다중 구획 CNS 뉴런 - glia 공동 문화 Microfluidic 플랫폼

다구획 미세유체 신경세포 공동 배양 장치 제작은 먼저 밀링 머신을 사용하여 PMMA 블록에 리저버를 정의하는 것으로 시작하며, 이어서 구획들을 연결하는 미세 채널 어레이를 핫 엠보싱으로 형성합니다. PMMA 몰드가 준비되면, PMMA 몰드로부터 PDMS 몰드 마스터를 복제하고 트리클로로에틸렌으로 코팅합니다. 최종 장치는 PDMS 몰드 마스터로부터 복제되어 PDL이 코팅된 배양 플레이트 위에 조립됩니다.

그 다음, E 16에서 18 단계의 1차 쥐 뉴런을 soma 구획에 로딩하고 2주 동안 배양한 후, 공동 배양을 위해 axon ggl 구획 내의 axonal 층 위에 P 1에서 2 단계의 쥐 희소돌기아교세포를 추가합니다. 안녕하세요, Texas A&M University 전기컴퓨터공학과의 Nano Bio Systems Laboratory 소속 J Par입니다. 오늘은 다구획 미세유체 뉴런 공동 배양 플랫폼을 제작하는 절차를 보여드리겠습니다.

본 연구실에서는 인비트로(in vitro) 환경에서 중추신경계 뉴런과 글리아의 상호작용을 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다. 그럼 시작하겠습니다. 이 절차를 시작하려면 마이크로 밀링 머신을 사용하여 3.5 millimeter 깊이의 구획을 만듭니다.

A-P-M-M-A 블록에서 하나의 soma 구획과 6개의 axon ggl 구획을 정의합니다. 구획을 준비한 후, 이소프로판올로 10분 동안 초음파 처리하여 이물질을 제거하고, 일반적인 포토리소그래피 및 습식 식각 공정을 사용하여 유리 슬라이드 위에 마이크로 리지 구조를 제작하며, 유리에서 마이크로 리지 패턴을 핫 엠보싱합니다. PMMA 마스터 위에 슬라이드를 올린 후, PMMA 몰드 마스터와 유리 기판을 수동으로 정렬합니다.

그 다음 핫 프레스를 사용하여 온도를 115 °C까지 올립니다. 설정 온도에 도달하면 0.5 tons의 하중을 5분 동안 가합니다. 5분 후, 40 °C까지 냉각시키고 압력을 해제합니다.

이제 PDMS 마스터 준비를 시작합니다. PDMS 프리폴리머와 경화제를 무게비 10:1로 혼합하고, PMMA 마스터를 50 millimeter × 50 millimeter 크기의 블록으로 자릅니다. 밴드 쏘를 사용하여 PMMA 마스터를 용기에 넣고 그 위에 PDMS 혼합물을 붓습니다. 용기를 진공 펌프 및 DGA가 연결된 데시케이터에 넣고 15분 동안 유지합니다.

PDMS 혼합 과정 중에 발생한 기포를 제거합니다. 모든 기포가 제거되면, 중합을 위해 용기를 수평이 맞춰진 85 °C 오븐에 1시간 동안 넣습니다. PDMS가 완전히 경화되면, PMMA 마스터에서 PDMS 마스터를 떼어냅니다. 트리클로로에틸렌 2~3방울을 넣은 데시케이터 안에 PDMS 마스터를 넣고 15분 동안 진공을 가하여 PDMS 마스터를 증기 코팅합니다.

PDMS 마스터에 코팅을 하면 PDMS 마스터 몰드로부터 최종 PDMS 뉴런 공동 배양 장치를 쉽게 분리할 수 있습니다. 코팅 후, PDMS 마스터를 이소프로필 알코올로 짧게 헹궈 과도한 트리클로로에틸렌을 제거하고 질소 가스로 건조합니다. PDMS 폴리머를 이용한 뉴런 공동 배양 장치 제작 과정은 앞 섹션에서 설명한 PDMS 마스터 몰드 준비 과정과 유사합니다. 먼저 PDMS 프리폴리머와 경화제를 10:1의 중량비로 혼합한 다음, PDMS 혼합물을 PDMS 마스터 위에 붓습니다. 이때 PDMS를 너무 많이 붓지 않아야 마스터의 3.5 mm 높이 PDMS 구조가 완전히 잠기지 않습니다.

진공 펌프가 연결된 데시케이터 내부에서 15분 동안 DGAs를 처리합니다. 모든 기포가 제거되면, PDMS를 수평이 맞추어진 85 °C 오븐에 넣고 1시간 동안 중합시킵니다. 1시간이 지나면 PDMS를 오븐에서 꺼내 실온에서 식힙니다. 그 다음, PDMS 마스터에서 PDMS 뉴런 배양 장치를 조심스럽게 떼어냅니다.

먼지나 이물질로부터 보호하기 위해 PDMS 장치를 파라폼(paraform)으로 감쌉니다. 블레이드가 장착된 드릴 프레스를 사용하여 파라폼으로 감싼 PDMS를 개별 조각으로 절단하여 마무리하면, 뉴런 공배양 PDMS 장치가 세포 배양 플레이트에서 사용될 준비가 거의 완료됩니다. 뉴런 공배양 PDMS 장치를 세포 배양 플레이트에 넣기 전에, 장치를 플라즈마 세척기에 넣고 90초 동안 공기 플라즈마에 노출시켜 표면을 친수성으로 만듭니다.

이 처리는 poly-D-lysine이 코팅된 플레이트에 조립한 후, 배양액이 미세 채널 내부로 잘 채워지도록 돕습니다. 플라스마 처리된 장치를 멸균하려면, 70% ethanol에 30분 동안 담근 후 용기를 멸균 바이오 후드 내부로 옮기십시오. 30분 후, 장치를 꺼내어 0.2 micron millipore 필터로 여과된 질소 가스로 건조시키십시오.

다음으로 건조된 장치를 poly D lysine이 코팅된 폴리스티렌 6웰 배양 플레이트 위에 올리고, 배양 플레이트 표면과 장치의 얼음 사이가 밀착되도록 가볍게 눌러줍니다. 이제 soma 구획에 배양 배지를 채웁니다. 마이크로 채널 내에 기포가 갇혀 있지 않은지 확인하기 위해 1~2분 정도 기다립니다.

그런 다음 6개의 축삭 글리아 구획을 채웁니다. 마지막으로, 가능한 모든 잔해물이나 독성 잔류물을 제거하기 위해 배양액으로 채운 장치를 37 °C 인큐베이터에서 하룻밤 동안 배양합니다. 하룻밤 배양이 끝나면 장치에 세포를 로딩하기 위한 배양 준비를 시작할 수 있습니다.

피펫을 사용하여 Soma 및 Axon 구획에서 배양액을 흡입하여 제거합니다. 그런 다음, 배아 16~18일 된 쥐의 일차 전뇌 뉴런 세포 40 µL를 mm²당 500 cells의 면적 밀도로 마이크로채널 입구 주변의 soma 구획에 로딩합니다. 세포를 로딩하는 동안 PDMS 장치를 건드리지 않는 것이 중요한데, 장치와 세포 배양 플레이트 사이의 밀봉이 깨질 수 있기 때문입니다.

이 현미경 이미지들은 칼슘으로 염색된 신경세포를 보여줍니다. 세포체 구획 내부에서 세포들이 구획 내에 균일하게 로딩되어 있으며 미세유체 채널과 가깝게 위치해 있습니다. 세포가 로딩된 장치를 37 °C 인큐베이터에서 30분 동안 배양하여 기판에 대한 세포 부착을 강화하십시오.

이 배양 단계가 끝나면, 모든 구획을 배양 배지로 채웁니다. 장치 내에서 세포를 37°C의 습윤화된 5% CO2 인큐베이터에서 배양하며, 3~4일마다 배양 배지의 절반만 교체합니다. Axon glia 구획 내에 조밀한 축삭 네트워크가 형성되어야 합니다.

14일간의 배양 후, 체외 primary neurons CLIA 세포에 세포를 로딩하기 전 각 구획의 배양액을 약 60% 흡입하여 제거합니다. oligodendrocyte는 생후 1~2일 된 Sprague Dawley 랫드의 대뇌 반구에서 적출하였습니다. 각 axon glia 구획에 oligodendrocyte 세포 5 µL를 1,000 cells/mm²의 밀도로 첨가합니다. 로딩 중 피펫으로 바닥 기질을 건드리지 않도록 주의해야 하며, 이는 기질에 형성된 axonal network를 손상시킬 수 있기 때문입니다. oligodendrocyte를 첨가한 후, 세포를 37 °C에서 1시간 동안 배양한 다음 구획을 가득 채웁니다.

배양액을 사용하여 CLIA 추가 전과 동일하게 뉴런을 계속 배양하십시오. 포유류 중추신경계의 axon-glia 상호작용을 연구하는 동안 2주 더 매 3~4일마다 배양액의 절반만 교체하십시오. 실험이 적절하게 수행되면, soma 구획에 로딩된 뉴런 세포들이 마이크로채널 입구 근처에 위치하며 axon-glia 구획 내부에 축삭층이 형성되기 시작합니다.

1주일간 배양 후, soma 구획 내부에서 신경세포 응집 징후가 나타나면 희소돌기아교세포를 로딩할 때 세포 상태가 건강하지 않음을 나타내는 지표가 될 수 있습니다. 2주일의 신경세포 배양 후에는 axon ggl 구획이 조밀한 축삭 층으로 덮여 있어야 하며, 그 축삭 층 위에 희소돌기아교세포를 로딩해야 합니다. 지금까지 다구획 신경-교세포 공동 배양 플랫폼을 제작하는 방법과 이를 이용하여 체외에서 중추신경계(CNS) 신경-교세포 상호작용을 연구하는 방법을 살펴보았습니다.

이 절차를 수행할 때, 장치를 먼지로부터 보호하고 에탄올로 너무 오래 멸균하지 않는 것이 중요합니다. 이는 본딩(bonding) 상태가 저하될 수 있기 때문입니다. 이것으로 모든 설명을 마칩니다. 시청해주셔서 감사하며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.