마우스 망막 신경절 세포의 유전자 발현에 대한 utero 및 전직 생체내의 Electroporation에

자궁 내 망막 전기천공법은 마취된 E 13.5에서 14.5 단계의 어미 쥐의 복부를 절개하여 배아열을 노출하는 것으로 시작합니다. 배아당 하나의 망막에 DNA를 주입하고 머리 부분에 전기천공을 실시하여 RGC 전구세포가 DNA를 흡수하도록 합니다. E 18.5 단계에서 배아를 관류하면 GFP 양성 반응을 보입니다.

X vivo 망막 전기천공법을 위해 망막과 시각 투사 경로를 분석합니다. E 13.5에서 14.5 단계의 배아 머리를 디시 안에 등쪽이 위로 향하도록 고정하고, 양측 망막의 말단 등쪽 영역에 DNA를 주입한 후 전기천공을 실시합니다. 전체 망막을 40시간 동안 배양한 다음, GFP 양성 망막 이식편을 분리하여 in vitro 배양 분석을 위해 플레이팅합니다.

안녕하세요, 저는 컬럼비아 대학교 병리학, 세포 생물학 및 신경과학과 Carol Mason 박사님 연구실의 Tim Petros입니다. 오늘은 자궁 내(in utero) 및 체외(ex vivo) 망막 전기천공법을 이용하여 배아 망막에 유전자를 도입하는 방법을 보여드리겠습니다. 저희 연구실에서는 유전자 발현 조절과 망막 신경절 세포의 조작이 특히 시신경교차 부위에서 그 투사 경로를 어떻게 변화시키는지 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다.

그럼 시작하겠습니다. 자궁 내 망막 전기천공법을 시도하기 전에는 적절한 준비가 필수적입니다. 마취 및 도구와 기구의 멸균 준비, 주입용 DNA 용액 및 수술 후 사용될 항생제-항진균제 용액 준비, 수술 부위 준비 및 적절한 용액의 가온에 관한 자세한 정보는 서면 프로토콜을 참조하시기 바랍니다.

미세 전극 추출기(micro electrode puller)를 사용하여 수술 전에 미세 팁 마이크로 피펫을 준비해야 합니다. 자궁 내 전기천공법을 위해 팁을 부러뜨려 각진 끝부분을 만듭니다. 먼저 E 13.5에서 E 14.5 단계의 어미 쥐 복강 내로 마취 혼합액 0.15 milliliters를 주입합니다. 마우스의 마취 여부를 확인하기까지 어미 쥐가 완전히 마취되는 데 3분에서 7분이 소요됩니다.

뒷발을 집어 동물이나 마취 상태에 빠지는 동안 반응이 없는지 확인합니다. DNA 용액의 작은 조각을 잘라 5 µL를 파라미터 위에 피펫으로 분주합니다. 금속 와이어 플런저를 90도 각도로 구부려 풀드 마이크로 피펫(pulled micro pipette)에 삽입한 후, 플런저를 사용하여 DNA 용액을 마이크로 피펫 안으로 흡입합니다.

이제 마우스 배아를 외과적으로 노출시킵니다. 적절한 기술에 대해서는 Wal Inus 등이 작성한 JoVE 프로토콜을 참조하십시오. 이제 전기천공법을 수행할 준비가 되었습니다.

첫 번째 단계는 망막의 방향을 적절하게 잡는 것입니다. 그런 다음 망막에 DNA를 주입하고 머리에 전기 천공술을 시행하겠습니다. 그럼 시작하겠습니다.

이제 첫 번째 단계로, 여기 보이는 것처럼 망막이 위를 향하도록 방향을 잡습니다. 그런 다음 마이크로 파이펫을 사용하여 양막을 뚫고 DNA를 망막에 직접 주입합니다. 자궁벽을 관통했다면 플런저를 눌러 DNA를 망막 내로 배출한 뒤, 다시 플런저를 당겨 뺍니다.

따라서 DNA를 주입하면 녹색 염료가 양수와 망막을 채우는 것을 확인할 수 있습니다. 이제 주입을 완료했으므로 전기천공법을 시행할 준비가 되었습니다. 전기천공을 위해 전기천공 패들을 배아 주변에 배치하는데, 이때 양극 패들을 전기천공을 시행할 망막에 인접하게 둡니다.

준비가 되면, 하강식 풋 페달을 밟아 배아에 전류를 전달합니다. 음극 전극 패들에 기포가 형성되는 것을 확인할 수 있으며, 이는 전기천공법이 성공적으로 수행되었음을 나타냅니다. 모든 주입된 배아에 대해 이 단계를 반복합니다.

이것이 바로 하나의 배아 망막에 DNA를 전기 천공법으로 주입하는 방법입니다. 이 절차를 원하는 만큼 많은 배아에 반복하여 수행할 수 있습니다. 다만, 전기 천공법을 시행하는 배아의 수가 많을수록 어미가 배아를 유산시킬 가능성이 커진다는 점에 유의하십시오.

배아의 전기 유도를 마친 후, 배아가 모두 들어가면 손가락을 사용하여 배아 사슬이 모체 내로 잘 들어가도록 마사지합니다. 복강 내에 항생제 및 항진균제 용액 약 2 mL를 붓습니다. 지혈鉗子(hemostat)와 핀셋을 사용하여 절개 부위의 전면부에 이중 매듭을 지어 복막을 봉합하기 시작하고, 절개 부위의 후면부까지 단순 연속 봉합법으로 계속 봉합합니다.

마지막 루프를 사용하여 봉합사를 묶고 남은 봉합사를 잘라냅니다. 마지막으로, 스테이플러를 사용하여 절개 부위를 폐쇄합니다. 이를 위해 둔단 포셉(blunt forceps)으로 절개 부위의 앞쪽 피부를 들어 올립니다.

피부를 복막과 주의 깊게 분리하십시오. 다음으로, 스테이플러의 치아 부분을 피부 주위에 배치하고 스테이플러를 눌러 절개 부위를 후단까지 계속 봉합하며, 보통 5~7개의 스테이플이 필요합니다. 스테이플링이 끝나면 알코올 솜으로 스테이플 주변의 상처 부위를 닦아내십시오.

모견을 가열 패드 위에서 회복시킨 후 새로운 케이지로 옮기십시오. 통증과 불편함을 최소화하기 위해, 모견이 움찔거리거나 몸을 뒤척이기 시작한 후 완전히 깨어날 때까지 보통 15~90분이 소요됩니다. 모견은 깨어난 직후와 이후 정해진 시간대에 buprenorphine을 투여받습니다.

불편함이 지속되어 탈수가 발생할 가능성이 있는 경우, 수술 후 약 2~4시간 뒤에 모체에 식염수 1 mL를 피하 주사합니다. 수술 후 24시간이 지나면 모체는 정상적인 행동을 회복하고 규칙적으로 물과 먹이를 섭취해야 합니다. 분석을 위해 E 18.5에 전기천공법이 적용된 망막을 채취합니다.

또는, 모체(dam)가 출산하도록 둔 후 생후 연령에 망막을 채취하여 추후 연령에서 분석할 수 있습니다. 동물을 마취한 후, 가위로 스테이플 아래의 피부와 복막을 절개하십시오. 복강과 자궁각을 노출시키기 위해, 전기천공된 배아를 제거하고 배아의 사지를 통해 해부 접시에 복측이 위로 오도록 고정한 뒤, 복부 피부와 복막을 절개하고 흉곽의 외측 부분을 절개하여 심장을 노출시키십시오.

다음으로, 관류 바늘로 좌심실을 뚫고 미세 가위로 우심방을 절개합니다. 이제 관류를 시작하여 PFA가 약 60에서 90초 동안 흐르도록 합니다. 제대로 수행되었다면 우심방으로 혈액이 배출되고 배아가 창백하게 변해야 합니다.

관류가 완료되면 배아의 머리를 절단하고, 15 mL 원뿔형 튜브에 담긴 4% PFA에 머리를 수집합니다. 전기천공을 실시한 모든 배아와 모든 어미 쥐에 대해 이 과정을 반복합니다. 모든 배아 수집이 끝나면 경추 탈골법을 통해 어미 쥐를 안락사시킵니다.

머리를 4% PFA에 담가 4°C에서 하룻밤 동안 보관한 후, PBS로 수일간 세척합니다. PBS 세척이 완료되면 GFP 발현 성공 여부를 확인하기 위해 망막을 검사할 준비가 된 것입니다. 먼저 해부 접시에 머리를 고정하되, 망막이 위를 향하게 하고 PBS에 잠기도록 합니다. 26.5 gauge 바늘을 사용하여 망막 주변의 피부를 제거하여 망막색소상피(RPE)가 드러나게 합니다.

렌즈와 망막색소상피(RPE) 접합부의 복측 망막을 천공합니다. 이어서, 마이크로 가위의 한쪽 끝을 이 구멍에 삽입하고 복측 망막에서 시신경 유두까지 수직 절개를 수행합니다. 이렇게 하면 망막을 적출할 때 방향을 잡을 수 있습니다.

한 쌍의 포셉으로 복측 절개 부위의 RPE를 잡고, 다른 포셉을 사용하여 RPE가 단단히 부착되어 있는 RPE-수정체 접합부를 중심으로 RPE를 망막에서 박리하여 분리합니다. RPE를 제거한 후, 포셉으로 수정체를 잡고 위쪽 및 바깥쪽으로 당겨 제거합니다.

렌즈를 제거하려면, 포셉을 망막 아래에 배치하여 조심스럽게 망막을 들어 올린 다음, 시신경 유두를 집어 망막을 분리합니다. 마지막으로 망막을 PBS가 채워진 웰로 옮깁니다. 이때 어느 망막이 어느 머리에서 유래했는지 반드시 기록하십시오. 반대편 망막과 전기천공법이 시행된 다른 모든 배아에 대해서도 이 단계를 반복합니다. 형광 해부 현미경을 사용하여 모든 망막에서 GFP 양성 반응을 스캔하며, 양성 반응이 나타나면 해당 배아의 전기천공법이 성공한 것으로 간주하고 이 망막과 해당 뇌를 추가 분석을 위해 처리할 수 있습니다.

ex vivo 망막 전기천공법 절차는 자궁 내 전기천공법과는 구별되는 몇 가지 추가적인 준비 단계가 필요합니다. 무혈청 배지의 준비 및 산소 공급, 배양 접시 및 경계 분석(border assays) 준비에 관한 자세한 정보는 서면 프로토콜을 참조하시기 바랍니다. 동물을 마취시킨 후, 이전에 시연한 대로 복강을 절개하고 전체 배아 체인을 제거하여 얼음 위에 놓인 D-M-E-M-F 12에 넣습니다.

그 후 경추 탈골법을 이용하여 어미 쥐를 안락사시킵니다. 가위로 자궁벽을 절개한 다음, 양막에서 배아를 꺼내 D-M-E-M-F 12에 수집하여 얼음 위에 보관합니다. 배아의 머리를 제거하고 DMEA 배지가 담긴 얼음 위에 보관하며, 몸통은 폐기합니다. 다음으로, 마우스 피펫이나 플런저 피펫을 사용하여 마이크로 피펫에 원하는 양의 DNA 용액을 채웁니다.

그 후 머리 하나를 PBS가 담긴 해부 접시로 옮기고 머리의 등쪽이 위로 오도록 핀으로 고정합니다. 주입 과정을 위해 해부 현미경으로 이동합니다.

이제 전기천공법을 시행할 준비가 되었습니다. 양쪽 망막의 주변 배측에 DNA를 주입한 후 머리 부분에 전기천공을 실시하겠습니다. 이제 시작하겠습니다.

첫 번째 단계는 망막 위쪽의 피부를 제거하는 것입니다. 이를 위해 핀셋을 사용하여 피부를 벗겨냅니다. 이제 양쪽 망막의 등쪽 부위를 확인할 수 있습니다.

다음으로 양측 망막의 망막 색소 상피(RPE) 층 바로 아래에 DNA를 주입하겠습니다. 이를 위해 전극을 거의 수평 방향으로 유지한 채, 망막의 가장 주변부 배측 지점에서 RPE를 관통합니다. 녹색 염료가 망막 공간을 채우고 PBS 용액으로 흘러나오는 것을 확인할 수 있어야 합니다.

이제 전기천공법(electroporation)을 진행할 차례입니다. 먼저 머리 고정 핀을 제거합니다. 이제 패들을 통해 전기천공을 실시하며, 양극(+) 패들이 머리의 복측(ventral side)에 위치하도록 합니다.

이제 머리를 패들 사이에 배치하며, 양극 패들을 복측 표면에 놓고 패들이 고정되도록 다음과 같이 압력을 가합니다. 이제 전기영동을 실시하겠습니다. 패들과 머리 윗부분에 기포가 형성되는 것을 확인하실 수 있습니다.

여기까지입니다. 이제 머리를 배지가 담긴 디쉬로 옮기겠습니다. 이것으로 ex vivo 망막 전기천공법 설명을 마칩니다.

원하는 배아 및 DNA 조건의 수만큼 이 절차를 반복하십시오. 이제 망막을 배양할 준비를 하겠습니다. 모든 전극 준비가 완료되면, 4-웰 디쉬에 산소화된 SFM 용액 약 1.5 milliliters를 넣고 얼음 위에 보관하십시오.

주입할 서로 다른 DNA 용액마다 하나의 웰을 준비합니다. 다음으로, 전기천공법이 수행된 시료 하나를 옮깁니다. 망막의 한쪽 면이 위를 향하게 하여, 복측 망막 또는 표적 영역의 반대편이 위로 오도록 D-M-E-M-F 12가 담긴 해부 접시에 놓습니다.

미세 핀셋을 사용하여 RPE에 구멍을 집어 찢습니다. 이 구멍을 시작점으로 하여 망막 주변의 RPE를 벗겨냅니다. 이때 안구를 절단하거나 손상시키지 마십시오. 손상이 발생하면 배양 과정 중 망막이 스스로 붕괴될 수 있습니다.

RPE를 제거한 후, 핀셋으로 망막 기저부의 시신경을 집어 망막을 밀어내어 분리하며, 수정체는 그대로 둡니다. 분리한 망막을 4웰 디쉬에 담긴 산소 공급 SFM으로 옮깁니다. 머리를 반대 방향으로 돌려 반대쪽 눈에서도 망막 제거 과정을 반복합니다.

전기천공이 수행된 모든 머리에 대해 이 단계를 완료하고, 산소가 공급된 SFM 내에서 망막을 37°C로 40~48시간 동안 배양합니다. 전체 망막 배양이 끝나면, 산소가 공급된 SFM이 담긴 웰에서 망막을 꺼내 D-M-E-M-F 12가 담긴 페트리 접시 뚜껑으로 옮깁니다. 형광 해부 현미경을 사용하여 망막 하나를 선택하고, 망막에서 GFP 양성 발현 부위를 시각화합니다.

다음으로, 마이크로 메스와 핀셋을 사용하여 GFP 양성이 아닌 망막 부위를 절제하여 제거하고, GFP 양성인 망막 조각만 남깁니다. 절제 과정 전반에 걸쳐 형광광과 일반광을 지속적으로 전환하며 관찰하는 것이 도움이 됩니다. GFP 양성 망막을 정확하게 선택하기 위해, GFP 양성 망막 조각을 G-M-E-M-F 12가 들어 있는 웰로 옮깁니다.

한 Well의 모든 망막에 대해 이 단계를 반복하십시오. 각 DNA 조건마다 새로운 페트리 접시와 D-M-E-M-F 12 배지를 사용하여 GFP 양성 망막 조각을 플레이팅을 위한 더 작은 망막 절편으로 분리합니다. 해부 현미경과 마이크로 스칼펠을 사용하여 큰 GFP 양성 망막 조각을 작은 절편으로 자릅니다. 절편의 길이는 약 200에서 300 micrometers, 너비 또한 약 200에서 300 micrometers가 되어야 합니다.

하나의 GFP 양성 망막 조각에서는 약 4개에서 10개의 GFP 양성 망막 외편(explan)이 생성되어야 합니다. 모든 외편을 D-M-E-M-F 12가 들어 있는 웰에 수집하십시오. 수확한 모든 GFP 양성 망막 부위에 대해 이 단계를 반복하십시오. 모든 GFP 양성 망막 외편을 준비한 후, 라미네이트 코팅된 배양 접시에 0.4% 메틸셀룰로스가 첨가된 차가운 SFM 250 µL를 넣으십시오.

다음으로, GFP 양성 조직편 4~8개를 배양 접시로 옮기고 핀셋을 사용하여 X 조직편을 다각형 모양으로 조심스럽게 배치하되, x 조직편이 접시의 중심과 가장자리 중간 지점에 위치하도록 합니다. X 조직편의 어느 면이 RGC 층인지 확인합니다. 이는 RPE 결정을 통해 확인할 수 있는데, RPE 결정이 때때로 외망막층에 붙어 있어 반대쪽 면이 RGC 층임을 나타낼 수 있기 때문입니다.

RGC 측면에도 보통 세포 파편이 일부 존재하며, 이는 RGC 층이 아래로 향하게 하여 적절히 절편을 배치하는 데 도움이 될 수 있습니다. 핀셋을 사용하여 절편의 중심부를 단단히 눌러 배양 접시 바닥의 유리 커버 슬립에 부착되도록 합니다. 모든 X개의 절편을 배양 접시에 도말한 후, 37 °C 배양기로 옮깁니다.

망막 X 이식편은 24시간 후 풍부한 축삭 성장을 보이며, 다양한 인비트로(in vitro) 분석에 사용될 수 있으며, 이후 4% PFA로 30분 동안 고정합니다. 그다음 경계 분석(border assay)을 위해 면역 염색을 수행합니다. 4G FP 양성 이식편을 경계 분석용으로 준비된 디쉬로 옮깁니다.

X 조직편을 관심 기질의 형광 경계와 근접하도록 직선으로 배열합니다. 형광 해부 현미경 하에서 핀셋을 사용하여 조직편이 형광 경계로부터 약 50 to 150 micrometers 거리에 위치하도록 플레이팅합니다. 두 가지 형광 채널을 교대로 전환하며 녹색 조직편과 적색 경계를 시각화합니다.

다음으로 디쉬를 37°C에서 24시간 동안 배양하여 RGC 축삭이 경계 기질에 도달할 수 있도록 충분한 시간을 줍니다. 이후 X explan을 4% PFA에서 30분 동안 고정하고 면역 염색을 수행합니다. 이는 자궁 내 망막 전기천공술 이후의 과정입니다.

망막의 GFP 양성 망막 신경절 세포(RGC)를 시각화하기 위해 망막 홀 마운트를 준비하고 반쯤 온전한 상태로 유지할 수 있습니다. 시각 시스템은 시신경, 시신경 교차 및 시각로 전체에 걸쳐 GFP 양성 축삭을 시각화하도록 준비할 수 있습니다. 또는, 망막과 RGC 경로를 가로지르는 전두부 동결 절편을 제작하여 망막 내의 GFP 양성 RGC 세포체와 시신경 교차 및 시각로 내의 축삭을 시각화하고 분석할 수 있습니다.

모든 망막 축삭은 뉴로필라멘트(neurofilament) 염색을 통해 시각화됩니다. 또한, P4에서 P10 사이의 새끼 쥐를 채집하여 외측슬상핵(lateral geniculate nucleus, LGN) 내 RGC 축삭 타겟팅을 연구하기 위해 자궁 내 전기천공법(in utero electroporation)을 사용할 수 있습니다. P8 단계에서, ex vivo 전기천공 및 망막 이식물 배양 후 전체 RGC 투사 경로를 표지하기 위해 동측 망막에는 CTB LOR 5 94(적색 채널)를, 대측 망막에는 CT bor 6 47(청색 채널)을 주입하면 LGN에서 GFP 양성 축삭을 확인할 수 있습니다.

RGC 축삭의 일부는 RGFP 양성으로, 각각 상단과 하단 이미지에서 볼 수 있듯이 저배율과 고배율 모두에서 명확하게 시각화될 수 있습니다. GFP 양성 축삭의 반응은 여기에 파란색으로 표시된 다양한 기질의 경계면에 XS를 도말하여 분석할 수 있습니다. 지금까지 자궁 내 및 ex vivo 망막 전기천공법을 이용하여 배아 거울 망막에 유전자를 도입하는 방법을 살펴보았습니다.

본 분석에서는 시신경교차의 축삭 유도에 집중하였으나, 이 기술은 망막 신경절 세포(RGC)의 분화, 수지상 돌기 형태 및 전기생리학적 특성을 연구하는 연구자들에게도 유용할 수 있습니다. 이 실험 절차를 수행할 때는 DNA 주입 시 망막 손상을 최소화하고, 실험 전 과정 동안 PBS를 사용하여 배아의 수분을 항상 유지하는 것이 중요합니다. 이상으로 설명을 마칩니다.

시청해 주셔서 감사합니다. 귀하의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.