20ml DM 0.2 g 트립신 억제제 (시그마 T7295)를 디졸브 </li><li> 산도를 확인하고 1 N NaOH로 ~ 7.4으로 산도를 조절 </li><li> 소독 필터, 그리고 37 물 목욕에서 개최 ° C </li></ol> 뇌 해부 설정 : <ul><li> 소독 집게와 가위 </li><li> 70 % 에탄올 </li><li> 클린 조직 종이와 diap벤치에 어 패드 </li><li> 벤치에서 자궁과 태아를위한 얼음처럼 차가운 DM과​​ 10cm의 페트리 요리 </li><li> 해부 현미경에서 얼음 플랫폼 </li><li> 얼음 DM과 2-3 6cm 요리 </li><li> 37 ° C의 물을 욕조에 따뜻한 PM </li></ul><ol><li> 임신 스프 라그 - 돌리 귀하의 기관 애니멀 케어의 승인 절차에 따라 쥐 (E16) 우리위원회 (IACUC)를 안락사 </li><li> 복부에 기저귀 패드와 ...의 난소를 제거하다 알코올에 쥐하다 </li><li> V 모양의 절개는 피부를 절단하기 위해 복부 피부와 가위를 잡아 핀셋을 사용하여 </li><li> 피부를 따로 확산과 근육 계층을 통해자를 다른 소독 핀셋과 가위를 사용 </li><li> 배아 주머 니나의 사슬을 추출하고 얼음처럼 차가운 DM을 포함 10cm 접시에 그들을 전송 </li><li> microdissection 가위를 사용하면, 신중하게 각각의 배아에서 색 및 뇌 각 배아를 제거하고, 장소는 얼음 플랫폼에 DM과 함께 깨끗한 10cm 접시에 두뇌를 해방 </li><li> 판상 후드와 해부 현미경 아래 midbrain / hindbrain 섹션을 제거하고 meninges를 제​​거하는 미세 집게를 사용하여 얼음 팩 DM으로 새 6cm 접시에 청소 cortices / 해마를 전송 참고 :이 단계에서, 조직은 효소 분해를위한 준비가되었습니다. </li><li> papain과 트립신 억제제 솔루션과 필터 소독 만들기 </li><li> cortices에서 DM 초과 / hippocampi을 제거 </li><li> 준비 papain의 소화 솔루션의 4ml 추가 </li><li> 50ml 튜브에 모든 내용을 전송 37에서 물을 욕조에 팔콘 튜브를 삽입 ° C 정확히 5 분 </li><li> 피펫과 papain 솔루션을 제거 </li><li> 2-3 분 5ml 트립신 억제제 솔루션, 소용돌이 관, 37에서 물이 욕조에서 개최 ° C 추가 </li><li> 트립신 억제제 솔루션을 제거 </li><li> 단계 13 14 세 번 반복 </li><li> 20ml 따뜻한 PM 추가 </li><li> 모든 대단히 짧은 시간이 (~ 20-30 회)까지 사라졌습니다 씹다 </li><li> 7min에 대한 100xg에서 원심 분리기 </li><li> 10ml PM의 펠렛을 Resuspend 및 원심 분리에 의해 두 번 씻어 </li><li> 일반적인 신경 세포 배양 또는 총체적 문화 NBB27/DMEM에 10ml PM에 펠릿을 Resuspend </li><li> 70μm 셀 sieves 통해 세포 패스 </li><li> 라이브 세포를 카운트 </li><li> 일반적인 신경 세포 배양을위한 세포를 아래에 설명된이나 접시 등 총체적 문화로 이동 참고 :이 단계에서 매우 풍부한 신경 세포 배양은 실험 목적에 따라 2 200-640 셀 / mm의 밀도에서 PDL - 코팅 접시에 dissociated 세포를 도금하여 얻을 수 있습니다. 세포 (~ 2 4h) 첨부 후, 따뜻한 PM과 매체를 바꿉니다. 일 4 시간 연장 기간에 대해 culturing 경우, 따뜻한 CM과 함께 매체의 절반을 교체하십시오. 고도의 연결을 문화, mitotic 억제제를 정화를위한 5 FdU (최종 농도 10 μm의)이 (DIV2 - 3 동안 즉,) 비의 연결을 세포 증식을 억제하기 위해 DIV2에 추가할 수 있습니다. 2 일 CM에서 복구 후에, 세포는 맥박이 완전한 매체 변경 다음 다른 이일 (DIV 6-7) 5 - FdU로 다시 처리됩니다. 그 이후, 신선한, 따뜻한 CM 모든 3~4일과 매체의 절반을 교체하십시오. 최대 4 주 동안 뉴런이 가능한 있습니다. </li></ol> 합산 준비와 도금 <ol><li> 2x10 6 셀 / ML의 밀도에 1X 사토 10ng/ml CNTF 및 10μM forskolin을 포함 NBB27/DMEM 매체에 dissociated 세포를 일시 중지 </li><li> uncoated 6 잘 플레이트의 각 우물에 세포 현탁액의 2ml을 전송 </li><li> 3 박에 대한 문화. 매일, 부드럽게 한번 P1000 Pipetman를 사용하여 셀을 resuspend 참고 : 세포 집합체 (그림 1)을 형성 시작합니다. </li><li> 집계 도금 전날에 코팅 플레이트 / Matrigel과 coverslips : <ul><li> 주식 Matrigel (성장 인자는 감소, BD Biosciences 354230) 얼음 추위 DMEM과 1시 20분을 희석 참고 : Matrigel의 aliquots가 제조 업체 절차에 따라 작성되어야합니다. 모든 팁, Eppendorf 튜브 및 재고 aliquots을 만들기위한 솔루션 Matrigel 중합을 피하기 위해 추운해야합니다. Matrigel의 Aliquots는 -80 ° C에서 보관 및 4 ° C.에 해동 아르 </li><li> 37 ° C 배양기에서 하룻밤 희석 Matrigel 솔루션의 300μl/well와 코트는 이전 PDL - 코팅 coverslips </li><li> 따뜻한 PBS로 세척 후 살균 따뜻한 ddH 2 O와 접시를 세척하고 인큐베이터에있는 접시를 두십시오. </li></ul></li><li> 골재 형성 후 3 일, 부드럽게 50ml 팔콘 튜브에 200μm 메쉬를 통해 중지를 다시 세포를 resuspend 및 체. 집계 중력 (~ 3 - 5 분​​)에 의해 튜브의 바닥에 정착하도록 허용 </li><li> 조심스럽게 뜨는을 제거 </li><li> 미디어를 추가 부드럽게 집계를 resuspend하고 다시 쉬라 구. 죽은 세포, 개별 세포와 찌꺼기를 제거하려면이 절차를 여러 번 반복합니다. 뜨는 아직 집계되지 않은 세포와 debri를 포함 여부를 확인하도록 현미경을 사용하여에스 </li><li> 부드럽게 같은 NBB27/DMEM 매체에서 집계 (그림 1) resuspend 및 집계 계산 </li><li> 25-30 주위 aggreggats/50ul로 집계의 밀도를 조절 </li><li> 도금에 대한 2ml Eppendorf 튜브에 집계 정지 전송 aliquots (500 1000μl) 참고 : 집합체가 튜브의 바닥에 정착하는 경향이 있기 때문에 그것이 도금에 대한 총체적 정학의 여러 튜브를 만들기 위해 매우 중요합니다. 부드럽게 자주 각 coverslip에 도금 집계 비슷한 번호를 보장하기 위해 코팅 coverslips 또는 문화 접시에 그들을 심는 전에 집계를 resuspend. </li><li> 인큐베이터에서 Matrigel - 코팅 coverslips을 포함하고있는 문화 판을 가져가라. 각 우물에서 솔루션을 제거, 따뜻한 PBS 및 ddH 2 O와 coverslips을 씻어 후 건조 짧게. 그들은 골재 시딩을 위해 지금 준비가되어 </li><li> 그들이 시딩 전에 균일하게 배포할 수 있도록 집계 중지를 포함한 튜브를 반전. 각 coverslip의 중심에 집계 정지 50μl를로드하고, 부드럽게 집계는 coverslip에 균일하게 연결할 수 있도록 더 이상 방해하지 않고 인큐베이터에 다시 접시를 넣어 참고 : 집합체의 밀도는 매우 중요합니다. 집합체가 씨앗을 품고있다면 너무 서로 가까이에 또는 시딩 밀도가 높은 경우, 그들의 성장으로 함께 병합하는 경향이있다. </li><li> 나중에 또는 이른 다음날 아침마다 잘 4-6 H에 추가 DMEM/NBB27medium (500 μl)를 추가 </li><li> 집계 문화를 유지하려면, 반은 모든 3~4일 매체를 변경합니다. 매체를 변경하면, 집계를 방해하지 않도록주의하고 이것은 부드럽게 잘 측면 벽을 따라 미디어를 추가하여 이루어집니다. 참고 : 몇 시간 판에 부착된 집계 후 집계에서 neurite 가지를 볼 수 있습니다. Axons 처음 2 주 동안 빠르게 성장하고 집계 (그림 2) 사이의 풍부한 연결을 형성합니다. Glial progenitors 밖으로 집계의 반경 마이 그 레이션 및 astrocytes과 성숙 oligodendrocytes로 시간이 지남에 따라 구별. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1304/1304fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. 세정 후 다른 일 집계에 합산을 형성 세포의 위상 콘트라스트 이미지를 표시합니다. <img src="/files/ftp_upload/1304/1304fig2.jpg" alt="그림 2" /> 2 12일 Matrigel - 코팅 coverslips에 씨뿌린 후 집계 문화 그림 2. 위상 콘트라스트 이미지를 표시합니다.

<ol><li>Matthieu, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelination+in+rat+brain+aggregating+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Myelination in rat brain aggregating cell cultures.</a> Neuroscience. 3, 565-56 (1978).</li>
<li>Chen, Y. ing <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+rat+and+mouse+oligodendrocyte+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of rat and mouse oligodendrocyte precursor cells.</a> Nat. Protocols. 2, 1044-10 (2007).</li>
<li>Watkins, T. A., Emery, B., Mulinyawe, S., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+stages+of+myelination+regulated+by+gamma-secretase+and+astrocytes+in+a+rapidly+myelinating+CNS+coculture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Distinct stages of myelination regulated by gamma-secretase and astrocytes in a rapidly myelinating CNS coculture system.</a> Neuron. 60, 555-55 (2008).</li>
<li>Svenningsen, A. F., Shan, W. ei-S. ong, Colman, D. avidR., Pedraza, L. iliana <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+method+for+culturing+embryonic+neuron-glial+cell+cocultures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Rapid method for culturing embryonic neuron-glial cell cocultures.</a> Journal of Neuroscience Research. 72, 565-56 (2003).</li>
</ol>

초기 연구는 시냅스 및 회전 - 중재 부유 집계 문화 1 성숙 myelin 형성을보고했다. 여기에 설명된 CNS의 집계 문화 시스템은 세포 개발, 마이 그 레이션 및 체외에서 분화의 분석을 촉진하기 위하여 전통적인 2D 문화의 편의와 입체 집계에 multipotent 전구 세포의 혈청이없는 성장을 결합한 제품입니다. 체제가 신경 전구체에 대한 수정하여 사용할 수 있습니다 세포 연구 및 신경 세포 - glia 상호 작용에 조사를 위해. 예를 들어, oligodendrocyte progenitors으로 유전자 변형 세포는 2 집계 문화에 추가할 수 있습니다. 이러한 microglia 및 macrophages 또는 뉴런과 glia의 개발 및 차별화에 대한 각종 시약으로 면역 세포의 영향도 공부하실 수 있습니다. 정화 망막 신경절 세포의 Reaggregates은 최근 다른 세포 3의 부재에 oligodendrocytes과 cocultures에서...

신경 세포와 glia 개발 연구 랫 두뇌 집계 문화의 준비

Preparation of Rat Brain Aggregate Cultures for Neuron and Glia Development Studies

중추 신경계의 성숙 뉴런과 glia (CNS)에 progenitors의 recapitulates 개발과 차별화는 axo - glial 상호 작용, 속성과 multipotent progenitors의 분화, 그리고 oligodendroglial의 진행을 조사 neuroscientists위한 강력한 플랫폼을 제공하는 것이 체외 시스템 세포 및 분자 수준에서 세포 혈통. 우리는 여기 3~4주에 혈청이없는 배지에서 유지 수 있으며, 신경 세포 - glia 상호 작용과 CNS의 myelination을 연구하는 모델로 저희 연구실에서 사용되는 배아의 쥐 forebrains에서 CNS의 집계 문화 시스템을 설명합니다. 이 비디오 클립은 E16 쥐의 두뇌에서 이러한 CNS의 집계 문화를 분리하고 성장하는 방법을 보여줍니다. 또한, 동일한 뇌 해부에서 매우 풍부한 정기 dissociated의 연결을 문화가 쉽게 얻을 수 있으며, 다양한 연구에 사용 CNS의 뉴런 또는 다른 세포 공동 배양에 사용.

배아 쥐의 두뇌 집합의 문화 시스템을위한 프로토콜이 설명되어 있습니다. 집계에 Multipotent progenitors 개발하고 뉴런, astrocytes 및 oligodendrocytes로 구별하실 수 있습니다.

신경 세포와 Glia 개발 연구 랫 두뇌 집계 문화의 준비

중추신경계(CNS)에서 전구세포가 성숙한 뉴런과 글리아로 발달하고 분화하는 과정을 재현하는 인비트로(in vitro) 시스템...

중추신경계(CNS) 신경 전구세포가 성숙한 뉴런과 글리아 세포로 발달하고 분화하는 과정을 배양하기 위한 시스템을 소개합니다. 이 절차는 E 16 쥐 태아로부터 4개의 뇌를 분리하여 프로판(propane)으로 소화시키는 것으로 시작합니다. 조직은 단일 세포 현탁액으로 만들어 여과 및 계수 후, 6개로 분산됩니다.응집체 형성을 위해 웰 플레이트의 세포를 2~3일 동안 하루에 한 번씩 부드럽게 재부유시킵니다. 그 후 응집체를 수집하여 200 µm 메쉬로 체질하고, 세척을 통해 작은 덩어리와 세포 파편을 제거합니다. 마지막으로, 응집체의 수를 센 후 매트리젤(matrigel)이 코팅된 커버 슬립에 분주합니다.안녕하세요, 저는 Texas A&M University 수의통합생명과학과의 Dr. John L 연구실 소속 Coto입니다. 오늘은 뇌 응집체 배양 절차를 보여드리겠습니다. 저희 연구실에서는 내세포 계통, 세포 발달 및 세포 간 상호작용을 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다.이제 시작해 보겠습니다. 시작하기 전에 멸균 도구, 70% ethanol, 작업용 기저귀 패드, 그리고 얼음 위에 보관된 해부용 10 centimeter 페트리 접시를 벤치 위에 준비하십시오.후드 내에서 아이스 플랫폼이 설치된 해부 현미경과 얼음 위에 놓인 10cm 해부 배지 접시 여러 개를 준비합니다. 마지막으로, 사용할 용액들을 조제하고 플레이팅 배지를 항온수조에서 37°C로 가온합니다. Sprague-Dawley 쥐의 배아 16일차(E 16) 배아를 수확하는 것으로 본 프로토콜을 시작합니다.먼저 기관 동물실험윤리위원회(IACUC)에서 승인한 절차에 따라 임신한 암컷 쥐를 안락사시킵니다. 안락사시킨 쥐를 기저귀 패드 위에 놓고 복부를 알코올로 뿌려 세척합니다. 다음으로, 핀셋을 사용하여 복부 피부를 집고, 다른 손으로 가위를 이용해 피부만 절개한 후 피부를 벌립니다. 그 다음 멸균된 다른 핀셋과 가위를 사용하여 근육층을 절개합니다.다음으로 자궁을 적출하여 얼음처럼 차가운 해부 배지가 담긴 10 centimeter 디쉬로 옮깁니다. 다음 단계는 후드 내에서 미세 해부 가위를 사용하여 진행합니다. 자궁에서 각 배아를 조심스럽게 제거합니다.이제 수확하고 시작할 시간입니다. 배아 뇌를 이용해 작업하십시오. 각 배아에서 뇌를 수확하여 분리된 뇌를 아이스 플랫폼 위의 해부 배지가 담긴 깨끗한 10cm 디쉬에 넣습니다. 해부 현미경 하에서 뇌의 해부를 마무리하십시오.중뇌와 후뇌 부분을 제거합니다. 미세 핀셋을 사용하여 막(meninges)을 제거하고, 남은 전뇌 조직을 해부 배지가 담긴 50 mL 팔콘 튜브로 옮깁니다. 이제 조직이 다음 단계를 위한 준비가 되었습니다.효소 소화를 통한 세포 해리. 소화를 시작하기 직전에 프로판과 트립신 억제제 필터의 신선한 용액을 조제하십시오. 이를 멸균한 후 항온 수조에서 37 °C로 가온하십시오.박리된 뇌에서 과량의 배지를 제거합니다. 그런 다음, 준비된 프로판 소화액 4 mL를 50 mL 튜브에 넣습니다. 해당 튜브를 37 °C 항온수조에서 정확히 5분 동안 배양합니다.시간이 되면 피펫을 사용하여 프로판 용액을 제거합니다. 다음으로, 갓 준비한 trypsin 억제제 용액 5 mL를 첨가하고 튜브를 37 °C 항온수조에 2~3분 더 둡니다. 시간이 되면 trypsin 억제제 용액을 제거합니다.트립신 억제제 용액을 이용한 배양 과정을 세 번 더 반복합니다. 마지막으로 트립신 억제제 용액을 제거한 후, 튜브에 따뜻하게 데운 플레이팅 배지 pm 20 milliliters를 추가합니다.이제 세포를 분산시키고 세척할 차례입니다. 모든 세포 덩어리가 사라질 때까지 10 mL 피펫으로 약 20~30회 반복하여 분산시키십시오. 그다음 100 ×g에서 7분 동안 원심분리합니다.이 시점에서 세포들이 서로 충분히 분리되어 있어야 합니다. 7분 후, 상층액을 제거하고 펠렛을 10 mL의 도말 배지에 재부유시켜 세포를 세척하십시오.그 후 다시 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 세척과 원심분리 과정을 반복합니다. 두 번째 세척 후의 단계입니다.펠릿을 10 mL의 응집 배양 배지에 다시 현탁시킨 후, 세포를 70 µm 세포 체(cell sieve)에 통과시킵니다. 마지막으로 혈구계수기(hemocytometer)를 사용하여 살아있는 세포 수를 측정합니다.이제 해리된 뇌세포가 응집체를 형성하도록 준비되었습니다. 세포 수를 센 후, 해리된 세포를 mL당 2×10⁶개의 밀도로 응집체 배양 배지에 부유시킵니다. 세포 부유액 2mL를 코팅되지 않은 6-well 플레이트의 각 웰에 옮겨줍니다.3일 동안 매일 세포를 부드럽게 재현탁합니다. P 1000 피펫을 사용하여 세포를 처리하며, 응집체 도말 당일에는 세포가 응집체를 형성하기 시작합니다. 세포를 3일 동안 배양한 후, 세포를 다시 부드럽게 재현탁하고 200 µm 메쉬를 통해 50 mL falcon tube로 여과합니다.응집체가 튜브 바닥으로 가라앉을 때까지 약 3~5분 동안 둡니다. 그런 다음 상층액을 조심스럽게 제거하고 배지를 첨가한 후, 응집체를 부드럽게 재부유시키고 다시 가라앉게 합니다. 이 과정을 여러 번 반복합니다.죽은 세포, 개별 세포 및 잔해물을 제거하기 위해, 현미경을 사용하여 상층액에 여전히 응집되지 않은 세포와 잔해물이 포함되어 있는지 확인하십시오. 응집체를 충분히 세척한 후, 동일한 배지에서 부드럽게 재부유시키고 응집체 수를 세어 농도를 결정하십시오. 그런 다음 응집체의 밀도를 50 µL당 약 25~30개의 응집체가 되도록 조정하십시오.이제 커버슬립에 응집체를 분주할 차례입니다. 응집체가 튜브 바닥으로 가라앉는 경향이 있으므로, 플레이팅을 위해 응집체 현탁액을 2 mL 에펜도르프 튜브 여러 개에 1000 µL씩 나누어 옮기는 것이 중요합니다. 이 단계에서 사용하는 커버슬립은 37 °C에서 하룻밤 동안 배양하여 세포 배양 기질인 Matrigel로 코팅된 상태여야 합니다.응집 현탁액의 분주가 완료되면, 매트리젤(Matrigel)이 코팅된 커버슬립이 들어 있는 배양 플레이트를 인큐베이터에서 꺼냅니다. 각 웰에서 용액을 제거합니다. 커버슬립을 따뜻한 PBS로 세척한 다음, DD H2O로 세척합니다.이제 커버슬립에 응집체를 분주하기 위한 응집체 파종 준비가 완료되었습니다. 응집체 현탁액이 든 튜브를 반전시켜 응집체가 고르게 분포되도록 혼합합니다. 그다음, 각 커버슬립의 중앙에 응집체 현탁액 50 µL를 분주합니다.응집체가 커버슬립에 균일하게 부착될 수 있도록 더 이상 흔들지 말고 플레이트를 조심스럽게 배양기로 다시 넣습니다. 응집체의 밀도가 매우 중요한데, 응집체가 서로 너무 가깝게 배치되거나 배치 밀도가 높으면 초기 부착 후 4~6시간이 지나 성장하면서 서로 융합되는 경향이 있습니다. 각 웰에 500 µL의 배양액을 첨가합니다.응집체 배양을 유지하려면 3~4일마다 배지를 절반 교체하십시오. 배지를 교체할 때 응집체가 흐트러지지 않도록 웰의 벽면을 따라 첨가하십시오. 응집체가 커버슬립에 부착되고 몇 시간이 지나면 응집체로부터의 외부 성장이 관찰될 수 있습니다.축삭은 처음 2주 동안 빠르게 성장하며 응집체 사이에 풍부한 연결을 형성합니다. Ggl 전구세포는 응집체 밖으로 방사형으로 이동하며, 시간이 지남에 따라 성상세포와 성숙한 희소돌기아교세포로 분화합니다. 지금까지 CS 응집체를 배양하는 방법을 살펴보았습니다.이 절차를 수행할 때, 용량을 적절하게 맞추고 응집물을 고르게 섞는 것이 중요합니다. 이것으로 모두 끝났습니다.시청해주셔서 감사합니다. 실험에서 좋은 결과 있으시길 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

여기서 우리는 glial 피더 층의 존재에 culturing 쥐 대뇌 피질의 뉴런에 대한 프로토콜을 제공합니다. 교양 뉴런은 극성을 설정하고 시냅스를 만들고, 이러한 전기 생리학, 칼슘 이미징, 세포 생존 assays, immunocytochemistry, 그리고 RNA / DNA / 단백질 분리 등 다양한 어플 리케이션에 사용하기 위해 glia에서 분리 수 있습니다.

차 쥐 두피 뉴런과 Glia의 Bilaminar의 공동 문화

두뇌의 세포 이질에서 기본 microglia를 분리하는 것은 생리적 및 병리 학적 조건에 모두 자신의 역할을 조사하는 것이 필수적이다. 이 프로토콜은 기계적인 고립과 높은 수율과 높은 순도를 제공 혼합 세포 배양 기술에 대한 실용적 기본 microglial 세포에 대해...

신생아 쥐 뇌 조직의 혼합 Glial 세포 배양의 기본 Microglia 격리

우리는 쥐 배아에서 hippocampal과 대뇌 피질의 신경 세포를 분리하고 문화에 빠른 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 우리가 거​​의 순수의 연결을 문화가 요구되는 실험을 수행할 수 있습니다.

쥐 배아 신경 세포의 분리 및 문화 : 빠른 프로토콜

이 비디오는 신경교세포의 3차원 배양을 확립하는 기술을 보여줍니다. 쥐 뇌 유래 신경교세포는 세포외 기질 성분을 포함하는 광가교결합 가능한 고분자 기질 내에 캡슐화되어 있습니다. 성장 배지에서 배양하면 신경교세포가 지지 매트릭스 내에서 증식하여 3차원 배양을 생성합니다.

쥐의 뇌 유래 신경교세포(Rat Brain-derived glial cell)의 3차원 배양 확립

본 연구의 목적은 쥐의 동계 내피 세포와 성상 세포의 공동 문화를 포함하는 생체 BBB 모델의 재현성을 확인하는 것이 었습니다. 내피 세포 단일 층은 높은 봉사자 낮은 LY 투과성을 발표했다. 특정 TJ 단백질의 발현은 염증과 운송 및 수용체의 기능에 기능적인 응답은 평가했다.

설정 - 업<em&gt; 체외</em쥐 뇌 혈관 벽의&gt; 모델 (BBB)​​ : BBB 불 침투성 및 수용체 매개 운송에 초점

우리는 라벨 및 신생아 쥐의 유전형과 그들로부터 차의 연결을 문화를 생성하는 절차에 대해 설명합니다. 유전자형은 신속하고 효율적이며 신뢰성 및 자동 핵산 추출 할 수 있습니다. 이 neonatally 치명적인 마우스와 유전자형의 이전 완료를 필요로 그들의 문화에 특히 유용합니다.

동물의 신속한 유전자형은 뇌 신경 세포의 차 문화 구축에 이어

유도만능줄기세포(iPSC), 일차 피질 뉴런 및 성상세포에서 유래한 뉴런으로 구성된 공동 배양 시스템을 생성하는 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 공동 배양 시스템을 통해 새로운 iPSC 유래 뉴런과 채널로돕신-2를 발현하는 기존 피질 뉴런 사이의 시냅스 접촉 및 회로 형성을 감지할 수 있습니다.

공동 문화 시스템에 신경 연결의 형성을 평가하기위한 Optogenetic 접근

우리는 수정하고 흥분 대뇌 피질의 뉴런 (12)에 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSCs)의 빠른 재현, 효율적인 분화를 설명하는 이전에 게시 된 프로토콜을 구현합니다. 특히, 우리의 수정은 네트워크 레벨에서의 전기 생리 학적 특성을 측정하기위한 마이크로 - 전극 어레이의 신경 세포 밀도 및 사용의 제어를 허용한다.

마이크로 전극 배열에 네트워크 활동을 측정하기위한 유도 다 능성 줄기 세포의 빠른 신경 세포의 분화

이 문서에서는 아교 세포 단층을 통해 반전 커버 글라스에 성장 저밀도 차 해마 신경 세포를 배양 프로토콜을 설명합니다. 신경 세포 및 아교 층 파라핀 왁스 비드에 의해 분리된다. 이 방법에 의해 성장 된 뉴런 고해상도 광학 이미징 및 기능 분석에 적합하다.

낮은 밀도 차 해마 신경 세포 문화

이 논문은 우수한 자궁 경부 신경교에서 배아 쥐 동정 뉴런의 격리 및 배양에 대해 설명합니다. 또한 면역 세포화학 염색및 질량 분광 분석을 위한 신경 추출물을 준비하기 위한 상세한 프로토콜을 제공합니다.

형태학적 및 프로테오믹 분석을 위한 배아 우수한 자궁 경부 간리아에서 쥐 동정 신경을 배양

여기서, 우리는 높은 수율과 재현성을 가진 배아 피질에서 뉴런 및 성상세포 농축 배양, 또는 뉴런 glia 배양을 확립할 수 있는 특정 배양 매체를 사용하여 간단한 접근법을 제시합니다.

이혈증에서 신경 신경-Glia 상호 작용의 역할을 공부 하기 위한 세포 배양 모델

배우세요 E16 랫 태아 뇌에서 신경 전구세포를 분리하여 집계 배양하는 방법을. 이 기술은 신경세포와 신경교세포로의 분화 과정을 연구하는 데 활용됩니다.

신경 세포와 Glia 개발 연구 랫 두뇌 집계 문화의 준비

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