Name: 에 Electrophysiological 녹음 Drosophila 엠브료 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-21T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: 학습하세요 Drosophila 배아의 근육과 운동신경원에서 전기생리학적 기록 방법을. 전체세포 패치클램프 기법을 활용하여 신경근육 접합부와 중추 시냅스의 기능적 특성을 분석하고 발달 과정을 연구할 수 있습니다.

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Drosophila의 배아에서 Electrophysiological 녹음 수동 조작과 절개를 필요로합니다. 준비의 건강과 레코딩의 결과의 품질, 신속하고 깔끔하게 레코딩을위한 연약한 배아 조직을 준비하는 수있는 하나 따라 다음 실험을 실행합니다. 경험은 한번에 모두를 해결하기 위해 시도하기 전에 배아 해부 및 패치 클램프 전기 생리학 모두 실력해야합니다. 녹음은 &quot;수정된 표준&quot;또는 &quot;haemolymph처럼&quot;(HL) 살린스 여러 변종 중 하나에 수행할 수 있습니다. 이 두 호수 클래스 사이의 주요 차이점 1 있음) 나 + 농도 (70 MM HL 대 120-135 MM 표준) 및 2) MG 2 + 농도 (4 MM 표준 대 20 MM HL). 표준 솔루션에 높은 나 + 농도의 주요한 이점은 액션 잠재적인 전파하고, 따라서 정상적인, 꽃무늬 시냅스 전달의 유지 보수를 용이하...

에 electrophysiological 녹음 drosophila 엠브료

Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo

Drosophila는 배아 발달과 기능 모두의 신경 과학 연구를위한 최고의 유전자 모델입니다. 전통적으로,이 필드는 주로 독립적인 역사 및 과학 사회와 서로 꽤을 분리하고 있습니다. 그러나 이러한 일반적으로 서로 다른 분야 사이의 인터페이스는 기능 전기적 신호 특성과 신경 회로 형성의 마지막 단계에서 기능성 화학 시냅스의 분화 취득을 기본 발달 프로그램입니다. 이 인터페이스는 조사를위한 중요한 지역입니다. Drosophila에서 기능의 개발이 단계는 embryogenesis의 마지막 세번째 동안 &lt;8시간 기간 (25 ° C에서)하는 동안 발생합니다. 이렇게 늦게 발달 기간 동안 힘든, 스며들지 표피 표피의 증착에 수사 때문에하는 어려운 여겨졌다. 획기적인 사전은 로컬 말기 태아의 제어 절개를 사용하는 표피에 적용할 수있는 물 polymerizing 수술 접착제의 적용되었다. 지느러미 세로 절개로 배아가 실험 조사하기 위해 복부 신경 코드 및 신체 벽면 근육을 노출, 평면 마련하실 수 있습니다. 전체 세포 패치 - 클램프 기법은 다음 개별적으로 - 식별 뉴런과 체세포 근육에서 기록을 채용하실 수 있습니다. 이러한 녹음 구성 이온 전류와 뉴런과 근육 모두에서 행동 가능성이 전파의 모양과 성숙을 추적하는 데 사용되었습니다. 이러한 전기적 특성에 영향을 미치는 유전자 돌연변이 이온 채널과 관련된 신호 단지의 분자 조성을 공개하고, 기능 분화의 분자 메커니즘의 탐사를 시작 특징되었습니다. 특히 초점은 중추 신경계와 주변 모두에 시냅스 연결의 조립을했습니다. glutamatergic 신경근육학 교차점 (NMJ)는 광학 이미징 및 electrophysiological 녹음의 조합에 가장 액세스할 수 있습니다. 유리 흡입 전극은 전압 - 고정되어 근육에서 만들어진 흥분성의 접합 전류 (EJC) 기록과, 말초 신경을 자극하는 데 사용됩니다. 이 녹음 구성 버렸네의 기능 분화를 차트와 presynaptic 글루 탐 산염 방출 특성의 모양과 성숙을 추적하는 데 사용되었습니다. 또한, postsynaptic 속성은 글루 탐 산염 수용체 필드의 모양과 성숙을 측정하기 위해 근육의 표면에 직접 글루 탐 산염의 iontophoretic 또는 압력 응용 프로그램을 통해 독립적으로 assayed 수 있습니다. 따라서, 모두 사전과 postsynaptic 요소는 배아 synaptogenesis 동안 별도로 또는 함께 모니터링할 수 있습니다. 이 제도는 크게 배아 버렸네 형성에 악영향을하고, 따라서 버렸네 연결과 기능 시냅스 신호 속성의 사양과 차별을 규제하는 분자 메커니즘을 밝혀 유전자 돌연변이를 분리하고 특성화하는 데 사용되었습니다.

Electrophysiological 녹음에서<em&gt; Drosophila</em&gt; 배아 개발 근육과 신경 세포 전기적 특성뿐만 아니라 glutamatergic 신경근육학 접합 및 중앙 cholinergic 및 GABAergic 시냅스의 기능 synaptogenesis의 특성의 분석을 수 있습니다.

에 Electrophysiological 녹음 Drosophila 엠브료

초파리(Drosophila)는 배아 발달과 기능적 신경과학 연구 모두에서 최고의 유전학적 모델입니다. 전통적으로 이 두 분야는 상당히...

적절하게 준비된 oph 배아 체벽에서 근육 및 운동 뉴런의 전기생리학적 기록을 얻을 수 있습니다. 근육 6, 7, 12 또는 13은 전체 세포 기록(whole cell recording) 구성으로 쉽게 기록할 수 있으며, 신경근 접합부로부터 기록하기 위해 기가옴 씰(giga ohm seal)을 형성한 후 강력한 미세 진폭 전류를 측정할 수 있습니다. 흡입 전극을 사용하여 CNS 출구 지점 근처의 운동 신경을 끌어올려 시냅스 전 자극을 전달하는 동시에 시냅스 후 근육에서 전체 세포 전류를 측정할 수 있습니다.또는, 이온 도입법(iontophoresis)이나 압력 분사법을 통해 피펫을 사용하여 기록 전극 근처에 흥분성 신경전달물질을 전달할 수 있습니다. 안녕하세요, 저는 시카고 일리노이 대학교 생물과학과의 Dave 교수님 연구실에 있는 Ton입니다. 오늘은 살라테 단계(salate stage) 배아의 신경근 접합부와 중추 뉴런을 전기생리학적으로 기록하는 방법을 보여드리겠습니다.이 절차들은 조프(joof) 신경근계의 기능과 발달을 연구하는 데 사용됩니다. 이 기술들은 원래 Kendall Brody에 의해 개발되었으며, David Fit Stone을 거쳐 현재 저에게 전달되었고, 오늘 제가 여러분께 전달해 드리고자 합니다.이 절차를 수행하려면 배아를 사전에 적절히 채취하고 해부해야 합니다. 이 과정이 어떻게 이루어지는지 확인하려면 Brody, Featherstone 및 Chen의 동반 출판물인 Electrophysiological을 참조하십시오. Jossa 배아 근육 및 뉴런에서의 전기생리학적 기록에는 표준 전체 세포 패치 클램핑 기술이 사용됩니다. 먼저, 해부된 배아를 작은 플렉시글라스 기록 챔버에 넣습니다.생리학 기록 구역은 Faraday 케이지로 전기적으로 차폐되어 있으며, 진동 감쇄 테이블 위에 설치되어 있습니다. 챔버는 KY 광학계와 40 x 장작업거리 수침 렌즈가 장착된 정립 복합 현미경을 사용하여 투과광 하에서 관찰합니다. 온도가 상승함에 따라 oph 근육의 패치 클램프 수행이 점점 더 어려워지므로, 일반적으로 상온 이하에서 기록을 진행합니다.기록 전극의 최종 저항은 5~10 MΩ이어야 하며, 내경이 약 1 µm가 되도록 열 연마(heat polish)해야 합니다. 기록 전극의 팁은 염화칼륨과 수크로스가 포함된 생리 식염수로 채웁니다. 표준 식염수가 담긴 배스(bath)에는 염화은 접지선을 배치하며, 이 식염수는 배아 해부 시에도 사용됩니다.신호는 패치 클램프 증폭기를 사용하여 증폭되며, 필터링을 거친 후 추후 분석을 위해 디지털 방식으로 저장됩니다. Axon사의 장비 및 소프트웨어와 같이 패치 클램프 실험에 적합한 모든 시스템을 사용할 수 있습니다. 이제 배아 신경계의 세 가지 서로 다른 조직에서 유래한 세포를 사용하여 근육, 신경근 접합부(NMJ)의 뉴런 및 중앙 운동 뉴런으로부터 자극을 주고 기록할 수 있습니다.이 배아 준비 과정을 통해, 대부분의 실험에서 모든 배아 근육을 기록할 수 있습니다. 4개의 종적 복측 근육 6, 7, 12, 13번 그룹, 특히 전복부의 6번 근육에 집중하십시오. 등쪽 근육을 기록하려면 A 2에서 3 단계로 진행합니다. 어린 배아의 경우, 배아의 등쪽이 아래로 향하게 고정한 뒤 복측 정중선을 따라 해부해야 합니다.근육 기록 전에는 효소 처리 과정이 필요하지 않습니다. 하지만 큐티클이 발달한 후기 배아의 경우, 패치 기록 전에 근육초 또한 발달합니다. 이 근육초는 콜라게나제(collagenase)에 짧게 담가 제거해야 합니다.대부분의 기록은 세포 부착(cell attached) 상태에서 가벼운 흡입이나 전기적 자극을 통해 쉽게 구현할 수 있는 전체 세포 기록(whole cell recording) 구성으로 수행됩니다. 이것이 바로 잽(zap)입니다. 이는 세포막을 파열시키기 위해 가하는 전기 자극입니다.전세포(whole cell) 설정 시 씰 저항(Seal resistance)은 보통 1GΩ보다 큽니다. 전세포 전류는 일반적으로 씰 형성 후 3분 이내에 얻어집니다. 대부분의 경우 직렬 저항(series resistance)이 현저히 증가하며, 세포에서 누설 전류가 증가할 수 있습니다. 패치 클램핑을 위해 배아는 최소 14시간 이상 되어야 하며, 그 이전의 발달 단계에서는 수행할 수 없습니다.근관(myotube) 간의 광범위한 전기적 결합으로 인해 근섬유의 패치 클램프 기록 시 전압 클램핑의 정확도가 떨어질 수 있습니다. 일반적인 유지 전위는 -60에서 -80 mV이며, 전압 클램프 및 전류 클램프 방법을 사용할 수 있습니다. -60 mV에서 성공적인 전세포 기록 시, 여기에 표시된 것과 같이 수 pA에서 수백 pA 범위의 강력한 자발적 시냅스 전류가 동반됩니다.흡입 전극으로 운동 신경을 자극하여 큰 NMJ 전류를 유도할 수 있습니다. 이러한 전극은 다양한 섬유 충전 유리 전극으로부터 제작할 수 있으며, 파이펫의 부드러운 흡입력을 이용해 원하는 형상을 갖추도록 화염 연마(fire polish)해야 합니다. CNS 출구 지점 근처에서 적절한 분절 운동 신경의 작은 부분을 흡입하십시오. 기밀한 밀봉을 형성하기 위해서는 실험적으로 결정된 강도(보통 1~5 V 사이)로 짧게 자극하는 것이 가장 효과적입니다. 실험적으로 결정된 임계값보다 1~2 V 높게 자극 강도를 설정하면 안정적인 자극이 가능합니다.시냅스 후 NMJ 글루탐산 수용체는 신경전달물질인 글루탐산의 적용을 통해 활성화될 수 있으며, 글루탐산과 같이 전하를 띤 분자는 이온 도입법을 통해 NMJ로 전달될 수 있습니다. 수용체의 분포를 파악하기 위해 고저항 피펫을 사용하며, 전체 글루탐산 수용체 반응을 추정하기 위해 저저항 피펫을 사용합니다. 이온 도입 피펫에는 100 millimolar L 글루탐산 용액을 충전합니다.L-glutamate를 방출하려면, 누출을 방지하기 위해 작은 양의 양전하 백킹 전류(backing current)를 동반한 짧은 음전하 전류 펄스를 사용하십시오. glutamate 또는 전하를 띠지 않는 분자는 압력 분사법을 사용하여 NMJ로 전달할 수도 있습니다. 압력 분사를 위해서는 1~2 mM의 glutamate를 사용하고, pico spritzer를 사용하여 피펫에 5~10 PSI의 외력을 가하십시오.-60 mV에서 신경 자극 또는 글루타메이트 처리로 유도된 NMJ 전류는 일반적으로 1500에서 2000 pA입니다. 많은 배아 뉴런은 세포체 위치와 돌출부 형태를 기반으로 개별적으로 식별할 수 있습니다. 대부분의 실험적 기록은 배아 복측 신경삭 내의 5개 표층 배측 뉴런 그룹에 집중되었습니다.이러한 뉴런으로부터 기록을 수행하려면, 프로테아제(protease)를 이용한 짧은 국소 처리를 통해 복측 신경삭(ventral nerve cord)의 신경종 초(neuroma sheath)를 제거해야 합니다. 기록 시 대구경 패치 피펫(patch pipette)을 사용하여 0.5~1% 프로테아제를 투여함으로써 세포체에서 초를 제거하며, 이때 초 물질을 프로테아제가 포함된 피펫 안으로 빨아들입니다. 입을 이용한 가벼운 흡입 동작을 통해 초를 피펫 안팎으로 반복해서 넣었다 뺄 수 있습니다. 1~2분 후면 초가 파열됩니다.이제 세포를 whole cell patch clamping을 위해 노출시킵니다. 이 기록 방식은 식염수를 순환시키거나 가온할 필요가 없습니다. 본 실험 준비물에서 사용하는 외부 기록 식염수는 근육 기록 시 사용하는 것과 다릅니다.패치 피펫에 Lucifer yellow를 충전하여 나중에 패치 세포의 위치와 형태를 시각화할 수 있습니다. 여기는 Lucifer yellow를 흡수하여 형광 현미경으로 시각화한 중심 운동 뉴런입니다. 전체 세포 전압 고정 기록은 18 °C에서 -60 mV의 유지 전위로 수행됩니다.전류 클램프 기록 또한 가능합니다. 뉴런은 신경전달물질인 아세틸콜린 또는 GABA로 자극될 수 있습니다. 이러한 물질들은 신경접합부(nj)에서 기록할 때와 마찬가지로 이온영동법 또는 압력 분출법을 사용하여 세포체에 처리합니다.전세포 연결이 확립되면, 먼저 자발적 전류가 관찰됩니다. 이것은 자극이 없는 상태에서 -60 mV로 전압 고정된 배아 복측 종단근 6번의 1분간 가공되지 않은 데이터입니다. 건강한 표본은 일반적으로 여기서 많은 하향 전류 굴곡으로 나타나는 강력한 자발적 시냅스 활동을 보여줍니다.해당 근육으로 이어지는 운동 신경에 흡입 피펫을 이용해 자극을 가했을 때 얻은 데이터입니다. 그 결과, 유발 접합 전류(evoked junctional currents, e jcs)를 나타내는 전류의 하향 편향이 여러 번 발생했습니다. 이것은 압력 분사를 통해 1 mM glutamate를 처리하여 동일한 근육을 자극했을 때 얻은 데이터입니다.글루타메이트는 수용체를 개방하여 큰 하향 편향을 유도합니다. 전류 기록에서 글루타메이트를 두 번 연속으로 처리한 두 개의 트레이스가 나타나 있습니다. 지금까지 후기 단계의 Xenopus 배아에서 전기생리학적 기록을 수행하는 방법을 보여드렸습니다. 전기생리학적 기록에는 일반적으로 표준 패치 클램프 기술이 사용되며, 본 영상에서는 이를 상세히 설명하지는 않았습니다.이상적으로, 귀하의 연화된 배아에서 기록하고자 하는 모든 연구자는 이미 더 쉬운 표본을 사용하여 패치 클램프 기술을 익혔어야 합니다. 이것으로 모든 설명을 마치겠습니다. 시청해 주셔서 감사하며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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생물학

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