전체 심장 이미징에 대한 형광 광 프로젝션 Tomography에 대한 출생 정규화

정규화된 본 광학 투영 토모그래피(normalized born optical projection tomography)를 수행하기 위해, 먼저 시료를 고정하고 아가로스(agar) 실린더에 매립합니다. 그 후 시료를 수직축을 따라 회전시키며 여기 파장으로 균일하게 조사하고, C, CD에 적합한 광학계를 사용하여 투과도를 측정합니다. 투과 조명 모드에서 해당 파장의 형광 신호를 측정합니다.

획득한 형광 및 흡수 이미지는 정규화된 본 비율(born ratio)을 결정하고 샘플 내 형광체의 분포를 재구성하는 데 사용됩니다. 안녕하세요, 저는 Mass General Hospital, Harvard Medical School의 센터 시스템 생물학(Centers for Systems Biology)에서 근무하는 Claudia Naone입니다. 저는 뮌헨 공과대학교 및 AI 센터 뮌헨의 생물학 및 의료 영상 연구소(Institute for Biological and Medical Imaging) 소속 Danielle Raki입니다.

저는 Giselle Fido입니다. 저는 하버드 의과대학, 매사추세츠 종합병원 C-M-I-C-S-B의 실험 수술 센터 소장입니다. 오늘은 광학 투영 단층 촬영을 위한 Born 정규화 접근 방식을 이용한 실시간 ex vivo 전장기 영상 촬영 절차를 보여드리겠습니다.

본 실험실에서는 중공 기관 내 형광 분자 프로브의 분포를 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다. 그럼 시작하겠습니다. 본 영상과 제공되는 보조 영상을 통해 준비된 조직이나 기관을 이미징하기 위한 광투영 단층촬영(optical projection tomography) 사용 절차를 설명하겠습니다.

본 시스템을 사용하여 발달 중인 초파리(drosophila)의 타임랩스 이미징을 수행하는 방법을 설명합니다. 광학 투영 토모그래피(optical projection tomography)의 3차원 이미징 기술에는 광학 장치와 회전 스테이지의 독특한 조합이 필요합니다. 본 비디오 세그먼트에서는 이미징 절차에 대해 상세히 설명하겠습니다.

우선, 주 광원은 조명 및 흡광 측정을 위한 광원으로 사용되며, 형광 측정을 위한 형광 여기를 제공하기 위해 먼저 좁은 대역 통과 간섭 필터로 필터링됩니다. 그다음, 빛은 일련의 고정 및 가변 중성 밀도 필터를 통과합니다. 이는 자동 셔터와 결합하여 시료에 조사되는 빛의 양을 조절하고, 광퇴색을 방지할 수 있을 만큼 충분히 낮게 유지하는 역할을 합니다.

빔 확장기와 디퓨저 렌즈가 결합된 글란 망원경 렌즈를 사용하여 시료에 균일한 조명을 조사합니다. 마지막으로, 광학 협대역 통과 간섭 필터를 사용하여 여기 광원의 빛을 광학적으로 정제합니다. 시료는 투명화 용액에 침전시키며, 이미징을 위해 유리 튜브 내에 고정합니다.

시료는 절대 정밀도가 0.05도인 고속 회전 스테이지를 통해 수직축을 따라 회전합니다. 세 개의 개별 수동 컨트롤러를 사용하여 시료의 수직축을 직교 평면에서 기울이거나 조정할 수 있습니다. 흡수 신호는 투과 조명 방식으로 획득하며 CCD 카메라로 직접 검출합니다.

형광 신호는 좁은 대역 통과 간섭 필터(narrow band pass interference filter)를 통해 걸러지고 장파장 통과 필터(long pass filter)와 결합된 후, 텔레센트릭 렌즈(tele centric lens)로 수집됩니다. 텔레 렌즈는 광학 투영 단층 촬영(optical projection tomography)에 이상적인 고유한 특성을 제공한다는 장점이 있습니다.

렌즈의 초점 위치에 있는 렌즈 어셈블리 내 조리개 스톱의 존재가 핵심입니다. 이는 이미지가 광축과 평행하게 이동하도록 보장합니다. 이를 통해 원근 왜곡을 제거하고 텔레센트릭 깊이 내의 여러 초점 평면 전체에서 동일한 배율을 제공합니다.

다음 영상 섹션에서는 샘플 준비 기술에 대해 설명합니다. 이어서 이미징에 사용되는 방법론이 이어집니다. 단층 이미징을 위한 샘플 조직 또는 장기 준비는 비대칭 수축을 방지하는 에탄올 기반의 샘플 탈수 과정에 의존합니다.

이 과정은 완료하는 데 여러 ngày가 소요됩니다. 본 영상에서는 마우스 심장을 준비하지만, 이 프로토콜은 모든 조직이나 장기에 적용할 수 있습니다. 통제된 심근경색을 유도한 동물의 심장을 사용하여 형광 이미징 방법을 시연하겠습니다.

즉, 혈액 공급의 손실로 인해 사전에 뚜렷한 조직 괴사가 유발된 상태입니다. 마우스에는 치유 과정 중의 cathepsin 활성을 보고하는 680 inact 형광 센서가 주입되었습니다. 케타민과 자일라진을 복강 내 주사하여 마우스를 마취시킨 후, 관류 및 심장 적출을 수행합니다. 그다음 응고를 방지하기 위해 헤파린 50 units를 복강 내에 주사합니다.

5분 후, 완전히 마취된 동물에게 종적 개복술을 시행하여 혈액을 제거합니다. 먼저, 좌측 신정맥을 절개합니다. 그런 다음 하대정맥에 생리식염수 20 milliliters를 천천히 주입합니다.

해부 현미경 하에서 모든 혈액을 세척해낸 후, 식염수로 혈액을 대체합니다. 표준 작업 방법에 따라 흉곽을 열고 심장을 적출합니다. 이제 심장을 4°C의 4% PFA에서 8시간 동안 고정합니다.

이 시점부터는 조직에 적용된 형광 대비제나 단백질의 탈색을 방지하기 위해 모든 조직 준비 단계를 암실에서 수행해야 합니다. 고정이 완료되면 PBS로 15분간 헹구어 PFA를 씻어내고, 세척된 심장을 0.8% agarose 풀에 매몰시킵니다. agarose가 건조되면, 조직 주변의 agarose를 잘라내어 블록 형태로 만듭니다.

다음으로, 20% Ethanol에 먼저 담근 후 점진적으로 더 높은 농도의 ethanol을 거쳐 최종적으로 순수 ethanol에 담그는 5단계 시리즈를 통해 aros 암호화된 심장을 탈수합니다. 이러한 탈수 과정은 시료의 비대칭적 수축을 방지하는 데 도움이 됩니다. 희석된 ethanol을 사용하는 처음 4번의 배스(bath) 과정은 1시간 동안 수행해야 하며, 100% Ethanol에서의 마지막 배스 과정은 최소 10시간 동안 수행해야 합니다.

에탄올 처리가 완료되면, 샘플이 투명해질 때까지 Murray's clear solution에 넣어 둡니다. 투명해지는 데 걸리는 시간은 몇 시간에서 며칠까지 다양합니다. 이 투명화 용액은 세포 내 수분을 모사하고 세포막과 굴절률을 일치시켜 조직을 투명하게 만듭니다. 투명화 과정이 끝난 후에도 극미량의 에탄올이 남아 있을 수 있으며, 이는 투명화 용액 내 알코올의 열운동으로 인해 재구성 시 여러 아티팩트를 유발할 수 있습니다.

이러한 문제를 방지하기 위해 두 번째 투명화 사이클을 권장합니다. 이 과정은 4시간 이상 소요되지 않아야 합니다. 완료되면 샘플을 광학 투영할 준비가 됩니다.

컴퓨터를 이용한 단층 촬영입니다. 빛의 산란이 없는 상태에서 광학 흡수 재구성은 일반적인 필터링된 라돈 역투영(filtered radon back projection) 알고리즘을 사용하여 얻을 수 있습니다. 이 과정은 2차원 X선 컴퓨터 단층 촬영과 유사합니다.

투명화 용액이 채워진 투명 이미징 챔버에 에어로졸 블록을 넣습니다. 이제 챔버를 스테이지에 장착하고, 여기 및 투과 측정을 위해 콜리메이트 빔으로 샘플을 조사합니다. 여기 광원의 선택은 선택한 형광 단백질 또는 분자 이미징 대비제에 따라 결정됩니다.

시료의 수직축을 CCD의 픽셀 열과 평행하게 맞추는 것이 편리합니다. 1도 간격으로 360개의 투영 방향으로 시료를 회전시키며, 각 각도에서 흡수 및 형광 파장의 투과 조명 하에 이미지를 획득합니다. 획득 소프트웨어는 기본 광원의 셔터를 자동으로 제어하여 지속적인 조명을 방지하고 시료의 광퇴색을 줄입니다.

흡수 데이터를 통해 3D 재구성물을 생성하기 위해 긴 적분 시간이 필요할 때 셔터의 역할이 특히 중요합니다. 형광 이미지로부터 3D 재구성을 수행하려면 필터링된 라돈 역투영(filtered radon back projection) 알고리즘을 간단히 사용하십시오. 다음 비디오 세그먼트에서 설명할 다른 흡수 기여 요인들도 함께 고려해야 합니다.

흡수 재구성(absorption reconstruction)에 필요한 단계들을 완료한 후, 형광 재구성(fluorescent reconstruction)을 완료하기 위해 몇 가지 단계가 더 필요합니다. 빛 산란이 없는 상태에서 광학 맵을 재구성하는 것은 일반적인 필터링된 라돈 역투영(filtered radon back projection) 알고리즘을 사용하여 수행할 수 있습니다. 이 과정은 2차원 X선 컴퓨터 단층촬영(CT)과 유사합니다.

형광 분포를 재구성할 때, 공간적으로 가변적인 흡수 특성으로 인해 역 라돈 변환(inverse radon)을 이용한 형광 이미지의 역투영(back-projecting) 방식은 부정확해지며, 이는 얻어진 형광 단백질 또는 형광 분자 프로브 분포와 정량 분석 능력에 심각한 영향을 미칩니다. 임의의 광원 위치 Xs에서 방출되는 들뜸 파장 Lambda X의 각 광선은 이미징 대상체를 통과하면서 지수함수적으로 감쇠됩니다.

위치 X에 있는 형광색소를 들뜨게 한 후, 방출 파장의 복사선은 Teleric 이미징 렌즈 시스템을 통해 위치 XD에 있는 CCD 픽셀에 의해 필터링 및 수집됩니다. 방출된 형광은 들뜸 광선과 동일한 경로를 따르지는 않지만, 각 픽셀에 기록된 강도는 해당 들뜸 광선에 대응하는 전체 초점 영역을 따라 들뜬 모든 형광색소의 투영값에 근접합니다. 시스템의 높은 텔레센트릭성(tele centricity) 덕분에, 이미징 대상은 360도 회전되며 CCD 카메라를 통해 들뜸 파장에서의 UX 및 방출 파장에서의 UFL이라는 다중 광원 검출 측정이 수행됩니다.

그 다음, 이들은 두 값의 비율로 정의된 정규화된 보른 필드(born field) UB 하에 결합됩니다. 형광 염료 분포의 재구성은 여기 및 방출 광 전파에 대한 순방향 모델을 작성함으로써 촉진될 수 있으며, 그린 함수(greens function)는 여기 과정을 설명합니다. 광선 전파는 단순한 비어-람베르트 법칙(beer Lambert law)을 따르며, 여기서 moo A는 이전에 결정된 광 흡수 분포입니다.

위치 Xs의 광원에서 방출되어 C.C, D의 위치 XD에 있는 검출기에서 측정된 광강도 UX는 그린 함수(green function)와 시스템에 따라 결정되는 상수 B의 곱으로 나타낼 수 있습니다. 그러면 각 광선 경로를 따른 여기광 강도 GX의 정확한 분포를 계산할 수 있습니다. 광원 Xs에서 방출된 빛에 의해 자극되어 검출기 XD에서 검출된 형광 강도 UFL은 X에서 xd까지의 광선 경로를 따라 여기된 모든 형광체의 기여도를 고려합니다.

영상 문제의 순방향 모델은 ub ub로 작성할 수 있으며, 여기서 alpha는 시스템 의존적인 미지수 상수를 포함합니다. 순방향 모델을 가정된 메쉬 상에서 이산화한 후, 투과 및 형광 신호를 모두 획득하고 기존의 역투영 알고리즘을 사용하여 샘플을 재구성함으로써 형광 색소 분포를 추출하기 위한 역산이 수행됩니다. 여기에서는 투과 및 기존 형광 광학 투영 단층 촬영 재구성 결과가 제시되어 있습니다.

심장의 단일 단면 재구성 영상이 흡수 및 형광 모드 모두에서 나타나 있습니다. 정규화된 본(born) 재구성을 통해 심장 내 염료 분포의 차이를 보여줍니다. 정규화 이후, 광학 투사 단층촬영(optical projection tomography)의 설정 방법과 형광 단층촬영 재구성 시 발생하는 광학 흡수로 인한 아티팩트를 제거하는 방법을 설명해 드렸습니다.

산란광의 영향을 제거하기 위해 샘플을 투명화하는 것이 실제로 매우 중요하지만, 동시에 형광 기여도를 최대한 유지할 수 있도록 투명화 과정의 균형을 맞추는 것 또한 중요합니다. 이 방법을 사용할 때 기억해야 할 또 다른 매우 중요한 사항은 형광 이미지를 흡수 이미지로 나누어 얻는 뼈 정규화 비율(bone normalized ratio)을 계산하는 것입니다. 이것으로 모두 마치겠습니다.

저희의 시각화 실험에 참여해 주셔서 감사드리며, 귀하의 실험에서도 좋은 결과가 있기를 바랍니다.