Name: 0.22 μm의 Sterivex 필터 및 세슘 클로라이드 밀도 기울기 원심 분리 장치에서 DNA 추출 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-18T05:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 14 s
Description: 배우세요 해양 플랑크톤 바이오매스에서 고분자량 게놈 DNA를 추출하고 세슘 클로라이드 밀도 기울기 원심 분리로 정화하는 방법을. 이 프로토콜은 환경 미생물 군집 연구를 위한 고품질 DNA 확보에 필수적입니다.

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우리는 해안과 열린 바다 바닷물의 낮은 산소 지역에 지속적인 연구를 지원하기위한 혁신, 브리티시 컬럼비아 기술 개발 기금과 국립 과학 및 캐나다의 공학 연구 협의회 (NSERC)에 대한 캐나다 재단 감사드립니다. JJW가 NSERC와 도스의 장학금이 지원되었고 NSERC, 킬람와 툴라 기초 미생물 다양성과 진화에 대한 재정 지원 센터에서 장학금으로 지원했다. SL은 미생물 다양성과 발전을위한 기초 자금 툴라 센터에 의해 지원되었다.

참고 :이 프로토콜에서 사용되는 모든 시약이 작동 주식을이 당신의 DNA 샘플 및 연구소 주식 오염의 교차 오염을 방지하는 것이 매우 중요 작은 실험실로 주식에서 aliquoted 있습니다. 또한, pipetting 때 교차 오염을 피하기 위해 모든 외에도 위해 피펫 팁을 변경할 수 있는지 확인하십시오. 부 원 : 세포 용해와 소화 <ol><li> 얼음 이전에 집중 planktonic의 바이오 매스를 포함 Sterivex 필터를 해동하여이 절차를 시작합니다. 단순 보려면 여기를 우리는 개별 필터를 처리를 위해 절차를 설명합니다. 실제로, 우리는 한 번에 처리 16 또는 이하의 필터를 권장합니다. </li><li> 필터가 해동되면 두 incubations의 첫 시작 : 하나는 세포를 lyse하고 단백질을 분해하는 RNA, 그리고 하나를 제거합니다. 첫 부화 들어, 필터 100 μl 라이 소 자임 (1000 μl TE 125 MG) 20 ML RNase (10 μg / ML)을 추가합니다. Parafilm와 필터를 봉인하고 37 하이브 리다이 제이션 오븐에 ° C 1 시간을 회전 둡니다. </li><li> 다음 부화 들어, 필터 100 μl Proteinase의 K 100 μl 20% SDS를 추가합니다. 55 봉인 그것이 하이브 리다이 제이션 오븐에 1-2시간 더 회전 Parafilm를 사용 떠나, 이번 ° C. </li><li> 5cc 주사기를 사용하여 15 ML 팔콘 튜브로 Sterivex 필터의 lysate를 전송합니다. 1 ML의 용해 버퍼와 필터를 씻어가 5cc 주사기를 사용하여 팔콘 튜브의 lysate에 액체 린스 추가할 수 있습니다. 이제 lysed하고 세포를 소화했는지, 당신은 그들의 DNA를 추출 준비가되어 있습니다. </li></ol> 두 번째 부분 : DNA 추출 <ol><li> 다음 단계는 당신의 lysate에서 DNA를 추출하기 위해 페놀 - 클로로포름 방법을 사용하는 것입니다. 교차 오염을 피하기 위해 각각의 이외에 대한 피펫 팁을 변경해야하고, lysate 튜브에 Isoamyl의 알코올 (IAA) : 클로로포름 : 페놀의 동일한 음량을 (3ml 정도) 추가합니다. 잘 섞어 10 초 와동. </li><li> 원심 분리기가 균형되어 있는지 확인하고, 5 분 2천5백g에서 튜브를 스핀. 아래에 샘플에서 페놀, 클로로포름 및 단백질을 포함하는 유기 층, 그리고 당신의 DNA, 물 구성되어 수성 층을, 및 기타 : 원심 분리하는 동안, 페놀 - 클로로포름 - lysate 혼합물은 두 레이어로 분리해야합니다 맨에 대한 자세한 친수성 ​​분자. </li><li> 새로운 15 ML 팔콘 튜브에 수성 레이어를 (당신의 DNA를 포함)의 전송. 피펫 팁 (항상 뒤에 수성 층의 작은 금액을 떠나)와 인터페이스를 만지지 않도록주의하십시오. </li><li> 교차 오염을 피하기 위해 각각의 이외에 대한 피펫 팁을 변경해야하고, IAA :이 새로운 튜브하려면, 클로로포름의 동일한 볼륨 (약 3mL)를 추가합니다. 10 초 와동. 이 단계는 당신의 DNA 샘플에서 남아있는 페놀을 제거하는 데 도움이됩니다. </li><li> 수성 층 분명히 때까지 5 분 또는 2천5백그램에서 스핀. 새로운 표시 팰컨 튜브에 수성 레이어를 전송하고 피펫 팁 (항상 뒤에 수성 층의 작은 금액을 떠나)와 인터페이스를 터치하지 않도록주의하고, pH를 8.0에서 TE 1 ML를 추가합니다. 이것은 수성 층은 DNA 추출물이 포함되어 있습니다. </li></ol> 부 세 : DNA 농도 및 세척 <ol><li> 다음 단계는 15 ML Amicon 울트라 원심 분리기 튜브의 DNA 샘플을 세척하고 집중하는 것입니다. Amicon 튜브가 (여과액)를 통해 흐름을 잡으려고 특정 분자량 (retentate)과 튜브에 이상 분자를 유지하는 필터로 구성되어 있습니다. 이 경우 필터는 DNA (retentate)을 유지합니다. Amicon 울트라 튜브 필터 구획 단계 2.5에서 DNA 추출물을 전송합니다. </li><li> 10 분 3,500g에 스핀. Amicon 필터에 보관 액체 미만의 1 ML이 있는지 확인하십시오. 더 retentate 남아 리필 TE와 필터와 다시 스핀 경우. 교차 오염을 피하기 위해 모든 TE 추가를위한 신선한 피펫 팁을 사용해야합니다. </li><li> 다른 팰컨 튜브로 흐름을 통해, 또는 여과수를 제거하고 젤에서 최종 DNA 제품을 확인까지 (파트 포) 냉장고에 저장합니다. </li><li> Amicon 필터 2 ML TE 버퍼를 추가하고 교차 오염을 피하기 위해 각각의 TE 추가를위한 신선한 피펫 팁을 사용해야하고, 6 분 3천5백g에 스핀. 풀 스텝 3.3 그걸로 여과물하고 냉장고에 저장합니다. </li><li> 세 세척 (항상 신선한 피펫 팁을 사용해야하는)의 총 TE와 함께 DNA 번 더 씻어하고, (사람마다 단계 3.3 및 3.4 등) 여과물 각 시간을 절약. 마지막 세척 들어, 스핀 Amicon 필터에 retentate 유해 200-500 ML까지. 최종 볼륨을 기록하고 표시 1.5 ML Eppendorf 튜브에 (당신의 DNA를 포함) retentate를 전송합니다. </li></ol> 부 네 : DNA 품질의 결정 <ol><li> DNA의 품질을 확인하고 젤 0.8 % 아가로 오스 겔 역에서 샘플을 실행하여 DNA의 농도를 추정하룻밤 1ml ethidium 브로마이드 (EtBr)로 ined. (사용하는 경우 매우주의 EtBr를 이것은 알려진 mutagen하고 의심 발암 물질입니다. 종종 장갑을 변경하고 실험실의 나머지 부분과 피부에 EtBr 전송을 방지해야합니다.)으로서 DNA 사다리 옆에있는 샘플을로드 크기와 강도 기준 (다음 단계 참조). </li><li> 처음 몇 차선에서, 다양한 분자 무게와 농도의 밴드와 함께 사다리를로드합니다. 처음이자 마지막 차선에서 (바깥쪽 차선), 1킬로바이트의 50ng/μl 부하 10 μl + 또는 2log 사다리 : 우리는 다음의 로딩 패턴을 권장합니다. 2,3 및 4 차선, 부하 2 μl, 5 μl 및 50ng/μl λHindIII의 사다리 각각 10 μl,에. 마지막으로, 각 샘플에 대한 염료와 DNA 추출물의 차선 당 5 μl를로드합니다. </li><li> 약 16시간 15 볼트 (우리가 야간 실행하는 것이 좋습니다)에서 겔을 실행합니다. </li><li> 그 다음날, UV 젤 문서 시스템을 사용하여 겔을 사진에 담아보세요. 당신의 DNA와 농도의 분자량 범위를 확인하려면 사다리의 밴드에 대한 샘플 밴드를 비교할 수 있습니다. 양질의 DNA 높은 분자량을 (&gt; 36킬로바이트) 있고, 전단 / 저하의 작은 증거를 보여줍니다. 그림 1을 참조하십시오. </li></ol> 부품 다섯 : 세슘 클로라이드 그라데이션 원심 분리 <ol><li> DNA 품질이 좋고 수량이 충분있다면, 당신은 세슘 염화물 (CsCl) 기울기 원심 분리를 수행하여 DNA를 정화 진행할 수 있습니다. 이 정화 단계는 선택 사항이며 모든 다운 스트림 응용 프로그램 (예를 들어, 당신이 단순히 PCR 반응을 수행하려는 경우 반면에, 정화는 보통 필요 없습니다, 당신이 정화서는 fosmid 라이브러리를 생성하려는 경우)에 필요한되지 않습니다. 첫째, 각 시료에 대해 하나 원심 분리기 튜브 레이블. </li><li> 각각의 원심 분리기 튜브하려면, CsCl, 게놈 DNA의 178 μl 160 MG를 추가합니다. 튜브에 CsCl와 DNA를 추가한 후, 튜브 위에 parafilm의 작은 조각을 배치하고 부드럽게 구성 요소를 혼합하기 위해 튜브에게 10-20 번 반전. pipetting으로 혼합하지 마십시오, 이는 DNA의 전단 원인이 될 수 있습니다. 다음,이 튜브 10 μg / μl EtBr 10 μl를 추가하고 같은 방식으로 그것을 섞는다. (사용하는 경우 매우주의 EtBr - 그것이 알려진 mutagen하고 의심 발암 물질입니다. 종종 장갑을 변경하고 실험실의 나머지 부분과 피부에 EtBr 전송을 방지해야합니다.) </li><li> 모든 튜브의 무게는 튜브 사이에 체중 차이가 1 MG보다하는 이러한 원심 분리하기 전에 균형 있는지 확인합니다. </li><li> 회전자를 사용 hemostat에 튜브를 삽입, 뚜껑을 닫고 초원 심 분리기 내부의 회전자를 놓습니다. </li><li> 초원 심 분리기 도어를 닫습니다. 진공, 당신은 빨리 문 닫아으로 적용됩니다. 18 시간 동안 100,000 RPM 20 ° C.에서 하룻밤 실행 </li><li> 원심 분리가 완료되면, 튜브 랙에 hemostat과 장소를 사용하여 회전자에서 튜브를 꺼내. </li><li> 푸른 빛의 transilluminator로 DNA를 시각화하거나 사용할 경우 어두운 방에서 긴 파장 UV 라이트를 사용합니다. DNA 밴드를 볼 수 황색 필터 안경을 착용하십시오. 그림 2를 참조하십시오. </li><li> 살균 1cc 주사기와 바늘을 (26G 8분의 5)를 사용하여 DNA 밴드를 제거하고 1.5ml Eppendorf 튜브에 놓으십시오. </li><li> 주사기의 죽은 공간에 갇혀있는 DNA의 대부분을 복구하기 위해, 100 μl TE와 주사기를 씻어 튜브에 씻어서 솔루션을 추가합니다. 교차 오염을 방지하기 위해 시료 100 μl TE 버퍼 하나의 튜브를 준비합니다. </li><li> DNA의 EtBr을 제거하려면 부드럽게 튜브 10-20 시간, 1 분 10,000 rpm으로 원심 분리기 반전, 튜브에 물이 포화 butanol의 동일한 볼륨을 추가하고 상위 레이어를 폐기하십시오. </li><li> 4 번 이상 - butanol의 색상은 3 투명 때까지 세척 반복합니다. </li><li> 플레이스 4 ML Amicon 울트라 원심 분리기 튜브의 TE하고 위에서 DNA 솔루션을 추가합니다. </li><li> DNA의 볼륨이 약 100-500 μl (약 6~7분)로 감소 때까지 상온에서 3,500g에서 원심과 흐름을 통해 폐기하십시오. </li><li> Amicon 필터 2ml TE를 추가하고 교차 오염을 피하기 위해 각 이외에 신선한 피펫 팁을 사용해야하고, 6 분 3,500그램에서 원심 분리기. 두 번 반복합니다. </li><li> 필요에 따라 추가 원심 분리에 의해 50-100 μl의 최종 볼륨에 집중하고 새로운 1.5 ML Eppendorf 튜브에 필터의 DNA 솔루션을 전송할 수 있습니다. </li><li> Amicon 필터 40 μl TE를 추가하고 나머지 DNA를 씻어 두 필터 세포막을 따라 위아래로 피펫. 5.15에있는 튜브에이 솔루션을 추가합니다. </li><li> 200 μl autoclaved 물을 추가 7 분 동안 10,000 rpm으로 centrifuging하여 Microcon 튜브 및 prewash Microcon에 Microcon YM - 30 필터 장치를 배치합니다. </li><li> 추가로 DNA를 집중 5.16에서 위해 prewashed Microcon에 DNA 솔루션을 추가합니다. 삼분 - 1 5천~1만g에서 원심 분리기. 액체의 양을 확인필터 및 반복 원심 분리에 필터에 액체의 양은 약 50 μl로 감소 때까지. </li><li> 새로운 Microcon 튜브에 거꾸로 필터 장치를 삽입하고 3 분 1,000그램에서 원심 분리기. 집중 솔루션의 이상적인 크기는 50-60 μl입니다. </li><li> 측정 및 Nanodrop에 DNA의 농도를 기록하고 (260nm한다) 최고의 품질을 확인합니다. </li><li> 마이너스 20 주식과 동결 일을위한 깨끗한 eppendorf 튜브에 DNA의 작은 나누어지는을 전송합니다. 마이너스 80에서 두 번째 깨끗한 eppendorf 및 동결에 DNA의 나머지 부분을 전송합니다. </li></ol> 대표 결과 : 이 프로토콜이 올바르게 완료되면, 당신은 1 그림과 유사한 DNA 품질의 결정 단계에서 4.4 후 젤 이미지를 볼 수 있습니다. 추출물의 실제 DNA 농도는 샘플의 소스에 따라 달라집니다. CsCl 기울기 원심 분리 단계에서 5.7 후, 파란 빛으로 조명 게놈 DNA 2 그림과 유사해야합니다. <img src="/files/ftp_upload/1352/1352Fig1newer.png" alt="그림 1" /> 그림 1. intercalating 에이전트 ethidium 브로마이드 (10 MG / ML) 물들일 아북극의 태평양 (중복)를, 네 개의 깊이에서 수집한 높은 분자량의 DNA의 0.8 % 아가로 오스 겔 전기 영동 이미지. 젤은 1X TBE 젤 실행 버퍼에 ~ 16hrs을위한 15V에서 실행되었다. 샘플 밴드는 기계적 전단 (싱글 밴드 또는 여러 밴드 반대로 얼룩을 보여줍니다)의 작은 증거를 보여주는 좋은 품질의 10m 추출물 일부 RNA가 (0.5-2.0 KB 범위에 얼룩 참조) 이월 유지하지만. <img src="/files/ftp_upload/1352/1352Fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2. CsCl 기울기 원심 분리 후 파란 광선에 의해 조명 게놈 DNA 밴드.

<ol><li>Beja, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((To+BAC+or+not+to+BAC%3A+marine+ecogenomics%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">To BAC or not to BAC: marine ecogenomics.</a> Curr Opin Biotechnol. 15 (3), 187-190 (2004).</li>
<li>Beja, O., Suzuki, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+and+analysis+of+bacterial+artificial+chromosome+libraries+from+a+marine+microbial+assemblage%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Construction and analysis of bacterial artificial chromosome libraries from a marine microbial assemblage.</a> Environ Microbiol. 2 (5), 516-529 (2000).</li>
<li>DeLong, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Community+genomics+among+stratified+microbial+assemblages+in+the+oceans+interior%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Community genomics among stratified microbial assemblages in the oceans interior.</a> Science. 311, 496-503 (2006).</li>
<li>Stein, J. L., Marsh, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+uncultivated+prokaryotes%3A+isolation+and+analysis+of+a+40-kilobase-pair+genome+fragment+from+a+planktonic+marine+archaeon%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Characterization of uncultivated prokaryotes: isolation and analysis of a 40-kilobase-pair genome fragment from a planktonic marine archaeon.</a> J Bacteriol. 178 (3), 591-599 (1996).</li>
<li>Somerville, C. C., Knight, I. T., Straube, W. L., Colwell, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple%2C+rapid+method+for+the+direct+isolation+of+nucleic+acids+from+aquatic+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A simple, rapid method for the direct isolation of nucleic acids from aquatic environments.</a> Appl. Environ. Microbiol. 55 (3), 548-554 (1989).</li>
</ol>

처리하는 방법에 많은 샘플 아르에 따라이 두 한 시간 동안 부화 단계 및 반복 세척과 원심 분리 단계로 인해 시간이 많이 소요되는 절차하실 수 있습니다. 충분한 시간을두고이 절차에 대한 이틀 동안 계획하는 것이 좋습니다. 해당 볼륨이 남은까지 (파트 3 번 반복) 추가 TE의 세척 및 centrifugations하고 시도, DNA 농도 및 세척하는 동안 200 500μl로 줄이기 위해 Amicon 튜브의 마지막 추출 볼륨을 받고 문제가있다면. 추출이 심하게 클로로포름의 냄새가있다면 또한, 그것은 냄새가 클로로포름의 모든이 제거되어 있는지 확인하기 위해 lessens까지 추가로 세척을하는 것이 좋습니다. 다시,이 프로토콜에 사용되는 모든 시약은 작은 작업에 실험실 주식 aliquoted 아르 주식 - 이것은 당신의 DNA 샘플 및 연구소 주식 오염의 교차 오염을 피하기 위해 매우 중요합니다. 또한, pipetting 때 교차 오염을 피하기 위해 모든 외에도 위해 피펫 팁을 변경할 수 있는지 확인하십시오.

A correction was made to "<a href="/video/1352">DNA Extraction from 0.22 &#181;M Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation</a>". A typo in a volume's measurement was corrected in step 1.2.
The step was corrected from:
Once the filter has thawed, begin the first of two incubations: one to lyse the cells and remove RNA, and one to break down proteins. For the first incubation, add 100 &#956;l lysozyme (125 mg in 1000 &#956;l TE) and 20 ml RNase A (10 &#956;g/ml) to the filter. Reseal the filter with Parafilm and leave it to rotate in the hybridization oven at 37&#176;C for 1 hour.
to:
Once the filter has thawed, begin the first of two incubations: one to lyse the cells and remove RNA, and one to break down proteins. For the first incubation, add 100 &#956;l lysozyme (125 mg in 1000 &#956;l TE) and 20 &#956;l RNase A (10 &#956;g/ml) to the filter. Reseal the filter with Parafilm and leave it to rotate in the hybridization oven at 37&#176;C for 1 hour.

A correction was made to <a href="/video/1352">DNA Extraction from 0.22 &#181;M Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation</a>. A typo in a volume's measurement was corrected in step 1.2.

Erratum: DNA Extraction from 0.22 &#181;M Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation

<table><tbody><tr><td>1cc 주사기 (26G 5/8 바늘)</td><td>BD Biosciences</td><td>309597</td><td></td></tr><tr><td>1 ml 주사기 (26G 5/8 바늘)</td><td>BD Biosciences</td><td>309597</td><td></td></tr><tr><td>1.5ml 에펜도르프 튜브</td><td>Eppendorf</td><td>0030 125.150</td><td></td></tr><tr><td>15ml 튜브</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430791</td><td></td></tr><tr><td>5cc 주사기</td><td>BD Biosciences</td><td>309603</td><td></td></tr><tr><td>Amicon&amp;#174; Ultra-4 원심분리 필터 장치</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC801096</td><td>10,000 공칭 분자량 제한치</td></tr><tr><td>부탄올</td><td>Fisher Scientific</td><td>A383-1</td><td>물로 포화시키십시오 (부탄올:물 = 1:1).</td></tr><tr><td>원심분리기 로터, JA5.3 </td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>368690</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기, Avanti&amp;#174; J-E</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>369003</td><td></td></tr><tr><td>염화세슘</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4036</td><td></td></tr><tr><td>클로로포름:IAA (24:1)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>25666-500ML</td><td></td></tr><tr><td>에티듐 브로마이드 (EtBr)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1510-10ml</td><td></td></tr><tr><td>에틸렌디아민테트라아세트산 이나트륨염 이수화물</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>하이브리다이제이션 오븐</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-247-10</td><td>37&amp;#x00B0;C &amp;amp; 55&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>용해 완충액</td><td></td><td></td><td>0.75 M sucrose, 40 mM EDTA, 50 mM Tris (pH 8.3)</td></tr><tr><td>라이소자임</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6876-5G</td><td>1000 중 125 mg &amp;#x03BC;l TE</td></tr><tr><td>마이크로콘(Microcon)&amp;#174; Ultracel YM-30 원심 분리 필터 유닛</td><td>EMD Millipore</td><td>42410</td><td>50 bp 컷오프</td></tr><tr><td>파라필름</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-374-10</td><td></td></tr><tr><td>페놀:클로로포름:IAA (25:24:1)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>77617-500ML</td><td></td></tr><tr><td>프로테이나제 K</td><td>Qiagen</td><td>19133</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2539-100</td><td>10 &amp;#x03BC;g/ml</td></tr><tr><td>Safe Imager&amp;#8482; 청색광 투과조명기</td><td>Invitrogen</td><td>S37102</td><td></td></tr><tr><td>소듐 도데실 설페이트 (SDS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4509</td><td>20% SDS</td></tr><tr><td>Sterivex 필터</td><td>Fisher Scientific</td><td>SVG010RS</td><td></td></tr><tr><td>수크로스</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>탁상형 원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td>5415D</td><td></td></tr><tr><td>TE 완충액, pH 8.0</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trizma&amp;#174; 염기</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>초원심분리기 로터, TLA 100</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>343847</td><td></td></tr><tr><td>초원심분리기 튜브 (7X20mm, PC)</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>343775</td><td></td></tr><tr><td>초원심분리기 튜브 랙</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>348302</td><td></td></tr><tr><td>초원심분리기, Optima&amp;#174; 최대값</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

0.22 μm의 sterivex 필터 및 세슘 클로라이드 밀​​도 기울기 원심 분리 장치에서 dna 추출

DNA Extraction from 0.22 &mu;M Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation

이 방법은 스토리지 / 용해 버퍼를 취급​​하고 -80 ° C에 보관되었습니다 0.22 μm의 Sterivex 필터에 집중 planktonic의 바이오 매스에서 높은 분자량의 게놈 DNA를 추출하고, 세슘 염화물 밀도 기울기를 사용하여이 DNA를 정화하는 데 사용됩니다. 프로토콜은 세포에서 DNA를 해방하고 RNA를 제거하는 방법은 두 한 시간 배양 단계를 시작합니다. 다음으로, 페놀 일련의 : 클로로포름 및 클로로포름 extractions는 단백질과 세포막의 구성 요소, 수성 DNA 추출물의 수집과 추출을 씻어하고 집중 여러 버퍼 교환 단계를 제거하기 위해 원심 분리 다음에 수행됩니다. 부품 다섯 세슘 염화물 농도 기울기를 통해 옵션 정화에 대해 설명합니다. 그것은 혼동을 피하기 및 프로토콜 시간을 줄이려고 한 번에 미만 15 샘플에서 작동하도록 권장합니다. 이 프로토콜에 필요한 총 시간은 추출되는 샘플 수에 따라 달라집니다. 10-15 샘플 및 적절한 원심 분리 장비를 사용할 수있는 가정의 경우이 모든 프로토콜 3 일이 소요됩니다. 당신은 프로세스의 초기에 온도로 설정 하이브 리다이 제이션 오븐을 가지고 있는지 확인하십시오.

우리는 정화를 위해 세슘 염화물 밀도 기울기 원심 분리 다음 0.22 μm의 Sterivex 필터에 집중 planktonic의 바이오 매스에서 높은 분자량의 게놈의 DNA의 추출을위한 방법을 설명합니다.

0.22 μm의 Sterivex 필터 및 세슘 클로라이드 밀​​도 기울기 원심 분리 장치에서 DNA 추출

이 방법은 ... 처리된 0.22 $\mu$M Sterivex 필터에 농축된 플랑크톤 바이오매스로부터 고분자량 게놈 DNA를 추출하는 데 사용됩니다.

안녕하세요, 브리티시 컬럼비아 대학교 미생물 및 면역학과의 Steven Hallam 연구실에서 온 Jody입니다. 오늘은 0.2 micron STX 필터에 농축된 해수 샘플로부터 게놈 DNA를 추출하고, 이를 염화세슘 밀도 구배 원심분리를 통해 정제하는 과정을 보여드리겠습니다. 저희 연구실에서는 해양 환경의 미생물 군집 구조, 다양성 및 대사를 연구하기 위해 이 방법을 사용하여 환경 DNA를 확보하고 있습니다.그럼 시작하겠습니다. 먼저, 단순화를 위해 플랑크톤 바이오매스로 농축하고 용해 완충액(lysis buffer)으로 처리하여 냉동 보관해 두었던 X 필터 스트립을 얼음 위에서 해동하는 것으로 이 프로토콜을 시작하십시오. 여기서는 개별 필터를 처리하는 절차에 대해 설명합니다.실제 작업 시에는 한 번에 15개 이하의 필터를 처리하는 것을 권장합니다. 필터가 해동되면 두 차례의 배양 중 첫 번째 단계를 시작하십시오. 첫 번째는 세포를 용해하고 RNA를 제거하기 위한 단계이며, 두 번째는 단백질을 분해하기 위한 단계입니다.첫 번째 배양을 위해 100 µL의 lysozyme과 20 µL의 RN a's a를 필터에 첨가합니다. 파라필름으로 필터를 다시 밀봉하고 37 °C에서 1시간 동안 회전시키며 방치합니다. 다음 배양을 위해 100 µL의 protein ace KN과 100 µL의 20% SDS를 필터에 첨가합니다.Parafilm을 사용하여 필터를 다시 밀봉하고 1~2시간 더 회전시키십시오. 이때 온도는 55 °C로 설정합니다. 5 cc 주사기를 사용하여 Stax 필터에서 용해물을 15 mL falcon 튜브로 옮깁니다.필터를 1 mL의 용해 버퍼로 헹구고, 헹굼액을 팰컨 튜브에 담긴 용해물에 추가하십시오. 세포를 용해하고 소화시켰으므로 이제 DNA를 추출할 준비가 되었습니다. 다음 단계는 페놀 클로로포름 방법을 사용하여 용해물에서 DNA를 추출하는 것입니다.용해물 튜브에 동일한 부피인 약 3 mL의 phenol chloroform, isoamyl alcohol을 첨가하고 10초 동안 vortex하여 잘 섞습니다. 튜브를 2,500 ×g에서 5분 동안 원심 분리합니다. 원심 분리 과정 동안 phenol chloroform 용해물 혼합물은 두 개의 층으로 분리되어야 합니다.하단에는 페놀, 클로로포름 및 샘플 유래 단백질을 포함하는 유기층이 형성됩니다. 그리고 대개 상단에는 DNA, 물 및 기타 친수성 분자로 구성된 수성층이 형성됩니다. DNA가 포함된 수성층을 새로운 15 milliliter Falcon 튜브로 옮깁니다. 이 튜브에 동일한 부피의 클로로포름 이소아밀 알코올 혼합액을 첨가하고 10초 동안 볼텍싱합니다.이 단계에서는 DNA 샘플에서 남아있는 페놀을 제거합니다. 수층이 투명해질 때까지 또는 5분 동안 2,500 ×g로 원심분리하십시오. 수층을 라벨이 부착된 새 팰콘 튜브로 옮기고 pH 8의 TE 1 mL를 추가하십시오.이제 DNA 추출물이 준비되었습니다. 다음 단계는 15 mL Amazon 초원심분리기 튜브에서 DNA 샘플을 세척하고 농축하는 것입니다. DNA 샘플을 필터 구획으로 옮기십시오.Ultra tube theon 튜브는 특정 분자량 이상의 분자를 유지하는 필터, 그리고 여과액을 받는 튜브로 구성됩니다. 이 경우, 3,500 ×g에서 10분 동안 원심분리하여 필터에 DNA를 유지시킵니다. Amon 필터에 남은 액체가 1 mL 미만인지 확인하십시오.잔류물이 더 남아 있다면, 필터에 TE를 다시 채우고 다시 원심분리하십시오. 통과액 또는 여과액을 다른 팰콘 튜브로 옮겨 냉장 보관하고, 겔에서 최종 생성물을 확인하십시오. Amazon 필터에 2 mL의 TE 완충액을 넣고 3,500 ×g에서 6분 동안 원심분리하십시오. 이전과 동일하게 여과액을 제거하십시오.DNA를 TE로 두 번 더 세척하여 총 세 번의 세척 과정을 거치며, 마지막 세척 원심분리 시 Amon 필터에 200 to 500 µL의 TE가 남을 때까지 매번 여과액을 회수합니다. 최종 부피를 기록하고 라벨이 부착된 1.5 mL 에펜도르프 튜브로 옮깁니다. 세척되어 농축된 DNA 70 µL를 분주하여 작업 용액(working stock)으로 사용합니다.작업 용액(working stock)을 -20°C에서 보관하십시오. 남은 DNA는 -80°C에서 냉동 보관하십시오. DNA와 함께 샘플을 겔에 전기영동하여 최종 산물의 DNA 농도와 품질을 확인하십시오.크기와 강도 표준으로 사용되는 래더를 설정하기 위해 0.8% AROS 겔에 에티듐 브로마이드를 첨가하여 하룻밤 동안 전기영동을 수행합니다. 처음 몇 개의 레인에 다양한 분자량과 농도의 밴드가 포함된 래더를 로딩하며, 다음과 같은 로딩 패턴을 권장합니다. 처음 두 레인에는 1 kb plus 래더 10 µL를 로딩하고, 이어지는 세 레인에는 50 ng/µL Lambda H3 래더를 각각 2 µL, 5 µL, 10 µL씩 로딩합니다.마지막으로, 레인당 5 µL의 DNA 추출물 샘플을 로딩합니다. 15 V에서 약 16시간 동안 젤 전기영동을 수행합니다. UV 젤 문서화 시스템을 사용하여 젤을 촬영함으로써 DNA의 분자량 범위와 농도를 결정합니다.샘플 밴드를 래더의 밴드와 비교하십시오. 품질이 좋은 DNA는 분자량이 높고 전단(shearing)이나 분해의 증거가 거의 나타나지 않습니다. DNA 품질이 양호하고 양이 충분하다면, 세슘 클로라이드 밀도 구배 원심분리를 수행하여 DNA를 정제하십시오.먼저 원심분리 튜브에 라벨을 부착하고, 각 샘플당 하나의 원심분리 튜브를 준비하여 각 튜브에 160 mg의 cesium chloride와 178 µL의 genomic DNA를 첨가합니다. 튜브 입구를 작은 파라필름 조각으로 덮고 성분들이 섞이도록 튜브를 10~20회 천천히 뒤집어 섞습니다. DNA의 전단 현상을 일으킬 수 있으므로 피펫팅으로 섞지 마십시오.그런 다음 튜브에 AUM bromide 10 µL를 첨가하고 다시 혼합합니다. 원심분리 전 튜브의 균형이 잘 맞는지 확인하고, 튜브 간의 무게 차이가 1 mg 미만이 되도록 합니다. 핀셋 가위를 사용하여 튜브를 초고속 원심분리기 로터에 넣습니다.그런 다음 로터 덮개를 닫고 로터를 초원심분리기 내부에 넣은 후 닫습니다. 도어를 닫으면 즉시 초원심분리기 도어 진공이 적용됩니다. 20 °C에서 100,000 RPM으로 총 18시간 동안 하룻밤 동안 가동합니다.원심분리가 완료되면 핀셋 가위를 사용하여 로터에서 튜브를 꺼내 랙에 놓습니다. 튜브를 청색광 투과조명기로 옮기고 호박색 필터 안경을 착용합니다. 그런 다음 청색광을 켜고 멸균된 1 cc 주사기와 바늘을 사용하여 DNA 밴드를 확인하십시오.DNA 밴드를 제거한 다음 1.5 milliliter 에펜도르프 튜브에 넣어 주사기의 데드 스페이스에 갇혀 있는 DNA 대부분을 회수하십시오. 100 microliters te로 주사기를 헹군 후 세척액을 튜브에 추가합니다. 교차 오염을 방지하기 위해 샘플당 100 microliters te 버퍼가 담긴 튜브를 하나씩 준비하십시오.DNA에서 AUM bromide를 제거하려면, 튜브에 동일한 부피의 포화 부탄올 수용액을 첨가하십시오. 튜브를 10~20회 정도 가볍게 뒤집어 섞은 후, 10,000 RPM에서 1분 동안 원심 분리하고 상층액을 제거하십시오. 부탄올의 색이 투명해질 때까지 세척 과정을 3~4회 더 반복하십시오.TE 4 mL를 ancon 초원심분리 튜브에 넣고, 위의 DNA 용액을 추가한 후 실온에서 3,500 ×g로 원심분리하여 DNA 부피가 약 100~500 µL가 될 때까지 줄인 다음 여과액을 버립니다. Amazon 필터에 TE 2 mL를 추가하고 3,500 ×g에서 6분 동안 원심분리합니다. 이 과정을 두 번 더 반복하여 TE로 총 3회 세척하고, 필요에 따라 추가 원심분리를 수행하여 최종 부피가 50~100 µL가 되도록 농축합니다.필터 위의 DNA 용액을 새로운 1.5 milliliter 에펜도르프 튜브로 옮깁니다. 필터에 40 microliters TE를 가하고, 두 필터 막을 따라 피펫팅하여 남아 있는 DNA를 모두 씻어냅니다. 이 용액을 농축된 DNA가 들어 있는 튜브에 추가합니다.MicroCon tube에 MicroCon YM 30 필터 유닛을 장착하고, 200 µL의 오토클레이브 멸균수를 첨가한 후 10,000 RPM에서 7분 동안 원심분리하여 MicroCon을 사전 세척합니다. DNA를 추가로 농축하기 위해 사전 세척된 MicroCon에 DNA 용액을 넣고 5,000~10,000 ×g에서 1~3분 동안 원심분리합니다. 필터 위의 액체 양을 확인하고, 액체 양이 약 50 µL로 줄어들 때까지 원심분리를 반복합니다.필터 유닛을 새 MicroCon 튜브에 거꾸로 넣고 1000 ×g에서 3분 동안 원심분리합니다. 농축액의 이상적인 양은 50~60 µL입니다. DNA 샘플을 새로운 1.5 mL 에펜도르프 튜브로 옮깁니다.NanoDrop를 사용하여 DNA 농도를 측정하고 피크 품질을 확인합니다. 순수한 DNA의 흡광도 그래프는 260 nanometers에서 뚜렷한 피크를 보여야 합니다. 남은 DNA는 -80 °C에서 냉동 보관합니다.본 프로토콜을 정확하게 수행하면 그림 1과 유사한 젤 이미지를 확인할 수 있으며, 추출물의 실제 DNA 농도는 샘플의 기원에 따라 달라질 수 있습니다. 본 프로토콜을 정확하게 수행하면 튜브 중앙을 가로지르는 DNA 밴드를 명확하게 확인할 수 있습니다. 그림 2에서 보여드린 바와 같이, Sterex 필터에서 genomic DNA를 추출하고 세슘 클로라이드 밀도 구배를 사용하여 이를 정제하는 방법을 설명해 드렸습니다.본 절차를 수행할 때는 시작 전 필요한 모든 시약과 소모품이 준비되었는지 확인하는 것이 중요합니다. 둘째로, 절차를 세심하게 완료할 수 있도록 최소 3일의 전체 일정을 계획하십시오. 이상입니다.시청해 주셔서 감사합니다. 여러분의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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토양 미생물 커뮤니티의 높은 분자량과 높은 품질의 게놈 DNA를 분리하는 방법이 설명되어 있습니다.

소일스 및 세디먼츠에서 높은 분자량의 게놈의 DNA의 추출

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