Name: 유기 용매 및 초산없이 쿠매시 G - 250로 젤의 단백질 염색법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-14T00:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: 배우세요 유기 용매와 초산 없이 쿠마시 브릴리언트 블루 G-250을 사용한 폴리아크릴아미드 겔 단백질 염색법을. 이 간단한 프로토콜은 전기영동 후 단백질 밴드를 1분 만에 선명하게 시각화하여 생화학 연구자들에게 안전하고 효율적인 분석 방법을 제공합니다.

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우리는 이네스 Racké의 기술 지원을 인정하고 싶습니다.

1 부 : CBB의 얼룩 솔루션의 준비 <ol><li> CBB의 60-80 MG는 G - 250은 2-4시간에 대한 감동으로 bidistilled 물 1리터에 녹아 있습니다. 마지막으로, 집중 HCL 3 ML은 다른 분간 교반과 함께 진한 파란색 솔루션에 추가하고 나중에 사용하기 위해 어둠에 저장됩니다. 이 솔루션은 그 얼룩의 효율성을 잃지 않고 몇 개월까지 주 동안 최대 저장할 수 있습니다. </li><li> 집중 HCL은 퓸 후드에서 사용하는 일반적인 치료 깨물어으로 취급해야합니다. 최종 솔루션은 산도 약 2 있으므로 장갑을 사용해야하고 피부와의 접촉을 피해야한다에있을 것입니다. </li></ol> 2 부 : SDS - PAGE <ol><li> 단백질 시료의 적절한 aliquots는 1X 로딩 버퍼의 최종 농도 버퍼를 읽어와 혼합됩니다. 우리는 125mM Tris/H3PO4 (25 ° C에서 산도 7.5), 2mM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 4% SDS, 200mM DTT, 0.02 % bromophenol 파란색과 50 %의 글리세롤과 2X 로딩 버퍼를 사용합니다. SDS - PAGE 다른 로딩 버퍼 잘으로 사용할 수 있습니다. </li><li> 단백질 샘플이 로딩되기 전에 약 5 분 가열합니다. 한편, 겔 전기 영동 챔버는 실행을위한 준비가되어 있습니다. 우리는 XCell SureLock에 © 비스 - 트리스 젤 (Invitrogen) ® MES - 버퍼와 미니 셀 (Invitrogen)가 실행 버퍼지만 다른 겔 및 전기 시스템뿐만 아니라 사용할 수있는 프리 캐스트 4-12%의 NuPAGE를 사용합니다. </li><li> 단백질 샘플은 220V 50 분 실행 젤과 전기 영동에로드됩니다. </li></ol> 파트 3 : 젤의 스테 이닝 <ol><li> 겔 카세트가 해체되고 젤은 이후 세정 단계를 상자에 배치됩니다. </li><li> bidistilled 물을 약 100 ML은 겔에 추가하고 30 초 동안 전자 레인지에 가열합니다. 비등가 발생하기 전에 난방을 중단해야합니다. 젤있는 상자는 다음 3-5 분 쉐이크에 위치합니다. 이 세척 단계는 신선한 물로 두 번 반복됩니다. </li><li> 충분 CBB의 얼룩 솔루션은 상자에 겔 10 초위한 전자 레인지에 가열 상자를 커버에 추가됩니다. 끓는없이. 젤있는 상자 후 얼룩을 마무리를위한 쉐이크에 위치합니다. 이미 일분 후, 단백질 밴드는 15-30 분 후 볼 수 있습니다. 얼룩은 대부분의 경우 충분히 강하. </li><li> 얼룩 솔루션은 해제 붓고되고 50-100 ML bidistilled 물을 더 쉐이크에서 젤의 하늘색 배경을 destain하기 위해 추가됩니다. 물이 필요한 경우 추가 destaining 신선한 물로 교체하실 수 있습니다. </li><li> 젤은 스캔한 사진이나 장기 보관을위한 건조 수 있습니다 </li></ol> 4 부 : 대표 결과 : 그림을 참조하십시오. 설명 절차에 따라 제대로 스테인드 젤 1. 그림을 참조하십시오. 얼룩 및 잔류 SDS하기 전에 충분히 세탁되지 않은 젤에 대한 2 효율적으로 얼룩을 억제. 마커 차선은 (*) 마커 단백질 같은 금액을 포함합니다. <img src="/files/ftp_upload/1350/Fig1.png" alt="" /> 그림. 1 : 단백질 정제의 샘플 (분자량 마커 *)를 로딩 후 대표 겔 얼룩. <img src="/files/ftp_upload/1350/Fig2.png" alt="" /> 그림. 2 : CBB의 얼룩하기 전에 충분히 세탁되지 않은 CBB 스테인드 젤. 단백질 밴드가 (마커 레인 *이 그림에서와 같이 단백질의 같은 양의 1. 포함되어 있습니다) 약한 나타납니다.

<ol><li>Process for fast visualization of protein. US patent. , 6319720 (B1) (2001).</li>
<li>Solution for fast visualization of protein. US patent. , 2001046709 (A1) (2001).</li>
</ol>

아무 충돌 관심 없습니다. 절차 (참조을 참조하십시오.) 원래 EM Wondrak하여 특허 출원에 출판 되었음 : 위에서 설명한.

<ul><li> 세척 단계는 단백질의 효율적인 얼룩을 위해 중요하다. 2 분 또는 물 (&lt;50ml)의 감소 볼륨 아래의 감소 세척 시간은 겔에 잔류 SDS 높은 금액으로 인한 가능성이 가장 높은 하늘색 단백질 밴드에 발생할 수 있습니다. </li><li> 단백질은 질량 분광법으로 분석 될 경우, 전자 레인지에서 가열 단계는 생략한다, 10의 각 단계에서 분 및 밴드 강도까지 연장 얼룩 시간까지 확장 젤의 세탁 시간은 충분히 강하 . 질량 분석법에 의한 겔 매트릭스하기 때문에 단백질의 검출에 단백질의 crosslinking에서 젤 결과를 가열하는 것은 방해 수 있습니다. </li><li> 대신 CBB G - 250, 한 Wondrak에서 원래 프로토콜에 따라 CBB R - 250을 사용할 수 있습니다. 우리 연구실에 CBB G - 250의 재고를했고이 염료와 함께 좋은 결과를 것처럼 우리는 옆에 두 염료 측면을 비교하지 않았습니다. </li><li> 프로 시저의 속도와 세정 얼룩 단계에서 독성 또는 유해 용제의 누락이 프로토콜을 사용하기위한 가장 중요하고 설득력 요소...

<table><tbody><tr><td>Coomassie Brilliant Blue G-250</td><td>AppliChem</td><td>A3480</td><td>다른 CBB G-250 제품을 사용해도 무방함</td></tr><tr><td>농축 HCl</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

유기 용매 및 초산없이 쿠매시 g - 250로 젤의 단백질 염색법

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

쿠매시 블리언트 블루 (CBB), 독성 및 인화성 유기 용제 (메탄올, 에탄올 또는 2 - 프로파놀)과 초산 높은 내용으로 솔루션을 사용하는 고전적인 단백질 얼룩 프로토콜에 얼룩 및 SDS 후 젤의 단백질 destaining, 고정에 사용됩니다 페이지. 짧은 시간 동안 전자렌지에 얼룩 솔루션을 가열, 절차를 속도를하는 것은 자주 사용됩니다. 독성 또는 유해 메탄올, 에탄올 또는 2 - 프로파놀 안전 고려 사항으로 인해 피해야한다 실험실에서 초산의 강한 냄새의 증발이 일반적으로 발생합니다. 원래 EM Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1))하여 두 특허 출원에 발표된 프로토콜에서 얼룩 솔루션의 대체 성분이 더 용매 유기 또는 산성이 사용되지하는에 설명되어 있습니다. CBB는 bidistilled 물속에 녹아있는 것입니다 (CBB G - 250 당 리터의 60 80mg) 35 MM HCL은 얼룩 솔루션에서 유일하게 다른 화합물로 추가됩니다. 젤의 CBB의 staning는 bidistilled 물에 젤의 SDS - PAGE와 철저한 세척 후에 이루어집니다. 세탁 중에 젤 가열 및 단계를 얼룩으로, 프로세스는 빨리 완료 될 수 있으며, 아무런 독성 또는 유해 compunds이 증발되지 않습니다. 단백질 얼룩이 솔루션을 얼룩에 젤 가열 후 일분 이내에 이미 발생하고 완전히 스테인드 단백질에 영향을주지 않고, bidistilled 물속에 스테인드 젤의 장기간 세척하여 완전히 destained하는 약간 파란색 배경과 15-30 분 후에 개발 밴드.

쿠매시 블리언트 블루 (CBB)의 polyacrylamide 젤의 G - 250로 단백질 얼룩에 대한 짧은 프로토콜은 CBB와 고전적인 얼룩 절차에서와 같이 유기 용제 또는 초산을 사용하지 않고도 설명되어 있습니다.

유기 용매 및 초산없이 쿠매시 G - 250로 젤의 단백질 염색법

Coomassie Brilliant Blue (CBB)를 사용하는 전통적인 단백질 염색 프로토콜에서는 독성과 가연성이 높은 유기 용매가 다량 함유된 용액을 ...

이 절차를 시작하기 위해, Kumasi Brilliant Blue 또는 CBG two 50을 1L의 2차 증류수에 녹여 2~4시간 동안 교반합니다. 이후 암청색 용액에 염산을 첨가하고 1분 동안 더 교반한 후, 이 용액을 암소에 보관하여 추후 사용합니다. 단백질 시료 준비와 STS page를 마친 후, 겔 카세트를 분해하고 겔을 상자에 넣어 2차 증류수로 세 번 세척합니다.세 번째 세척 단계 후에, 박스 내의 젤이 충분히 잠길 정도로 CBB 염색액으로 교체합니다. 전자레인지에서 10초 동안 가열한 후, 젤이 들어 있는 박스를 셰이커 위에 올립니다. 염색이 완료되면 1분 후에 단백질 밴드를 관찰할 수 있습니다.안녕하세요, 엠버린 하이델베르크(Emberin Heidelberg)의 단백질 발현 및 정제 시설에서 근무하는 Amri Lawrence입니다. 오늘은 클로라이드 겔(chloride gels) 내의 단백질을 Coomassie Brilliant Blue G-250으로 염색하는 프로토콜을 소개해 드리겠습니다. 기존의 염색 방법과 달리, 본 프로토콜은 유기 용매나 아세트산을 전혀 사용하지 않습니다.본 프로토콜을 사용하여 매 정제 단계 후 단백질을 분석합니다. 이제 시작해 보겠습니다. CBB 염색 용액을 준비하려면, 60~80 mg의 CBB를 1 L의 2차 증류수에 넣고 2~4시간 동안 교반하여 용해시킵니다.CBV를 용해한 후, 용액을 흄 후드로 옮깁니다. 흄 후드 내에서 진한 염산 3 mL를 진한 청색 용액에 조심스럽게 첨가합니다. 최종 용액의 pH가 2가 되므로, 1분 동안 교반하는 동안 장갑을 착용해야 합니다.용액을 제조한 후, 나중에 사용하기 위해 암소에 보관합니다. 이 용액은 염색 효율 저하 없이 수주에서 최대 수개월 동안 보관할 수 있습니다. SDS page용 단백질 샘플을 준비하려면, 적절한 양의 단백질 샘플을 로딩 버퍼와 혼합하여 최종 농도가 1x loading buffer가 되도록 합니다. 로딩 전 단백질 샘플을 약 5분 동안 가열합니다.시료가 가열되는 동안, 젤 전기영동 챔버를 실행 준비합니다. 본 실험에서는 MES 버퍼를 전기영동 버퍼로 사용하는 미니 셀의 프리캐스트 젤을 사용하였으나, 다른 젤 및 전기영동 시스템도 사용 가능합니다.가열된 단백질 시료를 젤에 로딩하고 220V에서 50분 동안 전기영동합니다. SDS-PAGE가 완료되면 젤 카세트를 분해하고 젤을 100mL의 2차 증류수가 담긴 상자에

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

전기 방법으로 분리에 따라, 젤의 단백질은 몇 얼룩 방법에 의해 감지하실 수 있습니다. 쿠매시 블루, 실버 스테 이닝, SYPRO 오렌지, SYPRO 루비와 단백질 얼룩이 비디오 시연하고 있습니다.

젤의 단백질 염색법

이 동영상은 강호에 따라 콜로이드 쿠매시 G - 250 얼룩 프로토콜을...

Polyacrylamide의 젤의 단백질에 대한 신속하고 민감한 콜로이드 쿠매시 G - 250 스테 이닝

SDS - PAGE에 의해 다음 glycoproteins에서 설탕을 제거하는 구체적인 glycosidases를 사용하면 단백질 시료에 glycan 변경을 탐지하는 유용한 방법이며 초기 glycobiology 연구를위한 좋은 선택입니다. deglycosylation 다음과 같은 변경 사항은 겔 이동성의 교대 ​​또는 glycan 민감한 시약과 염색법에 의해 감지 수 있습니다.

특정 엔도와 exoglycosidases를 사용하여 단백질 글리코 실화의 식별 및 특성

이 비디오에서는 황산화 글리코사미노글리칸 올리고당 단편의 알시안 블루 및 실버 결합 염색 절차를 보여줍니다. 이 결합된 염색 기술은 폴리아크릴아미드 겔에서 서로 다른 길이의 글리코사미노글리칸 중합체 띠를 크게 증폭시킵니다.

은 염색 황화 글리코사미노글리칸의 염색: 폴리아크릴아미드 겔에서 황화 글리코사미노글리칸의 시각화를 위한 염색 방법

O-결합 글라이칸의 다양성을 종합적으로 탐구하기 위해 과메틸화 및 신속한 상 분할 방법과 결합된 겔 내 환원적 β-제거를 위한 새로운 절차를 SDS-PAGE에 의해 분해되고 질량 분석법에 의한 후속 글리코마이크 분석이 가능한 당단백질에서 직접 방출되는 O-결합 글라이칸의 분석에 적용됩니다.

질량 분석에 의해 - 겔 개선 환원 적 β-제거 포괄적 인 O가 연결된과에 대한 설포 글라 이코믹스

여기, 우리는 2 차원 젤 전기 이동 법 (2DE) 질량 분석 (MS) 분리 하 고 좋고 재현할 2DE 패턴 선물 인간의 뇌 adenoma 조직 프로테옴 식별과 함께 제시. 많은 단백질은 고감도 석사의 사용과 복잡 한 암 프로테옴을 분석할 때 각 2DE 자리에 관찰 됩니다.

2 차원 젤 전기 이동 법 질량 분석 방법으로 인간의 뇌 Adenoma 조직 프로테옴의 분석에 대 한 결합

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화학 Cross-linking 및 여러 소 단위 단백질 어셈블리의 건축을 그대로 단백질 복합물의 질량 분석

여기, 우리는 새로운 형광 얼룩 polyacrylamide 젤에서 총 단백질 검출에 대 한 기술 개요는 상세한 프로토콜을 설명 합니다. 프로토콜 활용 Ag+를 감지 하는 실버 이온 전용 형광 턴 온 프로브-단백질 복합물, 전통적인 발은 얼룩의 특정 한계를 제거 하 고.

Polyacrylamide 젤에 단백질의 형광은 얼룩

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이노시톨 인산염 또는 인산성교단백질의 동정은 서부 블롯 또는 질량분광법에 결합된 친화성 크로마토그래피에 의한 단백질

이 프로토콜은 프로테오독성 항균제로 치료 한 후 대장균에서 집계 및 수용성 단백질의 추출 및 시각화를 설명합니다. 이 절차에 따라 다른 세균성 균주 및 /또는 치료 사이에 생체 내에서 단백질 골집 형성의 질적 비교를 할 수 있습니다.

프로테오독성 스트레스로 대장균 치료 후 단백질 골재의 추출 및 시각화

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Isolation of Mitochondria for Mitochondrial Supercomplex Analysis from Small Tissue and Cell Culture Samples(소조직 및 세포 배양 샘플에서 미토콘드리아 초복합체 분석을 위한 미토콘드리아 분리) 

배우세요 유기 용매와 초산 없이 쿠마시 브릴리언트 블루 G-250을 사용한 폴리아크릴아미드 겔 단백질 염색법을. 이 간단한 프로토콜은 전기영동 후 단백질 밴드를 1분 만에 선명하게 시각화하여 생화학 연구자들에게 안전하고 효율적인 분석 방법을 제공합니다.

유기 용매 및 초산없이 쿠매시 G - 250로 젤의 단백질 염색법

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