전체 심장 이미징에 대한 형광 광 프로젝션 Tomography에 대한 출생 정규화
June 2nd, 2009
우리는 정확하고 양적 형광 단층 reconstructions를 얻기 위해 몇 군데 샘플의 흡수 특성에 대한 계정 광학 프로젝션 Tomography 위해 태어난 표준 접근 (BnOPT)를하는 것이 좋습니다. 우리는 작은 동물의 기관 내에있는 형광 분자 프로브 분포를 재구성하기 위해 제안된 알고리즘을 사용합니다.
normalized born optical projection tomography를 수행하기 위해 먼저 샘플을 고정하고 오거 실린더에 내장합니다. 그런 다음 샘플을 수직 축을 따라 회전한 다음 여기 파장으로 균일하게 조명하고 C, CD에 적합한 광학 장치로 투과를 측정합니다. 파장의 형광 신호는 투과 조명 모드에서 측정됩니다.
획득한 형광 및 흡수 이미지는 정규화된 출생 비율을 결정하고 샘플 내 형광 4점의 분포를 재구성하는 데 사용됩니다. 안녕하세요, 제 이름은 Claudia Naone이고 하버드 의과대학 매사추세츠 종합병원의 시스템 생물학 센터에서 일하고 있습니다. 저는 뮌헨 공과 대학과 뮌헨 알 센터의 생물 및 의료 영상 연구소의 Danielle Raki입니다.
저는 지젤 피도입니다. 저는 하버드 의과대학 매사추세츠 종합병원의 C-M-I-C-S-B에서 실험적 su Co의 책임자입니다. 오늘은 광학 프로젝션 단층 촬영을 위한 Born normalized 접근 방식을 사용하여 실시간 생체 외 전체 장기 이미징 절차를 보여드리겠습니다.
우리는 실험실에서 이 절차를 사용하여 중공 기관에서 형광 분자 프로브 분포를 연구합니다. 시작하겠습니다. 이 동영상은 광학 프로젝션 단층 촬영을 사용하여 준비된 조직 또는 장기를 이미지화하는 절차와 함께 제공되는 동영상을 설명합니다.
이 시스템을 사용하여 초파리 발병에 대한 타임 랩스 이미징을 수행하는 방법을 설명합니다. 광학 프로젝션 단층 촬영의 3차원 이미징 기술에는 광학 장치와 회전 스테이지의 고유한 조합이 필요합니다. 비디오의 이 부분에서는 이미징 절차가 설명됩니다.
우선, 기본 광원은 조명 및 흡수 측정을 위한 광원 역할을 하며, 형광 측정을 위한 형광 여기를 제공하기 위해 기본 광원은 먼저 협대역 통과 간섭 필터로 필터링됩니다. 다음으로, 빛은 고정 및 가변 중성 밀도 필터 세트를 통과합니다. 이는 자동 셔터의 존재와 결합되어 샘플의 빛의 양을 제어하고 사진 표백을 방지할 수 있을 만큼 충분히 낮게 유지합니다.
균일한 샘플 조명은 beam expander와 diffuser lens가 결합된 glan telescope lens를 사용하여 달성됩니다. 마지막으로, 광학 협대역 통과 간섭 필터는 여기 소스 광을 광학적으로 정화하는 데 사용됩니다. 샘플은 투명 용액에 담그고 유리관 내에서 이미징을 위해 제자리에 고정됩니다.
샘플은 0.05도의 절대 정확도로 고속 회전 단계를 통해 수직 축을 따라 회전합니다. 세 개의 고유한 수동 컨트롤러를 사용하면 샘플 수직 축을 직교 평면에서 기울이고 조정할 수 있습니다. 흡수 신호는 트랜스 조명에서 획득되며 CCD 카메라에 의해 직접 감지됩니다.
형광 신호는 협대역 통과 간섭 필터를 통해 필터링되고 장역 통과 필터와 결합된 다음 텔레 중심 렌즈로 수집됩니다. 망원 렌즈는 이상적인 고유한 기능을 제공한다는 이점을 제공합니다. 광학 프로젝션 단층 촬영용.
렌즈의 초점에서 lens assembly 내에 위치한 aperture stop의 존재 여부가 중요합니다. 이미지가 광축과 평행하게 이동하도록 보장합니다. 이것은 원근 왜곡을 제거하고 텔레 중심 깊이 내의 많은 초점면에 걸쳐 동일한 배율을 제공합니다.
다음 비디오 세그먼트는 샘플을 준비하는 기술에 대해 설명합니다. 그 다음에는 이미징에 사용되는 방법론이 뒤따를 것입니다. 단층 촬영 이미징을 위한 샘플 조직 또는 장기 준비는 비대칭 수축을 방지하는 샘플의 에탄올 기반 탈수에 의존합니다.
이 프로세스를 완료하는 데 며칠이 걸립니다. 이 비디오에서는 마우스 심장이 준비되었지만 프로토콜은 모든 조직이나 장기에 적용할 수 있습니다. 조절된 경색을 겪은 동물의 심장을 이용한 형광 이미징 방법을 시연할 것입니다.
즉, 혈액 공급의 손실로 인해 사전에 명백한 조직 괴사가 발생하는 것입니다. 마우스는 치유 중 카텝신 활성에 대해 보고하는 6개의 80 비활성 형광 센서 이후 프로를 주입했습니다. 심근은 케타민과 자일라진의 복강 내 주사를 사용하여 관류 및 심장 압출을 위해 마우스를 마취한 다음 응고를 방지하기 위해 복강 내 헤파린 50 단위를 주사합니다.
5분 후, 완전히 마취된 동물에게 종방향 개복술을 시행하여 혈액을 제거합니다. 먼저 왼쪽 신장 정맥을 엽니다. 이제 20ml의 식염수를 하대정맥에 천천히 주입합니다.
식염수는 해부 현미경으로 모든 혈액을 씻어낸 후 혈액을 대체합니다. 표준 수술 방법을 사용하여 흉부를 열고 심장을 제거합니다. 이제 섭씨 4도에서 4% PFA로 8시간 동안 심장을 고정합니다.
이 시점부터는 조직에 적용된 형광 조영제 또는 단백질의 표백을 방지하기 위해 어두운 곳에서 조직 준비 단계를 수행해야 합니다. 고정이 완료되면 PBS에서 15분 동안 헹궈 PFA를 씻어내고 청소된 심장은 0.8% 아로스 풀에 박힙니다. 아로스가 마르면 아가로스를 조직 주위로 잘라내어 블록 모양을 만듭니다.
다음으로, 먼저 20% 에탄올에 담그고, 그 다음에는 점진적으로 더 높은 농도의 에탄올을, 마지막으로 순수 에탄올을 담그는 5단계 시리즈를 통해 aros로 암호화된 심장을 탈수합니다. 이 탈수 절차는 샘플의 비대칭 수축을 방지하는 데 도움이 됩니다. 희석 된 에탄올의 처음 4 회 목욕은 한 시간 동안 수행해야하며 100 % 에탄올의 마지막 목욕은 최소 10 시간 동안 수행해야합니다.
에탄올 처리가 완료되면 샘플이 투명해질 때까지 샘플을 Murray의 투명 용액에 넣으며, 이는 몇 시간에서 며칠까지 다양합니다. 이 세척 용액은 세포의 수분을 모방하고 세포막과 인덱스를 일치시켜 조직을 투명하게 만듭니다. 최소한의 미량의 에탄올은 세척 과정이 끝날 때 존재할 수 있으며, 정화 용액 자체 내 알코올의 열 운동으로 인해 재구성에서 여러 인공물을 발생시킬 수 있습니다.
이 문제를 방지하려면 두 번째 지우기 주기를 사용하는 것이 좋습니다. 이 작업은 4시간 이상 걸리지 않습니다. 완료되면 샘플은 광학 투영을 위한 준비가 된 것입니다.
컴퓨터의 도움으로 단층 촬영. 광 산란이 없는 상태에서 광학 흡수의 재구성은 일반적인 필터링된 라돈 후방 투영 알고리즘을 사용하여 얻을 수 있습니다. 이 프로세스는 2차원 X선 컴퓨터 단층 촬영과 유사합니다.
에어로 블록을 투명화 용액으로 채워진 투명 이미징 챔버에 넣습니다. 이제 챔버를 스테이지에 장착하고 여기 및 투과 측정을 위해 정렬된 빔으로 샘플을 조명합니다. 여기 소스 선택은 선택한 형광 단백질 또는 분자 이미징 조영제를 기반으로 합니다.
샘플의 수직 축을 CCD의 픽셀 열과 평행하게 정렬하는 것이 편리합니다. 1도의 각도 증분을 사용하여 360도 프로젝션 이상으로 샘플을 회전하고, 흡수 파장과 형광 파장 모두에서 트랜스 조명의 각 각도에서 이미지를 획득합니다. 획득을 실행하는 소프트웨어는 기본 광원의 셔터를 자동으로 제어하여 지속적인 조명을 피하고 샘플 사진 표백을 줄입니다.
셔터는 흡수 데이터에서 3D 재구성을 생성하기 위해 긴 통합 시간이 필요한 경우에 특히 중요합니다. 형광 이미지에서 3D 재구성을 위해 필터링된 라돈 후방 투영 알고리즘을 사용하기만 하면 됩니다. 다른 흡수 기여도를 고려해야 하며, 이에 대해서는 다음 비디오 세그먼트에 설명되어 있습니다.
흡수 복원에 필요한 단계를 완료한 후 형광 복원을 완료하기 위한 몇 가지 단계가 더 있습니다. 광 산란이 없는 상태에서 광학 맵의 재구성은 일반적인 필터링된 라돈 후방 투영 알고리즘을 사용하여 얻을 수 있습니다. 이 과정은 2차원 X선 컴퓨터 단층 촬영과 유사합니다.
형광 분포를 재구성하는 경우. 다양한 공간적 의존적 흡수로 인해 역라돈의 사용이 잘못되어 형광 이미지가 투사되어 얻어진 형광 단백질 또는 형광 분자 프로브 분포 및 정량화 능력에 심각한 영향을 미칩니다. 임의의 소스 위치 Xs에서 방출되는 여기 파장 Lambda X의 각 광선은 이미징된 물체를 통과할 때 기하급수적으로 감쇠됩니다.
여기(excitation) 후, X 위치에 위치한 형광 색소, 방출 파장에서의 방사선은 텔레릭 이미징 렌즈 시스템을 사용하여 XD 위치에 위치한 CCD 픽셀에 의해 필터링되고 수집됩니다. 방출된 형광이 여기선과 동일한 경로를 따르지는 않지만, 각 픽셀에서 기록된 강도는 이 특정 여기선에 해당하는 전체 초점 영역을 따라 여기된 모든 형광 색소의 투영에 근접합니다. 시스템의 높은 텔레 중심성으로 인해 이미징된 물체는 360도 회전하고 CCD 카메라로 다중 소스 검출기 측정, 여기 파장의 UX 및 방출 파장의 UFL을 획득합니다.
그런 다음 이들은 둘의 비율로 정의되는 정규화된 출생 필드 UB 아래에서 결합됩니다. 플루오로 크롬 분포의 재구성은 여기(excitation)와 방출광 전파(emission light propagation) 모두에 대한 순방향 모델(forward model)을 작성하여 여기(excitation)를 설명하는 greens 함수를 작성함으로써 촉진할 수 있습니다. 광선 전파는 간단한 맥주 램버트 법칙을 따르며, 여기서 moo A는 이전에 결정된 광학 흡수 분포입니다.
초과 위치의 소스에서 방출되고 C.C, D의 XD 위치에서 감지기에 의해 측정된 광도 UX는 시스템에 의존하는 상수 B를 가진 녹색 함수의 곱으로 작성할 수 있습니다. 그런 다음 각 광선 경로를 따라 여기광 강도 GX의 정확한 분포를 계산할 수 있습니다. 광원 Xs에서 방출된 빛에 의해 자극된 검출기 XD에서 검출된 형광 강도 UFL은 X에서 xd까지의 광선 경로를 따라 여기된 모든 테로스의 기여도를 고려합니다.
그런 다음 이미징 문제의 순방향 모델은 ub ub로 작성할 수 있으며, 여기서 알파는 시스템에 의존하는 알 수 없는 상수를 통합합니다. 그런 다음 가정된 메시에서 순방향 모델을 이산화하고 반전을 수행하여 형광 분포를 추출하고 투과 신호와 형광 신호를 모두 획득하고 기존의 백 프로젝션 알고리즘을 사용하여 샘플을 재구성합니다. 여기에서는 투과 및 기존 형광 광학 프로젝션 단층 촬영 재구성이 표시됩니다.
심장의 단일 평면의 재구성은 흡수와 형광 모두에서 나타납니다. 정상화된 선천적 재구성이 제시되고 심장 내 염료 분포의 차이를 보여줍니다. 정규화 후, 광학 프로젝션 단층 촬영을 설정하는 방법과 형광 단층 촬영을 위한 재구성에서 광학 흡수로 인한 아티팩트를 제거하는 방법을 보여드렸습니다.
실제로 산란광의 기여도를 제거하기 위해 샘플을 투명화하는 것을 염두에 두는 것이 매우 중요하지만, 동시에 형광 기여도를 최대한 유지하기 위해 투명화 과정의 균형을 맞추는 것도 중요합니다. 이 접근 방식을 사용할 때 기억해야 할 또 다른 매우 중요한 사항은 형광 이미지를 흡수 이미지로 나누어 얻은 뼈 정규화 비율을 계산하는 것입니다. 그게 다야.
시각화된 실험에 참여해 주셔서 감사드리며, 여러분의 실험에 행운을 빕니다.
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개요
이 연구는 샘플의 흡수 특성을 고려하여 형광 단층 영상 재구성의 정확도를 향상시키는 광학 투영 단층 영상(BnOPT)을 위한 본 정규화 접근법을 소개합니다. 이 방법은 소형 동물 기관 내 형광 분자 프로브의 분포를 재구성하는 데 적용됩니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 광학 이미징
- 형광 단층 영상
- 생물의학 이미징
배경
- 광학 투영 단층 영상은 생물학적 샘플을 이미징하는 데 사용되는 기술입니다.
- 기존 방법은 흡수 특성을 고려하지 않아 부정확할 수 있습니다.
- 형광 분자 프로브는 생물학적 과정을 시각화하는 데 필수적입니다.
- 재구성 방법을 개선하면 기관 기능의 이해를 향상시킬 수 있습니다.
연구 목적
- 형광 분포를 정확하게 재구성하는 방법을 개발합니다.
- 생물학적 샘플의 흡수 특성을 고려합니다.
- 소형 동물 기관의 이미징 신뢰성을 향상시킵니다.
사용된 방법
- 샘플은 오거의 실린더에 고정되고 내장됩니다.
- 샘플은 회전되고 흥분 파장으로 조명됩니다.
- 형광 신호는 투과 조명 모드로 측정됩니다.
- 재구성을 돕기 위해 정규화된 본 비율이 계산됩니다.
주요 결과
- 제안된 BnOPT 방법은 정확한 형광 재구성을 제공합니다.
- 샘플의 흡수 특성을 효과적으로 고려합니다.
- 이 방법은 소형 동물 기관에서 프로브 분포를 성공적으로 시각화합니다.
- 결과는 전통적인 방법에 비해 개선된 이미징 품질을 보여줍니다.
결론
- BnOPT 접근법은 형광 단층 영상의 정확도를 향상시킵니다.
- 생물학적 샘플을 in vivo로 연구하는 신뢰성 있는 방법을 제공합니다.
- 이 기술은 생물의학 이미징 및 기관 기능 분석 연구를 발전시킬 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Accurate fluorescence quantification in whole-organ imaging is critical for target validation and mechanistic de-risking in early drug discovery. The Born normalized Optical Projection Tomography (BnOPT) method addresses absorption-induced artifacts that compromise fluorescence signal interpretation, thereby improving predictive confidence in probe distribution analysis. This capability supports reliable assessment of therapeutic target engagement and pathway modulation in disease-relevant systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by providing artifact-free fluorescence distributions of molecular probes in intact organs.
- Operational Value: Supports functional target validation through quantitative imaging of probe activity in pathophysiological contexts such as infarction models.
- Predictive Value: Enhances confidence in target modulation readouts by correcting for spatially varying absorption that otherwise distorts quantification.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares cleared, stable biological samples suitable for longitudinal imaging studies requiring reproducible fluorescence readouts.
- Operational Value: Standardizes sample preparation via ethanol dehydration and Murray’s clearing, minimizing asymmetric shrinkage and signal variability.
- Assay Readiness: Generates quantitative absorption and fluorescence datasets enabling normalized ratio calculations essential for reliable signal interpretation.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Facilitates progression from discovery to preclinical validation by maintaining fluorescence signal integrity during extended clearing and imaging sessions.
- Mechanistic De-risking: Reduces false conclusions about probe distribution by accounting for absorption effects that mimic or mask true biological signals.
- Disease Model Fidelity: Applied to infarcted mouse hearts to visualize protease activity probes, supporting target-specific mechanism evaluation in relevant pathophysiology.
Pipeline & Workflow Integration
The BnOPT method integrates into early discovery workflows following target engagement screening, providing quantitative 3D fluorescence maps that inform lead optimization and preclinical candidate selection.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling longitudinal tracking of fluorescent probe distribution in intact organs without signal degradation from absorption artifacts.
- Screening: Delivers assay-ready, cleared tissue samples with standardized preparation protocols ensuring reproducibility across experimental batches.
- Analytics: Outputs normalized born ratios (fluorescence/absorption) that isolate true fluorescence signals from absorption confounders, enabling accurate inter-group comparisons.
- Translational Research: Connects to preclinical studies by preserving fluorescence signal in cleared samples over time, allowing correlation of probe activity with functional outcomes.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform for whole-organ fluorescence quantification applicable across multiple therapeutic areas and target classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Improves predictive confidence in target validation by eliminating absorption-mediated quantification errors in fluorescence tomography.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized clearing (Murray’s solution) and dehydration protocols that minimize sample variability.
- Strategic Value: Enhances go/no-go decision reliability by providing accurate spatial readouts of molecular probe activity in disease-relevant organs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted target prioritization by reducing false-positive or false-negative conclusions from uncorrected imaging data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in optical imaging, sample clearing, and fluorescence quantification to avoid artifacts from residual ethanol or incomplete clearing.
- Dependent on telecentric optical systems, rotation stages with 0.05° accuracy, and synchronized excitation/emission filtering for signal fidelity.
- Necessitates cross-team standardization of clearing duration and ethanol gradients to ensure consistent refractive index matching and fluorescence preservation.
- Adaptation to diverse organ sizes and densities may require adjustments in clearing time and illumination intensity to prevent signal loss or bleaching.
- Practical limitation: prolonged clearing beyond optimal duration risks fluorescence degradation, necessitating timed clearing cycles as described in the protocol.
