신경 세포와 Glia 개발 연구 랫 두뇌 집계 문화의 준비

중추신경계(CNS) 신경 전구세포가 성숙한 뉴런과 글리아 세포로 발달하고 분화하는 과정을 배양하기 위한 시스템을 소개합니다. 이 절차는 E 16 쥐 태아로부터 4개의 뇌를 분리하여 프로판(propane)으로 소화시키는 것으로 시작합니다. 조직은 단일 세포 현탁액으로 만들어 여과 및 계수 후, 6개로 분산됩니다.

응집체 형성을 위해 웰 플레이트의 세포를 2~3일 동안 하루에 한 번씩 부드럽게 재부유시킵니다. 그 후 응집체를 수집하여 200 µm 메쉬로 체질하고, 세척을 통해 작은 덩어리와 세포 파편을 제거합니다. 마지막으로, 응집체의 수를 센 후 매트리젤(matrigel)이 코팅된 커버 슬립에 분주합니다.

안녕하세요, 저는 Texas A&M University 수의통합생명과학과의 Dr. John L 연구실 소속 Coto입니다. 오늘은 뇌 응집체 배양 절차를 보여드리겠습니다. 저희 연구실에서는 내세포 계통, 세포 발달 및 세포 간 상호작용을 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다.

이제 시작해 보겠습니다. 시작하기 전에 멸균 도구, 70% ethanol, 작업용 기저귀 패드, 그리고 얼음 위에 보관된 해부용 10 centimeter 페트리 접시를 벤치 위에 준비하십시오.

후드 내에서 아이스 플랫폼이 설치된 해부 현미경과 얼음 위에 놓인 10cm 해부 배지 접시 여러 개를 준비합니다. 마지막으로, 사용할 용액들을 조제하고 플레이팅 배지를 항온수조에서 37°C로 가온합니다. Sprague-Dawley 쥐의 배아 16일차(E 16) 배아를 수확하는 것으로 본 프로토콜을 시작합니다.

먼저 기관 동물실험윤리위원회(IACUC)에서 승인한 절차에 따라 임신한 암컷 쥐를 안락사시킵니다. 안락사시킨 쥐를 기저귀 패드 위에 놓고 복부를 알코올로 뿌려 세척합니다. 다음으로, 핀셋을 사용하여 복부 피부를 집고, 다른 손으로 가위를 이용해 피부만 절개한 후 피부를 벌립니다. 그 다음 멸균된 다른 핀셋과 가위를 사용하여 근육층을 절개합니다.

다음으로 자궁을 적출하여 얼음처럼 차가운 해부 배지가 담긴 10 centimeter 디쉬로 옮깁니다. 다음 단계는 후드 내에서 미세 해부 가위를 사용하여 진행합니다. 자궁에서 각 배아를 조심스럽게 제거합니다.

이제 수확하고 시작할 시간입니다. 배아 뇌를 이용해 작업하십시오. 각 배아에서 뇌를 수확하여 분리된 뇌를 아이스 플랫폼 위의 해부 배지가 담긴 깨끗한 10cm 디쉬에 넣습니다. 해부 현미경 하에서 뇌의 해부를 마무리하십시오.

중뇌와 후뇌 부분을 제거합니다. 미세 핀셋을 사용하여 막(meninges)을 제거하고, 남은 전뇌 조직을 해부 배지가 담긴 50 mL 팔콘 튜브로 옮깁니다. 이제 조직이 다음 단계를 위한 준비가 되었습니다.

효소 소화를 통한 세포 해리. 소화를 시작하기 직전에 프로판과 트립신 억제제 필터의 신선한 용액을 조제하십시오. 이를 멸균한 후 항온 수조에서 37 °C로 가온하십시오.

박리된 뇌에서 과량의 배지를 제거합니다. 그런 다음, 준비된 프로판 소화액 4 mL를 50 mL 튜브에 넣습니다. 해당 튜브를 37 °C 항온수조에서 정확히 5분 동안 배양합니다.

시간이 되면 피펫을 사용하여 프로판 용액을 제거합니다. 다음으로, 갓 준비한 trypsin 억제제 용액 5 mL를 첨가하고 튜브를 37 °C 항온수조에 2~3분 더 둡니다. 시간이 되면 trypsin 억제제 용액을 제거합니다.

트립신 억제제 용액을 이용한 배양 과정을 세 번 더 반복합니다. 마지막으로 트립신 억제제 용액을 제거한 후, 튜브에 따뜻하게 데운 플레이팅 배지 pm 20 milliliters를 추가합니다.

이제 세포를 분산시키고 세척할 차례입니다. 모든 세포 덩어리가 사라질 때까지 10 mL 피펫으로 약 20~30회 반복하여 분산시키십시오. 그다음 100 ×g에서 7분 동안 원심분리합니다.

이 시점에서 세포들이 서로 충분히 분리되어 있어야 합니다. 7분 후, 상층액을 제거하고 펠렛을 10 mL의 도말 배지에 재부유시켜 세포를 세척하십시오.

그 후 다시 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 세척과 원심분리 과정을 반복합니다. 두 번째 세척 후의 단계입니다.

펠릿을 10 mL의 응집 배양 배지에 다시 현탁시킨 후, 세포를 70 µm 세포 체(cell sieve)에 통과시킵니다. 마지막으로 혈구계수기(hemocytometer)를 사용하여 살아있는 세포 수를 측정합니다.

이제 해리된 뇌세포가 응집체를 형성하도록 준비되었습니다. 세포 수를 센 후, 해리된 세포를 mL당 2×10⁶개의 밀도로 응집체 배양 배지에 부유시킵니다. 세포 부유액 2mL를 코팅되지 않은 6-well 플레이트의 각 웰에 옮겨줍니다.

3일 동안 매일 세포를 부드럽게 재현탁합니다. P 1000 피펫을 사용하여 세포를 처리하며, 응집체 도말 당일에는 세포가 응집체를 형성하기 시작합니다. 세포를 3일 동안 배양한 후, 세포를 다시 부드럽게 재현탁하고 200 µm 메쉬를 통해 50 mL falcon tube로 여과합니다.

응집체가 튜브 바닥으로 가라앉을 때까지 약 3~5분 동안 둡니다. 그런 다음 상층액을 조심스럽게 제거하고 배지를 첨가한 후, 응집체를 부드럽게 재부유시키고 다시 가라앉게 합니다. 이 과정을 여러 번 반복합니다.

죽은 세포, 개별 세포 및 잔해물을 제거하기 위해, 현미경을 사용하여 상층액에 여전히 응집되지 않은 세포와 잔해물이 포함되어 있는지 확인하십시오. 응집체를 충분히 세척한 후, 동일한 배지에서 부드럽게 재부유시키고 응집체 수를 세어 농도를 결정하십시오. 그런 다음 응집체의 밀도를 50 µL당 약 25~30개의 응집체가 되도록 조정하십시오.

이제 커버슬립에 응집체를 분주할 차례입니다. 응집체가 튜브 바닥으로 가라앉는 경향이 있으므로, 플레이팅을 위해 응집체 현탁액을 2 mL 에펜도르프 튜브 여러 개에 1000 µL씩 나누어 옮기는 것이 중요합니다. 이 단계에서 사용하는 커버슬립은 37 °C에서 하룻밤 동안 배양하여 세포 배양 기질인 Matrigel로 코팅된 상태여야 합니다.

응집 현탁액의 분주가 완료되면, 매트리젤(Matrigel)이 코팅된 커버슬립이 들어 있는 배양 플레이트를 인큐베이터에서 꺼냅니다. 각 웰에서 용액을 제거합니다. 커버슬립을 따뜻한 PBS로 세척한 다음, DD H2O로 세척합니다.

이제 커버슬립에 응집체를 분주하기 위한 응집체 파종 준비가 완료되었습니다. 응집체 현탁액이 든 튜브를 반전시켜 응집체가 고르게 분포되도록 혼합합니다. 그다음, 각 커버슬립의 중앙에 응집체 현탁액 50 µL를 분주합니다.

응집체가 커버슬립에 균일하게 부착될 수 있도록 더 이상 흔들지 말고 플레이트를 조심스럽게 배양기로 다시 넣습니다. 응집체의 밀도가 매우 중요한데, 응집체가 서로 너무 가깝게 배치되거나 배치 밀도가 높으면 초기 부착 후 4~6시간이 지나 성장하면서 서로 융합되는 경향이 있습니다. 각 웰에 500 µL의 배양액을 첨가합니다.

응집체 배양을 유지하려면 3~4일마다 배지를 절반 교체하십시오. 배지를 교체할 때 응집체가 흐트러지지 않도록 웰의 벽면을 따라 첨가하십시오. 응집체가 커버슬립에 부착되고 몇 시간이 지나면 응집체로부터의 외부 성장이 관찰될 수 있습니다.

축삭은 처음 2주 동안 빠르게 성장하며 응집체 사이에 풍부한 연결을 형성합니다. Ggl 전구세포는 응집체 밖으로 방사형으로 이동하며, 시간이 지남에 따라 성상세포와 성숙한 희소돌기아교세포로 분화합니다. 지금까지 CS 응집체를 배양하는 방법을 살펴보았습니다.

이 절차를 수행할 때, 용량을 적절하게 맞추고 응집물을 고르게 섞는 것이 중요합니다. 이것으로 모두 끝났습니다.

시청해주셔서 감사합니다. 실험에서 좋은 결과 있으시길 바랍니다.