Name: 마우스 망막 신경절 세포의 유전자 발현에 대한 utero 및 전직 생체내의 Electroporation에 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 25 min 6 s
Description: 학습하세요 마우스 망막 신경절 세포에서 유전자 발현을 조작하는 자궁내 및 생체외 전기천공 기술을. 이 방법은 시각 신경 발달과 축삭 경로 연구에 활용됩니다.

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우리는이 프로토콜에 대한 의견을 각각 utero 및 전직 생체내 망막 electroporation 기법에 도움을위한 닥터 리차드 발레와 Brikha Shrestha 감사, 박사 T. 사쿠라이. 이 작품은 보건 기금의 국립 연구소 F31 NS051008 (TJP), Fondation 부어 라 레쳐치 Medicale하고, 인간 프론티어 과학 프로그램 (AR)와 R01 EY12736 (CM)에 의해 지원되었다.

<ol><li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Eye+Retina+and+the+Visual+Systems+of+the+Mouse%22">Eye Retina and the Visual Systems of the Mouse</a>. Chalupa, L. M., Williams, R. W. , MIT Press. Cambridge. (2008).</li>
<li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 16-22 (2004).</li>
<li>Ishikawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+GDNF+gene+transfer+into+axotomized+retinal+ganglion+cells+using+in+vivo+electroporation+with+a+contact+lens-type+electrode%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Effect of GDNF gene transfer into axotomized retinal ganglion cells using in vivo electroporation with a contact lens-type electrode.</a> Gene Ther. 12, 289-298 (2005).</li>
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<li>Garcia-Frigola, C., Carreres, M. I., Vegar, C., Herrera, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+delivery+into+mouse+retinal+ganglion+cells+by+in+utero+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Gene delivery into mouse retinal ganglion cells by in utero electroporation.</a> BMC Dev Biol. 7, 103-10 (2007).</li>
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</ol>

이 비디오에서는, 우리는 배아 murine RGCs에 유전자 전달에 대한 utero과 전 생체내 두 electroporation 기법을, 증명하고있다. utero에서 망막 electroporation은 RGCs의 유전자 발현을 조작을위한 메커니즘을 제공하며 생체내에서 축삭의 전망을 시각화. 배아는 생존을 수 있도록하는 postnatally 그들의 목표에 이런 GFP + RGC 계획의 심사 허가, 측면 geniculate 핵 (LGN)가. 예 생체내 망막 electroporation은 체외의 assays에 사용하기 위해 특정 망막 지역을 대상으로 더 많은 제어 기능을 제공합니다. 생체내 및 이러한 기술에서 파생된 체외 분석에 결합하는 것은 별도로 정상을 배경으로 RGCs의 하위 집합에 RGC 개발 및 축삭의 예측의 철저한 특성화 수 있습니다. 우리의 시위는 utero과 전직 생체내 망막 electroporations 어떻게 유전자 발현 효과 RGC 차별화, 돌기 형태, electrophysiological 속성 버렸네 형성과 적절한에서 perturbations 이러한 종료 지역 타겟팅 공부를 위해 도움이 될 수 모두 광 chiasm에서 RGC 축삭지도에 초점을 맞추고 있지만 LGN과 우수한 colliculus로.

<table><tbody><tr><td>BTX Electro Square Porator ECM 830 (풋 페달 포함)</td><td>Harvard Apparatus</td><td>450052</td><td></td></tr><tr><td>원형 핀셋 전극</td><td>Nepa Gene</td><td>CUY650-5 또는 CUY650-7</td><td></td></tr><tr><td>실크 봉합사</td><td>Henry Schein</td><td>101-2636</td><td></td></tr><tr><td>플런저가 포함된 유리 마이크로피펫</td><td>Drummond Scientific</td><td>5-000-1001-X10</td><td></td></tr><tr><td>항생제-항진균제</td><td>Invitrogen</td><td>15240096</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 배지</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11330057</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8806-5G</td><td></td></tr><tr><td>ITS 보충제</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I-1884</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>메틸 셀룰로오스</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0512</td><td></td></tr><tr><td>유리 바닥 마이크로웰 디쉬</td><td>MatTek Corp.</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-ornithine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4957</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Invitrogen</td><td>23017-015</td><td></td></tr></tbody></table>

마우스 망막 신경절 세포의 유전자 발현에 대한 utero 및 전직 생체내의 electroporation에

In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells

망막 및 단독 출력 뉴런의 망막 신경절 세포 (RGC)은 이러한 세포 분화, 축삭지도, retinotopic 조직 및 버렸네 형성 [1]과 같은 생물 학적 질문을 검토하는 훌륭한 모델을 구성. 하나의 단점은 효율적이고 안정적으로 특히 달리 접근 murine 시각 통로에 생체내에 RGCs의 유전자 발현을 조작하는 무능력이다. 유전자 변형 생쥐는 유전자 발현을 조작하는 데 사용하지만,이 접근법은 종종 시간이 소요 비용이며, 원치 않는 부작용을 만들 수 있습니다. 여자에서 비켜 electroporation의 망막과 RGC 발전을 검사에 대한 RGCs의 유전자 발현을 조작하는 데 사용됩니다. 유사한 electroporation 기법은 신생아 마우스 새끼 개발되어 있지만 [2], 성인 쥐 [3], 그리고 배아 murine retinae은 체외에서 [4],이 전략의 아무 생체내에 RGC 개발 및 축삭의 예측의 전체 특성을 허용하지 않습니다. 이를 위해, 우리는 구체적으로 배아 murine RGCs [5, 6]을 대상으로, electroporation 두 응용 프로그램 utero와 다른 전직의 생체내 한을 개발했습니다. utero 망막 electroporation에, 우리는 misexpress 또는 downregulate RGCs에서 특정 유전자를과 같은 광학 chiasm 같은 중간 목표, 또는 같은 이름으로 대상 지역에서지도 결정의 시험을 허용, 생체내에서 Visual 경로를 통해 축삭의 계획을 따를 수 측면 geniculate 핵. 달리 야생 타입을 배경으로 RGCs의 일부에서 유전자 발현을 Perturbing하면 망막 경로를 통해 유전자 기능의 이해를 용이하게합니다. 또한, 우리는 체외에서 RGC 축삭의 성장을 분석을위한 동반자 기술을 개발했습니다. 우리는 배아 머리 전직의 생체내을 electroporate 수집하고 전체 망막을 품어 후 나중에 해당 retinae 며칠에서 explants을 준비합니다. 망막 explants는지도 단서 또는 기타 요인에 electroporated RGC axons의 반응을 조사하기 위해 체외의 assays의 다양한에서 사용할 수 있습니다. 요컨대, 기술의 집합은 misexpress 또는 downregulate 유전자를 RGCs과 크게 RGC 개발 및 축삭의 계획을 검토 연구를 지원해야하는 우리의 능력을 향상시킵니다.

여기에서 망막 신경절 murine 세포 (RGCs)의 유전자 발현을 조작 두 가지 기법을 제시<em&gt; utero에</em&gt;과<em&gt; 예 생체내</em&gt; electroporation. 이러한 기법은 한 유전자의 표현의 변경은 RGC 개발, 축삭지도 및 기능 특성에 미치는 영향 검토 수 있습니다.

마우스 망막 신경절 세포의 유전자 발현에 대한 utero 및 전직 생체내의 Electroporation에

망막과 그 유일한 출력 뉴런인 망막 신경절 세포(RGC)는 세포 ... 와 같은 생물학적 질문을 조사하기 위한 훌륭한 모델이 됩니다.

자궁 내 망막 전기천공법은 마취된 E 13.5~14.5 단계의 모동물의 복부를 절개하여 배아 사슬을 노출시키는 것으로 시작합니다. 배아당 한쪽 망막에 DNA를 주입하고 머리에 전기천공을 실시하여 RGC 전구세포가 DNA를 흡수하도록 합니다. E 18.5 단계에서 배아를 관류하면 GFP 양성 반응을 나타냅니다.Ex vivo 망막 전기천공법을 위해 망막과 시각 투사 경로를 분석합니다. E 13.5에서 14.5 단계의 머리를 배양 접시에 등쪽이 위로 오도록 고정한 후, 양쪽 망막의 주변부 등쪽 영역에 DNA를 주입하고 전기천공법을 시행합니다. 전체 망막을 40시간 동안 배양한 다음, GFP 양성 망막 절편을 플레이트에 도말하여 in vitro 배양 분석을 수행합니다.안녕하세요, 저는 컬럼비아 대학교 병리학, 세포생물학 및 신경과학과 Carol Mason 박사 연구실의 Tim Petros입니다. 오늘 저희는 자궁 내(in utero) 및 체외(ex vivo) 망막 전기천공법을 이용하여 배아 망막에 유전자를 도입하는 방법을 보여드리겠습니다. 저희 연구실에서는 망막 신경절 세포의 유전자 발현 조절이 특히 시신경 교차 부위에서 투사 경로를 어떻게 변화시키는지 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다.이제 시작하겠습니다. 자궁 내 망막 전기천공법을 시도하기 전에 적절한 준비가 필수적입니다. 마취제 준비, 도구 및 기구의 멸균, 주입용 DNA 용액 및 수술 후 사용될 항생제 및 항진균제 용액 준비, 수술 부위 소독 및 적절한 용액의 가온에 관한 자세한 내용은 서면 프로토콜을 참조하시기 바랍니다.미세 전극 풀러(micro electrode puller)를 사용하여 수술 전 팁이 미세한 마이크로 피펫을 준비해야 합니다. 자궁 내 전기천공법(in utero electroporation)을 위해 팁을 부러뜨려 각진 끝부분을 만듭니다. 먼저 E 13.5에서 E 14.5 단계의 어미 쥐 복강 내로 마취제 혼합액 0.15 milliliters를 주입합니다. 어미 쥐가 완전히 마취될 때까지 3분에서 7분이 소요되며, 이후 마취 여부를 확인해야 합니다.뒷발을 집어 동물에게 마취가 진행되는 동안 반응이 없는지 확인합니다. DNA 용액의 작은 조각을 잘라 5 µL를 파라미터 위에 피펫으로 분주합니다. 금속 와이어 플런저를 90도 각도로 구부려 끝을 가늘게 뽑은 마이크로 피펫에 삽입하고, 플런저를 사용하여 DNA 용액을 마이크로 피펫 안으로 흡입합니다.이제 마우스 배아를 외과적으로 노출시키십시오. 적절한 기술에 대해서는 Wal Inus 등의 JoVE 프로토콜을 참조하시기 바랍니다. 이제 전기천공을 수행할 준비가 되었습니다.첫 번째 단계는 망막의 방향을 적절하게 잡는 것입니다. 그런 다음 망막에 DNA를 주입하고 머리에 전기 천공법을 시행하겠습니다. 이제 시작하겠습니다.먼저, 망막이 이와 같이 위를 향하도록 방향을 잡습니다. 그런 다음 마이크로 피펫을 사용하여 양막을 뚫고 DNA를 망막에 직접 주입합니다. 자궁벽을 뚫고 나면 플런저를 눌러 DNA를 망막 내로 배출한 뒤, 플런저를 다시 당깁니다.따라서 DNA를 주입하고 나면, 녹색 염료가 양수와 망막을 채우는 것을 확인할 수 있습니다. 이제 주입을 완료했으므로 전기천공법을 시행할 준비가 되었습니다. 전기천공을 위해 전기천공 패들을 배아 주변에 배치하며, 이때 양극 패들을 전기천공을 수행할 망막 쪽에 인접하게 놓습니다.준비가 되면, 푸트 페달을 밟아 배아에 전류를 가합니다. 음전극 패들에 기포가 형성되는 것을 확인할 수 있으며, 이는 전기천공법이 성공적으로 수행되었음을 나타냅니다. 주입된 모든 배아에 대해 이 단계를 반복합니다.이것이 하나의 배아 망막에 DNA를 전기천공법으로 도입하는 방법입니다. 이 절차를 원하는 만큼 많은 배아에 반복하여 수행할 수 있습니다. 다만, 전기천공법을 시행하는 배아의 수가 많아질수록 어미가 배아를 유산시킬 가능성이 높아진다는 점에 유의하십시오.배아의 전기 유도를 마친 후, 배아가 모두 들어갔다면 손가락을 사용하여 배아 체인을 모체 안으로 밀어 넣어 마사지합니다. 복강 내에 항생제 및 항진균제 용액 약 2 mL를 붓습니다. 지혈 겸자와 포셉을 사용하여 절개 부위의 전면부에 이중 매듭을 지어 복막을 봉합하기 시작하고, 절개 부위의 후면부까지 단순 연속 봉합 방식으로 계속 진행합니다.마지막 루프를 사용하여 봉합사를 묶고 남은 봉합사를 잘라냅니다. 마지막으로, 스테이플러를 사용하여 절개 부위를 폐쇄합니다. 이를 위해 둔탁한 포셉으로 절개 부위의 앞쪽 피부를 들어 올립니다.피부를 복막과 주의 깊게 분리하십시오. 다음으로, 스테이플러의 치아 부분을 피부 주위에 배치하고 스테이플러를 눌러 절개 부위를 후단까지 계속 스테이플링하여 닫습니다. 이때 보통 5~7개의 스테이플이 필요합니다. 스테이플링이 완료되면 알코올 솜으로 스테이플 주변의 상처 부위를 닦아내십시오.모견을 가열 패드 위에서 회복시킨 후 새 케이지로 옮기십시오. 모견이 움찔거리거나 몸을 뒤척이기 시작하면, 통증과 불편함을 최소화하며 완전히 깨어나는 데 보통 15분에서 90분 정도 소요됩니다. 모견은 깨어난 직후와 이후 정해진 시간마다 buprenorphine을 투여받습니다.불편함이 지속되어 탈수 증상이 나타날 경우, 수술 후 약 2~4시간 뒤에 어미 쥐의 피하에 생리식염수 1 mL를 주입하십시오. 수술 후 24시간이 지나면 어미 쥐는 정상적인 행동을 회복하고 규칙적으로 음식을 섭취하고 물을 마셔야 합니다. 분석을 위해 E 18.5에 전기천공법이 적용된 망막을 적출하겠습니다.또는, 어미 쥐가 출산하도록 한 뒤 생후 특정 시기에 망막을 채취하여 추후 분석에 사용할 수 있습니다. 동물을 마취시킨 후, 스테이플 아래의 피부와 복막을 가위로 절개합니다. 복강과 자궁각을 노출시키기 위해 전기천공된 배아를 꺼내어, 사지를 통해 해부 접시에 배 쪽이 위로 향하도록 고정하고, 복부 피부와 복막을 절개한 뒤 늑골의 외측 부분을 절개하여 심장을 노출시킵니다.다음으로, 관류 바늘로 좌심실을 찌르고 미세 가위로 우심방을 절개합니다. 이제 관류를 시작하여 PFA가 약 60에서 90초 동안 흐르게 합니다. 올바르게 수행되었다면, 우심방으로 혈액이 배출되고 배아의 색이 창백해져야 합니다.관류가 끝나면 배아의 머리를 절단하고, 15밀리리터 원추형 튜브에 담긴 4% PFA에 머리를 수집합니다. 전기천공을 실시한 모든 배아와 모든 모체에 대해 이 절차를 반복합니다. 모든 배아의 수집이 완료되면 경추 탈구를 통해 모체를 안락사시킵니다.머리를 4% PFA에 넣고 4°C에서 하룻밤 동안 보관한 후 PBS로 수일간 세척합니다. PBS 세척이 완료되면 망막의 GFP 발현 성공 여부를 검사할 준비가 된 것입니다. 먼저 해부 접시에 머리를 고정하되, 망막이 위를 향하게 하고 PBS에 잠기도록 합니다. 26.5G 바늘을 사용하여 망막 주변의 피부를 제거하여 망막색소상피(RPE)가 드러나게 합니다.수정체 RPE 접합부의 복측 망막을 천공합니다. 다음으로, 미세 가위의 한쪽 끝을 이 구멍에 삽입하고 복측 망막에서 시신경 유두까지 수직으로 절개합니다. 이렇게 하면 망막을 꺼낼 때 방향을 잡을 수 있습니다.한 쌍의 포셉으로 복측 절개 부위의 RPE를 잡고, RPE를 망막에서 분리하십시오. 그리고 다른 포셉을 사용하여 RPE가 단단히 부착되어 있는 RPE-수정체 접합부에서 RPE를 망막으로부터 박리하십시오. RPE를 제거한 후, 포셉으로 수정체를 잡고 위쪽 및 바깥쪽으로 당겨 제거합니다.렌즈를 제거하려면 포셉을 망막 아래에 배치하여 조심스럽게 망막을 들어 올리고, 시신경 유두를 집어 망막을 분리합니다. 마지막으로 망막을 PBS가 채워진 웰로 옮깁니다. 이때 각 망막이 어느 머리에서 유래했는지 반드시 기록하십시오. 반대측 망막과 전기천공법이 적용된 다른 모든 배아에 대해서도 이 단계를 반복합니다. 형광 해부 현미경을 사용하여 모든 망막에서 GFP 양성 반응을 스캔하며, GFP 양성 반응이 나타나면 해당 배아의 전기천공법이 성공한 것이며 이 망막과 대응하는 뇌를 추가 분석을 위해 처리할 수 있습니다.ex vivo 망막 전기천공법 절차에는 in utero 전기천공법과는 다른 몇 가지 추가적인 준비 단계가 필요합니다. 무혈청 배지의 준비 및 산소 공급, 배양 접시 및 border assay 준비에 관한 자세한 내용은 서면 프로토콜을 참조하십시오. 동물을 마취시킨 후, 이전에 시연한 바와 같이 복강을 절개하고 전체 배아 체인을 제거하여 얼음 위의 D-M-E-M-F 12에 넣습니다.그 후 경추 탈골법을 사용하여 어미 쥐를 안락사시켜야 합니다. 가위로 자궁벽을 절개한 다음, 양막에서 배아를 꺼내 D-M-E-M-F 12에 수집하여 얼음 위에 둡니다. 배아의 머리를 제거하고 얼음 위의 DMEA 배지에 보관하며, 몸통은 폐기할 수 있습니다. 다음으로, 마우스 피펫이나 플런저 피펫을 사용하여 마이크로 피펫에 원하는 양의 DNA 용액을 채웁니다.그런 다음 머리 하나를 PBS가 담긴 해부 접시로 옮기고, 배측이 위로 오도록 핀으로 고정합니다. 주입을 위해 해부 현미경으로 이동합니다.이제 전기천공법(electroporation)을 시행할 준비가 되었습니다. 양측 망막의 주변부 배측에 DNA를 주입한 후, 머리 부분에 전기천공법을 실시하겠습니다. 이제 시작합니다.첫 번째 단계는 망막 위의 피부를 제거하는 것입니다. 이를 위해 핀셋을 사용하여 피부를 벗겨냅니다. 이제 양쪽 망막의 등쪽 부분이 보입니다.다음으로 양측 망막의 망막 색소 상피층 바로 아래에 DNA를 주입하겠습니다. 이를 위해 전극을 거의 수평 상태로 유지한 채, 망막의 가장 주변부 배측 부분을 통해 RPE를 관통합니다. 녹색 염료가 망막 공간을 채우고 PBS 용액으로 흘러나오는 것을 확인해야 합니다.이제 전기천공법을 시행할 차례입니다. 먼저 머리를 고정한 핀을 제거하십시오. 이제 패들을 사용하여 전기천공을 진행하며, 양극 패들이 머리의 복측에 위치하도록 해야 합니다.이제 머리를 패들 사이에 배치하되, 양극 패들을 복측 표면에 두고 다음과 같이 패들을 안정적으로 유지하기 위해 압력을 가합니다. 이제 전기천공을 수행하겠습니다. 패들과 머리 윗부분에 기포가 형성되는 것을 확인할 수 있습니다.이상입니다. 이제 머리를 배지가 담긴 접시로 옮기겠습니다. 이것으로 ex vivo 망막 전기천공법 과정을 모두 마칩니다.원하는 배아 및 DNA 조건의 수만큼 이 절차를 반복합니다. 이제 망막 배양을 준비하겠습니다. 모든 전극 준비를 마친 후, 4-웰 디쉬에 산소화된 SFM 용액 약 1.5 milliliters를 넣고 얼음 위에 보관합니다.주입할 각기 다른 DNA 용액마다 하나의 웰을 준비합니다. 그다음, 전기천공된 하나를 옮깁니다. 망막의 복측 또는 표적 부위의 반대편이 위를 향하도록 하여 D-M-E-M-F 12가 담긴 해부 접시에 놓습니다.미세 핀셋을 사용하여 RPE에 구멍을 내어 찢습니다. 이 구멍을 시작점으로 하여 망막 주변의 RPE를 벗겨냅니다. 배양 중에 망막이 스스로 붕괴될 수 있으므로 안구를 절단하거나 손상시키지 마십시오.RPE를 제거한 후, 망막 기저부의 시신경을 집게로 집어 망막을 밀어내어 분리하며, 이때 수정체는 그대로 둡니다. 분리한 망막을 4웰 디쉬 내의 산소 공급된 SFM으로 옮깁니다. 머리를 반대쪽으로 돌려 반대편 눈에서도 망막 제거 과정을 반복합니다.전기천공법을 수행한 모든 머리에 대해 이 단계를 완료하고, 산소가 공급된 SFM 내에서 망막을 37 °C로 40~48시간 동안 배양합니다. 망막 전체를 배양한 후, 산소가 공급된 SFM이 담긴 웰에서 망막을 꺼내 D-M-E-M-F 12가 들어 있는 페트리 접시 뚜껑으로 옮깁니다. 형광 해부 현미경을 사용하여 망막 하나를 선택하고, GFP 양성 발현 부위를 시각화합니다.다음으로, 마이크로 메스와 핀셋을 사용하여 망막의 GFP 음성 부분을 절제하여 제거하고, GFP 양성 망막 조각만 남깁니다. 절제 과정 내내 형광광과 일반광을 지속적으로 전환하며 확인하는 것이 도움이 됩니다. GFP 양성 망막만을 정밀하게 선택하기 위해, GFP 양성 망막 조각을 G-M-E-M-F 12가 들어있는 웰로 옮깁니다.한 웰(Well)의 모든 망막에 대해 이 단계를 반복하십시오. 각 DNA 조건마다 새로운 페트리 접시와 D-M-E-M-F 12 배지를 사용하여 GFP 양성 망막 조각들을 플레이팅을 위한 더 작은 망막 외편(explan)으로 박리하십시오. 해부 현미경을 사용하여 마이크로 메스로 큰 GFP 양성 망막 조각을 작은 외편으로 절단하십시오. 외편의 길이는 가로 세로 약 200 to 300 micrometers 정도여야 합니다.하나의 GFP 양성 망막 조각에서 약 4개에서 10개의 GFP 양성 망막 외편(explan)이 생성되어야 합니다. 모든 외편을 D-M-E-M-F 12가 담긴 웰에 수집하십시오. 수확한 모든 GFP 양성 망막 부위에 대해 이 단계를 반복하십시오. 모든 GFP 양성 망막 외편을 준비한 후, 라미네이트 코팅된 배양 접시에 0.4% methylcellulose가 첨가된 냉각 SFM 250 microliters를 추가하십시오.다음으로, GFP 양성 설명편(explan) 4~8개를 배양 접시로 옮기고 핀셋을 사용하여 각 설명편을 다각형 형태로 완만하게 배치하며, 이때 설명편은 접시의 중심과 가장자리 중간 지점에 위치하도록 합니다. 설명편의 어느 면이 RGC 층인지 확인합니다. 이는 RPE 결정을 통해 확인할 수 있는데, RPE 결정이 때때로 외망막층에 부착되어 있어 그 반대쪽 면이 RGC 층임을 나타냅니다.RGC 측면에도 대개 일부 세포 파편이 존재하며, 이는 RGC 층을 아래로 하여 적절하게 explan을 배치하는 데 도움이 됩니다. 포셉을 사용하여 explan의 중앙을 단단히 눌러 배양 접시 바닥의 유리 커버 슬립에 부착되도록 합니다. 모든 X explan을 배양 접시에 도말한 후 37 °C 인큐베이터로 옮깁니다.망막 X 외식편은 24시간 후에 풍부한 축삭 성장을 보이며, 이를 활용하여 수많은 인비트로(in vitro) 분석을 수행할 수 있습니다. 이후 4% PFA로 30분 동안 고정한 다음, 경계 분석(border assay)을 위해 면역 염색을 진행합니다. 4G FP 양성 외식편을 경계 분석을 위해 준비된 배양 접시로 옮깁니다.X 외식편들을 관심 기질의 형광 경계선과 평행하게 직선으로 배열합니다. 형광 해부 현미경 하에서 핀셋을 사용하여 외식편이 형광 경계선으로부터 약 50~150 micrometers 거리에 위치하도록 플레이팅합니다. 이때 두 형광 채널을 번갈아 가며 확인하여 녹색 외식편과 적색 경계선을 시각화합니다.다음으로 디쉬를 37 °C에서 24시간 동안 배양하여 RGC 축삭이 경계 기질에 도달할 수 있도록 충분한 시간을 줍니다. 그 후 X explan을 4% PFA로 30분 동안 고정한 뒤 면역 염색을 수행합니다. 이는 자궁 내 망막 전기천공법 이후에 진행됩니다.망막의 GFP 양성 RGC를 반손상 상태에서 시각화하기 위해 망막 홀 마운트(hole mount)를 준비할 수 있습니다. 시신경, 시교차 및 시삭 전체에 걸쳐 GFP 양성 축삭을 시각화하기 위해 시각 시스템을 준비할 수 있습니다. 또는, 망막과 RGC 경로를 가로지르는 전면 동결 절편을 제작하여 망막 내 GFP 양성 RGC 세포체와 시신경, 시교차 및 시삭 내의 축삭을 시각화하고 분석할 수 있습니다.모든 망막 축삭은 뉴로필라멘트 염색으로 시각화합니다. 또한, P4에서 P10 사이의 새끼 쥐를 수집하여 자궁 내 전기천공법을 통해 외측 슬상핵(LGN)에서의 RGC 축삭 표적화를 연구할 수 있습니다. P8에서, ex vivo 전기천공법 및 망막 이식물 배양 후 전체 RGC 투사를 표지하기 위해, 동측 망막에는 CTB LOR 5 94 적색 채널을, 대측 망막에는 CT bor 6 47 청색 채널을 주입하여 LGN 내의 GFP 양성 축삭을 확인할 수 있습니다.RGC 축삭의 일부는 RGFP 양성을 띠며, 각각 상단과 하단 이미지에서 볼 수 있듯이 저배율과 고배율 모두에서 명확하게 시각화할 수 있습니다. GFP 양성 축삭의 반응은 여기에 파란색으로 표시된 다양한 기질의 경계면에 XS를 도말하여 분석할 수 있습니다. 지금까지 자궁 내 및 ex vivo 망막 전기천공법을 이용하여 배아 거울 망막에 유전자를 도입하는 방법을 살펴보았습니다.본 분석에서는 시교차의 축삭 유도에 집중하였으나, 이 기술은 망막 신경절 세포의 분화, 수지상 돌기 형태 및 전기생리학적 특성을 연구하는 분들에게도 유용할 수 있습니다. 이 절차를 수행할 때, DNA 주입 시 망막 손상을 최소화하고 실험 전 과정 동안 배아가 PBS로 수분화된 상태를 유지하도록 하는 것이 중요합니다. 이것으로 모든 설명을 마치겠습니다.시청해 주셔서 감사드리며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

in-utero-ex-vivo-electroporation-for-gene-expression-mouse-retinal

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

마우스 망막 신경절 세포 Transfection로 생체내에 Electroporation

이득 또는 기능 연구의 손실 중 하나를 수행하기위한 목적으로 murine 망막 세포에 플라스미드 DNA의 결합을위한...

개발 마우스 망막의 생체내 Electroporation에

utero의 electroporation에서 개발 중추 신경계 (CNS)에서 공간과 temporally 제어 방식으로 신속한 유전자 전달 수 있습니다. 여기서 우리는 telencephalon, diencephalon 및 망막을 포함한 여러 배아 CNS의 도메인으로 표현 구조를 제공하는 데 사용할 수있는 utero의 electroporation 프로토콜에 매우 적응을 설명합니다.

사용하여 여러 개의 CNS 준주로 효율적인 유전자 전달 Utero에서 Electroporation

개발 뇌 마우스로 유전자 전송 방법은 고유한 수술 방법과 전극의 특별한 모양을 사용하여 설명합니다. 이 독특한 기술은 두뇌 개발을 공부에 많은 도움이됩니다 neuroscientists temporally과 공간 플라스미드 DNA의 transfection 수 있습니다.

마우스 Utero에 Electroporation : 통제 Spatiotemporal 진 Transfection

이 비디오의 전반적인 목표는 타겟 망막 주사를 수행하는 방법을...

배아 칙의 망막에서 비켜 Electroporation에

Midgestation 마우스 태아의 아래쪽 사방 정계 립의 시험 관내 Electroporation에

시상 하부의 기능 및 의료 중요성에도...

마우스의 유전자 조작을 통해 시상 하부 개발<em&gt; 자궁 내</em&gt; 일렉트로

이 절차는 자궁 내 전기천공법을 통해 발달 중인 마우스 전뇌의 인터뉴런을 표적으로 삼는 방법을 보여줍니다. 이 기술은 피질의 표재층으로 향하는 중간뉴런 아형에서 선택적 유전자 발현을 달성하는 데 특히 효율적이었습니다.

두피의 interneurons의 하위 유형 선택적 일렉트로

배아 병아리 망막 세포 배양은 광 수용체 생물학의 연구에 유용한 도구를 구성한다. 우리는 이전에 배양 망막의 플라스미드 일렉트로 오보 EX에 기초한 효율적인 유전자 전달 기술을 개발했다. 이 기술은 상당히이 시스템에 대한 가능한 유전자 조작을하고, 현재 사용 가능한 프로토콜을 통해 형질 전환 효율을 증가시킨다.

차 세포 배양 연구 병아리 망막에 효율적인 유전자 전송 : 전 비켜 Electroporation에 접근

우리는 ovo electroporation 및 Tol2 transposon 시스템을 사용하여 병아리 배아에 인공 마이크로 RNA 서열을 도입하고 게놈 통합하는 새로운 기능 상실 접근 방식을 개발했습니다. 이 기술은 개발 중 유전자 기능 연구를 위한 강력하고 안정적인 유전자 녹다운 방법론을 제공합니다.

인공 microRNA의 Tol2 Transposon-Mediated 형질전환 발현을 사용한 배아 병아리 망막의 기능 상실 접근법

학습하세요 마우스 망막 신경절 세포에서 유전자 발현을 조작하는 자궁내 및 생체외 전기천공 기술을. 이 방법은 시각 신경 발달과 축삭 경로 연구에 활용됩니다.

마우스 망막 신경절 세포의 유전자 발현에 대한 utero 및 전직 생체내의 Electroporation에

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