Name: 형광등을 통해 F - 굴지 역학 라이브 셀 이미징은 현미경을 스페클 (FSM) (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-05T19:00:00.000+00:00
Duration: 19 min 16 s
Description: 학습하세요 형광 스펙클 현미경법을 사용하여 살아있는 세포에서 세포골격 단백질 역학을 연구하는 방법을. 미세주입과 이미징 챔버 조립을 통해 광표백을 최소화하고 정량적 측정이 가능합니다.

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qFSM의 발달은 NIH 부여 U01 GM06230에 의해 후원됩니다.

섹션 1 : FSM에 대한 찬란 분류 굴지 구하기 자료가 필요합니다 : 굴지, 형광단을 (알렉사, X - rhodamine 권장) 정화. G - 버퍼, 초원 심 분리기 <ol><li> 좋은 FSM 영화를 인수하는 핵심 구성 요소는 선택의 형광단과 굴지의 적절한 라벨링 (또는 다른 cytoskeletal 단백질)이 필요합니다. 우리는 알렉사의 fluorophores (488, 568 파장)와 굴지의 표면에 리신 잔류물을 노출 대상 X - rhodamine succinimidyl 에스테르 유도체를 사용하는 것이 좋습니다. </li><li> 귀하의 형광단과 적절한 파장을 선택하면 형광 태그를 수용하기 위해 (수은 아크 램프 및 / 또는 레이저)하여 현미경 설치 프로그램이 적절한 필터 (여기 및 방출)과 illuminators을 가지고 있는지 확인합니다. 우리는 자동 형광 및 사진 손상의 영향을 최소화하고, GFP - conjugates와의 호환성을 보장하기 위해 빨간색 파장 (560-630 nm의)에 주황색의 파장을 선택하는 것이 좋습니다. </li><li> 순수의 굴지는 쥐 또는 치킨에 속하는 근육 조직에서 추출한지만, 근육 아세톤 분말에서 장기 적출 수술을 필요로하실 수 있습니다. 근육 아세톤 가루는 Invitrogen에서 구입하실 수 있습니다. 라벨의 절차는이 프로토콜에 설명되어 있지 않지만, 여기에 [1]에서 찾을 수 있습니다 </li><li> 또는 Cytoskeleton 주식 및 Invitrogen 포함한 여러 공급 업체에서 표시 굴지의 단백질을 구입할 수 있습니다. 사용자 정의 라벨 서비스는 Invitrogen 통해서도 사용할 수 있습니다. 정화가 아닌 레이블 굴지는 (근육 nonmuscle의 굴지 모두) Cytoskeleton 주식 회사에서 구입하실 수 있습니다 </li><li> 자신의 레이블 굴지 구매하거나 준비할지 여부를 결정, 당신은 상표의 비율이 굴지의 모노머 당 0.3-0.7 염료 근처 있는지 확인 싶어. 너무 높은 상표의 비율이 너무 낮은 라벨의 비율이 가난​​한 찾고 speckles (소음이 낮은 신호)로 연결되지만, 굴지의 필라멘트의 매출의 반응 속도론 (및 연관된 단백질에 결합) 효과를 수 있으며, microinjection 문제를 (아래 참조)가 발생할 수 있습니다. 이것은 좋은가 이미지를 작은 반점 얻을 수 중요한 요소입니다. </li><li> 장기 보관하기 전에, 표시 굴지 솔루션은 75,000의 회전에 의해 명확히해야합니다 - 섭씨 4도 20 분 동안 80,000 XG합니다. 분류 굴지는 G - 버퍼 솔루션에 저장되며 -80도 섭씨 보관해야합니다. 이 UL aliquots을 준비하는 것은 매우 반복 (불용성 집계로 연결) 냉동 - 해동의 해로운 영향을 감소하는 것이 좋습니다. (fluorophores의 photobleaching됩니다) 직접 조명으로 표시 굴지 솔루션을 노출 자제. 우리는 장기 저장을 위해 불투명 microcentrifuge 튜브를 사용하는 것이 좋습니다. </li></ol> 섹션 2 : 레이블 굴지의 세포 Microinjection의 작성 자료가 필요합니다 : microinjection의 바늘, microsyringe, microloaders, prewarmed 세포 미디어, 사출 버퍼, 얼음 양동이, 현미경 (위상 링, 40X 위상 대비 목표, transjector, 바늘 풀러, micromanipulator)를 <ol><li> 많은 세포 유형은 FSM 의무가 있지만, 좋은가 이미지를 작은 반점 받고하면 microinjection 절차의 성공에 직접적으로 의존한다. FSM에 대한 세포를 선택할 때, 세포가 (&gt; 50 음 직경) 대형되어야 확산해야 할 때 도금하고, 기판 (또는 플라스틱 조직 문화 요리)로 자연 자기편 수 있습니다. 세포의 cytosol는 핵보다 큰 영역을 차지하고있다면 그것은 또한 도움이됩니다. 상기 기준은 세포 microinjection 의무가 있는지 확인합니다. 성공적인 후보 세포 라인 (그러나 이에 국한되지 않음) PtK1 [2,3], 뉴트의 폐 세포 [4], 그리고 Aplysia의 뉴런 [3]. 포함 </li><li> 산성 - 세탁되었습니다, 전지는 평방 유​​리 coverslips (NO 1-1/2. 22 X 22mm)를 도금한다. 표준 기판 코팅은 coverslip에 적용할 수 있으며 microinjection에 영향을 미치지 않습니다. </li><li> microinjection의 바늘의 올바른 선택 팁 개방의 크기에 따라 달라집니다. 일반적으로, 구멍 크기는 수 매우 크기 0.5 음의 크기 3으로 음. 그러나, 우리는 굴지의 주입은 0.5-1 음 사이의 최적의 오프닝 크기를 필요로하는 것이 좋습니다. 막히는 문제가 지속적으로 발생하는 경우에는 큰 구멍 크기는 monomeric의 전달뿐만 아니라 불필요한 polymerized 굴지의 필라멘트에 대해 수용할 수 있습니다. Microinjection의 바늘은 femtotip의 microinjection의 바늘을 Eppendorf 시스템을 포함한 여러 공급 업체를 통해 구입할 수 있습니다. 상업 바늘 풀러를 사용할 수있는 또는 경우, 유리 microinjection 튜브는 셔터에서 구입하고 사양을 뽑았 수 있습니다. 초보자를위한, 우리는 사출 절차를 시작하기 전에 손에 10-20 뽑아 바늘을 가지고하는 것이 좋습니다. </li><li> 굴지의 이상적인 &#39;주입 농도&#39;(당신의 바늘에 로드된 굴지의 최종 농도)는 UG / UL 1.0-0.5 사이의 굴지의 단량체에 염료의 40 % 라벨 비율에 따라 달라집니다. 당신의 굴지의 낮은 라벨 비율은 높은 농도 (1-3 UG / UL)의 주사에 의해 보상을 수 있습니다. 그러나 바늘의 막히는 빈도 것입니다수 증가. 이것은 부분적으로 큰 구멍 바늘을 사용하여 완화 할 수 있습니다. 굴지의 주식 농도는 얼음처럼 차가운 분사 버퍼를 추가하여 희석 수 있습니다. 차가운 ddH2O도 빠른 주사를 위해 희석하는 데 사용할 수 있습니다. 이 시점에서 모든 작업 솔루션은 얼음에 보관해야합니다. </li><li> microsyringe를 (좁은 게이지 - 해밀턴)를 사용하여 굴지 솔루션의 1.0 UL 로드할 0.5, 또는 양자 택일로 microloader 피펫 팁을 사용하여. </li><li> 조심스럽게 부드럽게 솔루션을 발표하여 굴지의 솔루션을 분배. 버블은 피해야한다지만, 쉽게 거품을 둘러싼 여분의 액체를 복용하여 제거할 수 있습니다. </li><li> 굴지 솔루션 바늘 끝에 완전히 쉬고 있는지 확인하십시오. 어디 바늘의 모세관을 따라 초과 솔루션은 사출 흐름을 중단하실 수 있습니다. </li><li> 이제 조심스럽게 인젝터 홀더로, 바늘 끝과 접촉을 피하기 위해, 바늘을 부착합니다. 바늘이 현미경 단계의 기본에 35-50도 각도를 만드는 있도록 홀더를 놓습니다. 낮은 각도가 선호됩니다. </li><li> 그것이 거의 당신의 세포를 목욕 매체의 표면을 나누기 전까지는 바늘의 팁을 낮춥니다. </li><li> 그것이 바로 목적의 중앙 위에 달려 있도록 이제 바늘 팁을 (낮추는없이) 위치. 바늘 끝이 목적에 부합하는 경우, 당신은 접안 렌즈를 통해 밝은 후광이 나타납니다. 이것은 바늘 끝의 끝 부분입니다. 천천히 (조작하는 사람을 사용하여)쪽으로 바늘 측면 이동은 헤일로를 찾아 더 도움이 될 수 있습니다. </li><li> 당신의 세포 클리어 뷰에있는 때까지 현미경에 Z - 초점을 조정합니다. 결국 바늘 끝에 수렴까지 헤일로가 점차 수축까지 이제 천천히 팁을 낮은 - 당신은 동시에 초점 (Z 위치)를 제어해야합니다. 찾기 위해 추가적인 기능은 선형 그림자됩니다 바늘의 샤프트입니다. 바늘을 줄이면 서서히 바늘 샤프트를 정의합니다. 정확하게 바늘과 세포의 끝을 마치면 모두 클리어 뷰에 있어야합니다. 상 반지의 약간의 조정은 대비를 향상시키기 위해 필요할 수 있습니다. </li><li> 탐색하면 바늘 끝이 잘 바늘 끝을 위반 방지하여 세포 위에 있는지 확인하십시오. </li><li> 주입하는 세포를 선택하면 무료로 가장자리와 세포는 바늘 끝에 직면해야합니다. 이것은 병렬 실행보다 바늘 팁, 오히려을 맞이할 것입니다 (핵이 얇고 지점​​, 첨단을있는 두꺼운 지점에서) 세포의 감소 기울기를 보장합니다. </li><li> 바늘 압력이 0.3-0.8 PSI에 설정되어야합니다. 적용 정압은 굴지 솔루션의 지속적인 흐름이 발생합니다. </li><li> 팁이 핵 (perinuclear 지역 핵은 바로 아래에 있지 않은 세포의 두꺼운 부분) 옆에되도록 주입하는 세포 결정 후 바늘을 위치. </li><li> 천천히 낮은, 그리고 바늘 끝이 막을 관통 때까지 팁을 지금, 점차적으로 낮은 멤브레인을 누르 때까지 바늘의 위치를​​ 재조정. 바늘이 완전히 막을 피어싱이있다면 당신이 더 이상 세포를 감동하지 않습니다 때까지이 차이점은 바늘을 올려 볼 수 있듯이, 세포는 곧 밝은 나타납니다. 실제 천공 및 주입 과정은 0.5-2 초 걸립니다. </li><li> 너무 많이 주입은 세포의 가장자리에 신속하게 철회가 발생합니다 반면, 제대로하면, 세포 모양이 변하지 나타나며 어떤 경우에는 당신은 실제로 세포 폭발 볼 수 있습니다. </li><li> (밝게하지 않음) microinjecting 때 세포의 변화를 볼 수 없다면, 바늘 끝이 닫혀있을 수 있습니다. 당신은 &#39;청소&#39;버튼을 귀하의 transjector에서 사용할 수있는 경우를 눌러이 테스트할 수 있습니다. 열려면, 이것은 크게 eyepieces을 통해 볼 수있는 일정한 압력의 흐름을 증가 - 파문 주변 부스러기가 분산 볼 수로 나타납니다. </li><li> 바늘 끝이 닫혀있다면, 따라서 팁의 끝부분의 원인, 새로운 microinjection 바늘이나 부드럽게 유리 coverslip에 대한 바늘 프레스 끝까지 바늘을 낮추는 방법으로 바늘의 팁을 깰 시도를 삽입하도록 선택할 수 있습니다 휴식 있습니다. 파손 영역은 바늘 지점 (A 지점으로 수렴 시작 바늘의 부분)의 면적의 1 / 5 일보다 더 이상이어야합니다. </li><li> 각 microinjection 세션 (세포 유형에 따라 달라집니다) 45 분 - 20 자 이하를 지출, 주사를 계속합니다. 일반적으로, 짧은 세션은 세포에 스트레스를 최소화하기 위해 권장합니다. </li><li> microinjection을 마치신 후, 신선한 prewarmed 미디어를 추가하여 접시에있는 세포 미디어를 변경합니다. 그렇다면 세포 이미징 전에 인큐베이터에서 30 분 동안 복구할 수 있습니다. 굴지는 기존의 cytoskeleton 네트워크에 통합할 수 있도록이 또한 수 있습니다. </li></ol> 섹션 3 : 이미징 회의소 조립 자료가 필요합니다 : coverglass, 이중 양면 테이프, Q - 팁, 포셉, valap, 김, oxyrase, 영상 미디어, 면도기 칼날, p200 파이를 닦아pette, 순수 에탄올 <ol><li> 영상 미디어를 prewarming 및 Oxyrase의 15 UL 나누어지는를 해동하여 시작합니다. 빛과 감광성의 oxyrase를 보호해야합니다. oxyrase의 또한 크게 photobleaching의 영향을 줄일 수 있습니다. </li><li> 낮은 핫 플레이트 온도를 설정하여, valap을 Prewarm. 그것이 밀봉 재로서의 효능을 잃게됩니다위한 valap를 과열 / 레코딩하지 마십시오. </li><li> 작은 부스러기를 청소하고 제거하는 순수한 에탄올과 함께 묻은 거 같아요 kimwipe와 coverglass을 닦아주십시오. </li><li> 플랫폼으로 깨끗한 평면을 사용하여 서로의 상단에 양면 테이프 두 동일한 크기의 길이를 (2.5 cm 길이), 스택. 완전히 평면 비행기를 만들 수있는 갇힌 공기 방울을 누르십시오. </li><li> 면도날을 사용하여, 각 스트립은 폭 0.5 cm를 측정하므로, 긴 축을 따라 2 명이나 스트립 잘라. </li><li> 포셉를 사용하여 테이프의 두 스트립이 coverglass의 중심에있는 격차를 만들어 있도록 coverglass의 긴 가장자리에 대해 각각의 스트립을 놓으십시오. 유리로 좋은 도장을 확인하기 위해 테이프에 부드럽게 누르십시오. 테이프의 스트립은 coverglass과 coverslip 사이에 스페이서 역할을합니다. </li><li> 당신이 다음 단계를 시작하기 전에 valap 완전히 액화 있는지 확인하십시오. </li><li> 미디어의 모든 500 UL에 oxyrase 15 UL을 추가하여 prewarmed 영상 미디어를 검색합니다. </li><li> 삼각형으로 접어 kimwipes 3 하드 가장자리를 만들 수 있습니다. 이것은에 붙어 테이프 건조 표면을 만드는 데 사용됩니다. </li><li> 인큐베이터에서 세포를 검색할 수 있습니다. 포셉 사용하여 coverslip의 모서리를 잡아. 빠르게 kimwipe에 coverslip (셀 사이드의 조직을 감동하지 최대 직면입니다) 장소, (당신의 세포의 나머지 표면에) 세미 드라이 표면을 만들 coverslip 두 반대 측면을 닦아 접힌 kimwipe을 사용합니다. </li><li> 포셉를 사용하여 건조 표면이 테이프의 두 스트립으로 정렬되도록 코너에게 coverslip를 잡아와 coverglass에 놓으십시오. 두 개의 닫힌 측면 두 열 가늘고 길게 찢어진 곳을 가지고 지금 확인할 수 있습니다. 가까운 오프닝에 영상 미디어 - oxyrase 솔루션 천천히 피펫 200 UL. 중요한 것은, 기포가 도입되지 않을 것입니다. 솔루션은 따라서 완전히 솔루션에서 세포를 immersing, 모세관 힘에 의해 새로 조립 챔버 속에 빨려해야합니다. </li><li> Q - 팁 소량 빠르게 접사에 녹아 valap하여 coverslip의 네 모퉁이를 사용하여 coverslip을 안정. 당신이 알게 될 그 즉시 valap 증발 (실온에서 초 이내). </li><li> 이제 오픈 측면 (비 테이프 쪽)으로 시작, Q - 팁을 사용하고 솔질 뇌졸중을 흉내낸하여 valap의 얇은 스트립이 있었 으니까요. 닫힌 측면에 대해 반복합니다. 천천히 따라서 코팅 단계를 반복하여 도장을 강화, valap의 겉옷을 구성할 수있었습니다. valap는 coverslip의 중심은 분명두고, 가장자리에 감금하셔야합니다. </li><li> 세포를 부셔하지 염두하고, 잔여 미디어를 제거하는 ddH2O과 Q - 팁을 사용하여 coverslip의 중심 부분을 부드럽게 닦아주십시오. 순수 에탄올로 세척 단계를 반복합니다. </li><li> 이제 이미지를 작은 반점에 최적화된 완전히 둘러싸인 이미징 챔버를해야합니다. 완전히 밀폐된 인클로저를 갖는 것은 빠르게 photobleaching에서 fluorophores 수 없게됩니다. </li></ol> 섹션 4 : 이미징 세포 자료가 필요합니다 : 거꾸로 위드 현미경, mecury 램프, 적절한 필터는 6.7 마이크론 픽셀, 높은 수치 개구, 오일 침지 계획 - Apochromatic 목표 (60X 100X하는 단계 또는 DIC)와 CCD 카메라를 냉각. 진동 테이블. 이미징 소프트웨어. <ol><li> 37도로 현미경의 무대를 Prewarm. 새로 완성된 이미지 챔버를 삽입하고, 이미지 이전 안정화 온도 10~15분을 기다립니다. </li><li> 브라이트 - 입력란에 세포를 집중하여 시작한 다음 올바른 형광 설정을 토글하여 주입 세포를 찾으십시오. photobleaching 줄이기 위해 형광 노출 시간을 최소화하기 위해보십시오. </li><li> 건강 곡선 최고의 가장자리를 주입 세포를 찾습니다. 오버 주입 전지 (셀 폭발) 수많은 filopodia를 닮은, 철회와 들쭉날쭉한 가장자리 특징으로한다 - 이미징이 세포를 피하십시오. </li><li> 인수 설정은 셀 유형, 레이블 굴지의 품질과 현미경 구성 요소에 따라 달라집니다. 그러나, 노출 설정이 이초보다 커야하지 말아야하고, 프레임 사이의 시간 간격은 5 10 초 사이로 설정해야합니다. 시계열에 대한 일반적인 길이 (몇 군데 세포 당) 어디 10~30분마다 다를 수 있으며, photobleaching 효과에 의해 제한됩니다. 카메라 게인 설정은 노이즈 신호를 증가까지 설정할 수 있습니다. </li><li> 이상이 특성은 다음 인근은 작은 반점으로 직경이 작은 반점 각각 ~ 2 간격 작은 반점 있어야 작은 반점을 찍다. 이것은 굴지 구조의 최적의 공간 및 시간적 샘플링을 보증합니다. 상피 세포의 경우 스페클드 굴지의 네트워크는 균일하게 떨어져 확산 speckles와 균일한 나타납니다. 조밀한 스트레스 섬유 또는 lamellipodia 기능 셀 라인구별되지만, 점선 / 스페클드 모양 것입니다. 노출 설정은 최고의 스페클드 이미지를 조정해야합니다. </li><li> 오버 microinjected 전지는 이산으로 나타나지 않는 밀도 포장 speckles을 것입니다. 스트레스 섬유와 lamellipodia은 점선 모양을 잃게됩니다. </li><li> 아래 - microinjected 세포가 멀리 떨어져 (&gt; 10 speckles 간격)와 무작위로 흩어져 나타나는 speckles을 포함, 접안 렌즈를 통해 매우 희미 나타납니다. 이러한 세포의 스트레스 섬유 lamellipodia는 구별할 수있을 것입니다. </li><li> &#39;좋은&#39;을 구하기 위해 주요 영화에 초점을 유지합니다 작은 반점을 찍다. 이것은 흐름과 매출 측정 작은 반점 관련된 사후 분석을 위해 특히 중요합니다. 따라서 정량 분석​​의 품질은 시간 경과 기간에 대한 초점 잠금에 따라 달라집니다. 이미지 비행기가 매우 얇은 경우 이것은 특히 도전하실 수 있습니다. 다른 요인은 특히 현미경 시스템의 안정성, 무대 주택 및 이미징 챔버에 따라 달라집니다. 이미지 간격 길이이 기능을 수용할 수 있도록 충분한있다면 대비 기반 초점을 사용할 수 있습니다. 다른 옵션은 안정적인 실시간 초점 조정을 제공하는 가까운 적외선 기반의 초점 시스템을 구입 있습니다. 당신은 니콘, 올림푸스와 ASI에서 이러한 제품을 찾을 수 있습니다. </li></ol> 섹션 5 : qFSM 분석 이 부분은 자세히 설명하지 않습니다,하지만 분석 소프트웨어에 대한 정보는 여기 [5]에서 찾을 수 있습니다. 소프트웨어 다운로드 요청은 홈페이지 (lccb.scripps.edu)에 만들 수 있습니다. 다루는 주제 : <ul><li> 노이즈 보정 </li><li> 감지 스페클 </li><li> 의 거친 움직임의 이미지 상관 관계 기반 추적의 하이브리드 접근 방식을 사용하여 추적하는 것은 지역과 개인 speckles의 세부 운동의 단일 입자 추적을 작은 반점을 찍다. </li><li> 동안 강도 변동의 폴리머 조립 및 분해 속도의 계산은 외관 및 실종 사건을 작은 반점을 찍다. </li></ul>

<ol><li>Waterman-Storer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+speckle+microscopy+%28FSM%29+of+microtubules+and+actin+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescent speckle microscopy (FSM) of microtubules and actin in living cells.</a> Curr Protoc Cell Biol. Chapter 4, Unit 4.10-Unit 4.10 (2002).</li>
<li>Ponti, A., Machacek, M., Gupton, S. L., Waterman-Storer, C. M., Danuser, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+distinct+actin+networks+drive+the+protrusion+of+migrating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two distinct actin networks drive the protrusion of migrating cells.</a> Science. 305, 1782-1786 (2004).</li>
<li>Zhang, X. F., Schaefer, A. W., Burnette, D. T., Schoonderwoert, V. T., Forscher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rho-dependent+contractile+responses+in+the+neuronal+growth+cone+are+independent+of+classical+peripheral+retrograde+actin+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Rho-dependent contractile responses in the neuronal growth cone are independent of classical peripheral retrograde actin flow.</a> Neuron. 40, 931-944 (2003).</li>
<li>Salmon, W. C., Adams, M. C., Waterman-Storer, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-wavelength+fluorescent+speckle+microscopy+reveals+coupling+of+microtubule+and+actin+movements+in+migrating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Dual-wavelength fluorescent speckle microscopy reveals coupling of microtubule and actin movements in migrating cells.</a> J Cell Biol. 158, 31-37 (2002).</li>
<li>Danuser, G., Waterman-Storer, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+fluorescent+speckle+microscopy+of+cytoskeleton+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biophys+Biomol+Struct%22%5BJournal%5D)">Quantitative fluorescent speckle microscopy of cytoskeleton dynamics.</a> Annu Rev Biophys Biomol Struct. 35, 361-387 (2006).</li>
</ol>

저자들은 공개할 사항이 없습니다.

성공적으로 이미지를 작은 반점 얻기위한 몇 가지 주요 요소가 중요한, 그러나 좋은 speckles 시작하고 찬란 레이블 굴지의 품질과 끝. 레이블이 붙은 단백질 자체가 용해 및 집계 무료되어야하는 동안 0.7-0.4 주위 설정 굴지 단량체에 염료의 높은 상표 비율은 speckles가 밝고 개별 나타납니다되도록합니다. 마찬가지로 중요한 microinjection 절차입니다. (과 생존) 정상 세포 항상성을 보장하기 위해, 전지 라벨 단백질의 낮은 농도를 소개 낮은 흐름의 압력으로 주입해야합니다. 이것은 microinjection 시스템의 사용에 관한 전문 지식 / 경험이 어느 정도 필요합니다. 일반적으로, 짧은 주사 시간 (&lt;1S) 이상 사출 회 이상 선호하고 있습니다. 마지막으로 중요한 구성 요소는 현미경입니다. 대부분의 핵심 시설에있는 수은 램프 에피 조명기,와 결합하여 거꾸로 현미경, 영상을 작은 반점을위한 적절한 플랫폼으로 될 것입니다. 높은 NA의 객관적이고 냉각 CCD 카메라의 조합이 밝은 speckles의 고해...

사출 버퍼 (IB) 50 MM 칼륨의 글루 탐 산염 0.5 M MgCl2 (부록 2A) -20 ° C에서 2 년 최대 쇼핑몰 &nbsp; G - 버퍼 이 MM 트리스 ⋅ Club 호텔, 산도 8.0 (부록 2A) 0.2 MM CaCl2 (부록 2A) 바로 사용하기 전에 추가 : 0.2 MM ATP (100 MM을위한 요리법을 참조) 2 - 메르 캅 토 에탄올 0.5 MM 4 일일까지 저장 ° C

형광등을 통해 f - 굴지 역학 라이브 셀 이미징은 현미경을 스페클 (fsm)

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

이 프로토콜에서는 형광등의 사용이 PtK1 셀에 굴지 역학 고해상도 이미지를 캡처하는 현미경 (FSM)을 스페클 설명합니다. FSM의 독특한 장점은 살아있는 세포 내에서 F - 굴지 네트워크의 움직임과 매출의 속도론 (조립 / 해체)을 캡처하는 능력입니다. 이 기술은 컴퓨터 비전 소프트웨어 (qFSM)와 결합하여 F - 굴지 역학의 양적 측정을 파생에 특히 유용합니다. 우리는 선택, microinjection 및 생활 세포에 형광 프로브 굴지의 시각화를 설명합니다. 중요한 것은, 유사한 절차는 다른 macomolecular 어셈블리를 시각화하기 위해 적용됩니다. FSM은 microtubules, 중급 필라멘트 및 부착 단지에 대한 증명되었습니다.

의 선택, microinjection, 그리고 영상은 형광을 통해 F - 굴지 찬란 - 라벨 (FSM) 현미경을 작은 반점을 찍다.

형광등을 통해 F - 굴지 역학 라이브 셀 이미징은 현미경을 스페클 (FSM)

본 프로토콜에서는 PtK1 세포 내 액틴 역학의 고해상도 이미지를 캡처하기 위한 형광 반점 현미경(Fluorescent Speckle Microscopy, FSM)의 사용 방법을 설명합니다. 독특한 ...

형광 스펙클 현미경(Fluorescent speckle microscopy)은 살아있는 세포 내 다양한 세포골격 단백질의 역학을 조사하는 데 사용됩니다. 올바르게 사용하면 세포골격 단백질의 속도와 턴오버 역학(turnover kinetics)을 정량적으로 측정할 수 있습니다. 본 절차는 살아있는 세포에 소량의 형광 표지 액틴을 미세 주입하는 것으로 시작합니다.그 다음, 광퇴색 효과를 줄이기 위해 이미징 챔버를 조립합니다. 먼저 셀 커버슬립이 놓일 마이크로 슬라이드의 양쪽에 두 개의 양면테이프를 부착합니다. 그런 다음, 열려 있는 슬릿 중 하나 근처에 이미징 배지를 분주하여 챔버 내로 배지를 주입합니다.마지막으로, 네 면을 모두 파라필름으로 밀봉합니다. 안녕하세요, 저는 Scripps Research Institute 세포생물학과의 Galden's Deucer 연구실 소속 James Lim입니다. 오늘은 형광 반점 현미경법(fluorescent speckle microscopy) 절차를 보여드리겠습니다.우리는 이 절차를 통해 이동하는 상피 세포의 액틴 역학을 조사합니다. 그럼 시작해 보겠습니다. 양질의 형광 스펙클 현미경 영상을 얻기 위한 핵심 요소는 선택한 형광 표지자로 액틴을 적절히 표지하는 것입니다. 우리는 액틴 표면의 노출된 라이신 잔기를 표적으로 하는 NHS 에스테르 유도체인 Alexa 및 Rhodamine 형광 표지자 사용을 권장합니다.장기 보관 전 스페클이 밝고 뚜렷하게 나타나도록 하려면, 액틴 단량체당 염료의 라벨링 비율이 0.3에서 0.7 정도로 높게 유지하는 것이 중요합니다. 4 °C에서 75,000에서 80,000 ×g로 20분 동안 원심 분리하여 라벨링된 액틴 용액을 정제합니다. 라벨링된 액틴은 G 버퍼 용액에 넣어 -80 °C에서 보관해야 합니다.반복적인 동결-해동은 불용성 응집물을 형성할 수 있으므로 2 µL씩 분주하여 준비하십시오. 형광 표지된 actin 용액의 광퇴색을 방지하기 위해 장시간 직접적인 빛에 노출시키지 말고, 장기 보관 시에는 불투명한 마이크로 원심분리 튜브를 사용하십시오. 마이크로인젝션을 위한 세포는 산 세척된 정사각형 유리 커버슬립 위에 준비합니다.표준 기질 코팅을 커버 슬립에 적용할 수 있으며, 이는 미세주입에 영향을 주지 않습니다. 미세주입에 적합한 세포를 선택할 수 있도록 액틴을 준비하는 동안 세포를 37°C에서 보관하십시오. FSM의 경우, 다음 기준을 고려하십시오.세포는 크기가 커야 하며, 직경이 50 µm 이상이어야 하고, 플레이팅 후 평평하게 퍼져 기질에 자연적으로 부착되어야 합니다. 또한 세포의 세포질이 핵보다 더 넓은 면적을 차지하는 것이 유리합니다. 적합한 세포주로는 PTK1, 뉴트 폐 세포 및 AIA 뉴런 등이 있습니다.본 시연에서는 PTK 1 상피 세포에 주입을 수행하겠습니다. 미세주입 바늘의 올바른 선택은 팁 개구부의 크기에 따라 결정됩니다. 일반적으로 구멍 크기는 0.5 micrometers에서 최대 3 micrometers까지 다양합니다.우리는 0.5에서 1 µm 사이의 최적의 개구부 크기를 권장합니다. 액톤(Acton) 미세주입용 바늘은 구매하거나 직접 제작할 수 있습니다. 상용 바늘 인입기(needle puller)를 사용할 수 있는 초보자의 경우, 주입 절차를 시작하기 전 10~20개의 인입된 바늘을 미리 준비해 두는 것을 권장합니다.다음 단계는 라벨링된 acton을 얼음처럼 차가운 주입 버퍼로 희석하는 것입니다. 모든 작업 용액은 얼음 위에 유지하십시오. 바늘에 적재되는 acton의 최종 농도인 이상적인 주입 농도는 0.5에서 1 µg/µL 사이입니다.D 대 액틴 단량체 부하량의 표지 비율을 40%로 설정하여, 희석된 액틴 용액 0.5~1 µL를 분주합니다. 마이크로 시린지 바늘을 사용하여 액틴 용액을 조심스럽게 분주하십시오. 이때 기포가 생기지 않도록 주의합니다.기포가 있는 경우, 기포 주변의 과잉 액체를 흡입하여 쉽게 제거할 수 있습니다. Acton 용액이 바늘 끝에 완전히 맺혀 있는지 확인하십시오. 바늘의 모세관을 따라 용액이 과하게 남아 있으면 주입 흐름을 방해할 수 있으므로 주의해야 합니다.이제 충전된 니들을 미세주입용 주입 홀더에 부착할 준비가 되었습니다. 인큐베이터에서 세포를 꺼내 커버슬립을 현미경 스테이지 위에 놓으십시오. 미세주입 절차를 시작하려면 충전된 니들을 현미경으로 가져갑니다.바늘 끝에 닿지 않도록 주의하며 주입기 홀더에 바늘을 부착합니다. 바늘이 현미경 스테이지 바닥과 35도에서 50도 각도를 이루도록 홀더를 배치합니다. 바늘 끝을 배양액 표면에 살짝 닿을 때까지 내립니다.이제 세포들이 바늘 끝을 대물렌즈의 중심 바로 위에 오도록 위치시킵니다. 바늘 끝이 대물렌즈와 정렬되었다면, 접안렌즈를 통해 밝은 헤일로가 보일 것입니다. 이것이 바늘 끝의 끝부분입니다.바늘을 좌우로 천천히 움직이면 헤일로(halo)의 위치를 더 잘 찾는 데 도움이 될 수 있습니다. 탐색 시 바늘 끝이 세포보다 충분히 위에 있는지 확인하십시오. 바늘 끝이 부러지는 것을 방지하려면, 세포가 선명하게 보일 때까지 현미경의 Z.Focus를 조절하십시오.그런 다음 초점을 조절하면서 바늘 끝을 천천히 내리면, 헤일로(halo)가 점차 좁아지다가 마침내 바늘 끝으로 수렴됩니다. 또한 선형 그림자를 형성하는 바늘의 축을 확인할 수도 있습니다. 바늘을 내리면 바늘 축의 형태가 점차 뚜렷해집니다.대조도를 높이기 위해 위상 링(phase ring)을 약간 조정해야 할 수도 있으며, 이제 바늘 끝과 세포가 모두 선명하게 보여야 합니다. 주입할 세포를 선택할 때, 세포의 자유단(free edge) 부분이 바늘 끝을 향하고 있어야 합니다. 이렇게 해야 핵이 위치한 가장 두꺼운 지점에서 앞쪽 가장자리의 가장 얇은 지점으로 이어지는 세포의 경사면이 바늘 끝과 평행하게 진행되지 않고 바늘 끝과 맞닿게 됩니다.바늘 압력을 0.3에서 0.8 PSI로 설정하십시오. 일정한 압력을 가하면 acton 용액이 꾸준하게 흐르게 됩니다. 주입할 세포를 결정했다면, 바늘 끝이 세포핵 옆에 오도록 바늘을 배치하고, 바늘 끝이 눌릴 때까지 천천히 낮추며 바늘의 위치를 재조정하십시오.바늘 끝이 막을 뚫을 때까지 바늘을 점진적으로 내립니다. 바늘이 막을 완전히 뚫으면 세포가 더 밝게 보입니다. 이러한 변화가 보이면 즉시 바늘을 들어 올려 더 이상 세포에 닿지 않게 합니다.실제 천공 및 주입 과정은 0.5초에서 2초 정도 소요됩니다. 올바르게 수행되었다면 세포의 모양은 변하지 않은 상태로 유지됩니다. 세포에 가해지는 스트레스를 최소화하기 위해, 각 미세주입 세션은 20분에서 45분을 넘기지 않도록 합니다.주입 시 세포에 변화가 보이지 않고 세포가 더 밝아지지 않는 경우가 있습니다. 이는 니들 팁이 막혔음을 나타낼 수 있습니다. 트랜스 인젝터(trans injector)에 클린(clean) 버튼이 있는 경우, 해당 버튼을 눌러 이를 확인할 수 있습니다.바늘 팁이 열려 있다면 정압 흐름이 크게 증가하며, 이는 잔해물의 분산 및 물결 모양의 흐름으로 나타날 수 있습니다. 바늘 팁이 막혀 있는 경우에는 새로운 미세주입 바늘을 삽입하거나, 바늘 팁이 유리 커버슬립에 닿을 때까지 바늘을 조심스럽게 내려 팁의 끝부분을 깨뜨려 개통을 시도할 수 있습니다. 이렇게 하면 팁의 맨 끝부분이 부러지게 됩니다.파손 부위는 마이크로인젝션이 끝났을 때 바늘 끝이 좁아지기 시작하는 부분인 바늘 팁 면적의 5분의 1을 초과해서는 안 됩니다. 형광 잔여물을 제거하기 위해 디시의 세포 배지를 미리 데워둔 신선한 배지로 교체하십시오. 배지를 교체한 후, 이미징 전까지 37 °C 인큐베이터에서 30분 동안 세포를 회복시키십시오.이는 세포가 인큐베이터에서 회복되는 동안 액틴이 기존의 세포골격 네트워크에 통합될 수 있도록 하며, 이제 이미징 챔버 조립을 시작합니다. 먼저, 이미징 배지를 37 °C 항온수조에서 예열하십시오. 다음으로, 15 µL의 oxa erase 분주액을 실온에서 해동하십시오.나중에 배지에 RA를 추가하면 광퇴색 효과를 크게 줄일 수 있습니다. oxa erase를 알루미늄 호일로 감싸 두면 광민감성 화합물이 빛으로부터 보호됩니다. VAP 씰런트를 저온으로 설정된 핫플레이트에서 미리 가열하십시오. VAP를 과열하거나 태우지 마십시오. 그렇지 않으면 씰런트로서의 효능이 떨어집니다.순수 에탄올을 적신 Kim wipe로 마이크로 슬라이드를 닦아 오염물을 제거하고 깨끗하게 청소합니다. 다른 마이크로 슬라이드와 같이 깨끗하고 평평한 표면 위에서 2.5 centimeter 길이의 동일한 크기의 양면테이프 두 조각을 서로 겹쳐서 쌓습니다. 플랫폼으로 사용할 수 있도록, 갇혀 있는 기포를 눌러 완전히 평평한 면을 만듭니다.다음으로, 면도날을 사용하여 테이프의 장축을 따라 너비가 0.5 centimeters인 직선 스트립 두 개를 자릅니다. 핀셋을 사용하여 각 스트립을 마이크로 슬라이드의 양쪽 긴 가장자리에 배치하여, 두 테이프 스트립 사이에 마이크로 슬라이드 중앙에 틈이 생기도록 합니다. 테이프를 살며시 눌러 유리 표면에 잘 밀착시킵니다.이 테이프 조각들은 마이크로 슬라이드와 커버슬립 사이의 스페이서 역할을 하게 됩니다. 밸브가 완전히 액화되었는지 확인하십시오. 다음 단계를 시작하기 전에, 미리 데워둔 이미징 배지를 준비하십시오.배지 500 µL당 oxy rays 15 µL를 첨가합니다. 화학용 와이프(chem wipe)를 삼각형 모양으로 접어 세 개의 각진 모서리를 만듭니다. 이는 나중에 커버슬립을 닦는 데 사용됩니다.포셉을 사용하여 인큐베이터에서 세포를 꺼냅니다. 커버슬립의 한쪽 모서리를 빠르게 들어 올립니다. 세포가 있는 면이 위를 향하게 하고 조직에 닿지 않도록 커버슬립을 킴와이프(Kim wipe) 위에 놓은 뒤, 접은 킴와이프를 사용하여 커버슬립의 서로 마주 보는 두 면을 닦아 반건조 상태의 표면을 만듭니다.그다음 핀셋으로 커버슬립의 한쪽 모서리를 잡아, 건조한 표면이 두 개의 테이프 조각과 일치하도록 마이크로 슬라이드 위에 커버슬립을 올립니다. 이제 두 면은 닫혀 있고 두 개의 틈이 열려 있음을 확인하십시오. 이미징 배지 RA 용액 200 µL를 한쪽 개구부 가까이 천천히 피펫팅합니다.기포가 유입되지 않도록 하는 것이 중요합니다. 용액은 모세관 힘에 의해 새로 조립된 챔버 안으로 흡수되어 세포가 용액에 완전히 잠겨야 합니다. 면봉을 사용하여 커버슬립의 네 모서리에 녹은 vap를 찍어 발라 커버슬립을 빠르게 고정하고 안정화하십시오.VAP가 상온에서 수초 내에 건조되는 것을 확인할 수 있습니다. 그런 다음, 닫힌 면부터 시작하여 면봉을 이용해 붓질을 하듯 VAP를 얇게 펴 바릅니다. 열린 면에 대해서도 동일하게 반복합니다.코팅 단계를 반복하여 vap 층을 천천히 쌓으며 밀봉 상태를 강화합니다. VAP는 커버슬립의 중앙 부분은 비워두고 가장자리에만 도포해야 합니다. 커버슬립의 가장자리가 밀봉되면, Q-tip에 DD H2O를 묻혀 커버슬립의 중앙 부분을 부드럽게 닦아내어 남아있는 배지를 제거합니다.세포가 파쇄되지 않도록 주의하십시오. 순수 에탄올로 이 세척 단계를 반복합니다. 이제 형광 스펙클 이미징에 최적화된 완전히 밀폐된 이미징 챔버가 준비되었습니다.완전히 밀폐된 챔버를 사용하면 floral fours의 광퇴색(photobleaching)이 빠르게 일어나는 것을 방지할 수 있습니다. 이제 완전히 밀폐된 챔버 내의 세포를 이미징할 준비가 되었습니다. 수은 램프, 에피 조명기(epi illuminator), 적절한 필터 및 오일 침수 대물렌즈가 장착된 도립 광학 현미경을 사용합니다.6.7 micron 픽셀의 냉각 CCD 카메라와 이미지 획득 소프트웨어를 사용하여 아포크로매틱 대물렌즈 이미지를 캡처합니다. 현미경 스테이지를 37 °C로 예열합니다. 이미징 챔버를 배치하고 이미징 전 온도가 안정화될 때까지 10분에서 15분 동안 기다립니다.온도가 안정되면 명시야(brightfield)에서 세포의 초점을 맞춘 다음, 적절한 형광 설정을 전환하여 주입된 세포를 찾으십시오. 광퇴색(photobleaching)을 줄이기 위해 형광 노출 시간을 최소화하십시오. 건강하고 곡선 형태의 선단부(leading edge)를 가진 주입된 세포를 찾으십시오.과잉 주입된 세포는 수많은 필로포디아(phyllo podia)와 유사한, 수축되고 들쭉날쭉한 가장자리가 특징입니다. 이러한 세포는 촬영하지 마십시오. 획득 설정은 세포 유형, 표지된 액틴의 품질 및 현미경 구성 요소에 따라 달라집니다.하지만 노출 설정은 2초를 초과해서는 안 되며, 프레임 간 시간 간격은 5~10초 사이로 설정해야 합니다. 신호 대 잡음비를 높이기 위해 카메라의 게인 설정을 높일 수 있습니다. 이상적인 스펙클 특성은 각 스펙클이 인접한 다음 스펙클과 약 2배의 스펙클 직경만큼 떨어져 있어야 합니다.상피 세포의 경우, 액틴 네트워크의 반점(speckle)이 균일하게 나타날 것입니다. 반점들이 일정한 간격으로 고르게 분포되어 있어야 합니다. 최적의 반점 이미지를 얻기 위해 노출 설정값을 조정해야 합니다.우수한 스펙클 영상을 얻기 위한 핵심은 초점을 유지하는 것입니다. 이는 특히 스펙클 흐름 및 회전율 측정을 포함하는 사후 분석에서 매우 중요합니다. 따라서 정량 분석의 품질은 타임랩스 촬영 기간 동안 초점을 얼마나 정확하게 고정하느냐에 따라 달라집니다.초점을 유지하기 위한 다양한 전략이 텍스트에 상세히 설명되어 있으며, 본 시연에서는 Nikon Perfect focus 시스템을 사용하겠습니다. 여기는 미세 주입된 세포의 다양한 예시입니다. 왼쪽 패널은 저농도 스펙클 이미지와 함께 미세 주입된 세포를 보여줍니다.가운데 패널은 너무 높은 농도로 미세 주입된 세포의 스펙클 이미지를 보여주며, 오른쪽 패널은 최적으로 주입된 세포를 보여줍니다. 양호한 스펙클 이미지를 얻기 위한 FSM의 예시입니다. 지금까지 형광 스펙클 현미경 관찰을 위해 상피 세포에 형광 표지된 actin을 미세 주입하는 방법을 살펴보았습니다.이 절차를 수행할 때, 라벨링된 acton의 품질과 미세주입 기술이 스펙클 이미지의 전반적인 품질을 결정한다는 점을 기억하는 것이 매우 중요합니다. 이것으로 모든 설명을 마치며, 귀하의 실험에 행운이 따르길 바랍니다.

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