Name: 다중 구획 CNS 뉴런 - glia 공동 문화 Microfluidic 플랫폼 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-10T16:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 24 s
Description: 배우세요 중추신경계 축삭-교세포 상호작용 연구를 위한 다중 구획 미세유체 뉴런 공동 배양 플랫폼 제작법입니다. 쥐 원발 뉴런과 과교세포를 동시에 배양하여 체외에서 신경교 상호작용을 정밀 분석할 수 있습니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 작품은 정신 건강 보건 / 국립 연구소 (NIH / NIMH)의 국립 연구소 # 1R21MH085267을 부여하여 지원했다.

1 부 : 다중 구획을위한 마스터 몰드를 준비 신경 세포 공동 배양 장치 제작 <ol><li> PMMA 마스터를 조작하는 첫 번째 단계는 3.5 mm 깊이 구획을하는 것입니다. 한 소마 구획 여섯 축삭 / glia 구획은 마이크로 밀링 머신 (MDX - 40, 롤랜드 또는 기타 CNC 밀링 머신)을 사용하여 PMMA 블록에 정의됩니다. PMMA 마스터는 다음 파편을 제거하는 10 분 동안 이소 프로필 알코올에 sonicated됩니다. </li><li> 2.5 μm의 하이 리지 구조의 배열은 유리의 서부 유럽 표준시 에칭 다음 표준 석판술 프로세스에 의해 50.8 mm X 50.8 mm 유리 슬라이드에 패턴입니다. 첫째, 리지 구조의 배열 석판술를 사용하여 긍정적인 포토 레지스트 S1818과 함께 청소를 유리 기판에 패턴입니다. S1818은 110을 기반으로 부드러운 기판 (4000 RPM)에 스핀 - 코팅 ° 후 5 분 C 및 40 MF319에 포토 레지스트의 개발하여 다음 마스크 aligner를 사용하여 자외선 (84 MJ / cm 2)에 노출 초. 다음, 포토 레지스트 패턴 유리 기판은 2.5 μm의 톨 리지 구조를 얻기 위해 6-7분 위해 상온에서 산화 에칭 버퍼 (BOE)에 포장되어 있습니다. 마지막으로 포토 레지스트 층 드 이온화 (DI) 물에 rinsing 철저한 다음, 아세톤과 이소 프로필 알코올에 의해 제거됩니다. </li><li> 마이크로 리지 구조와 유리 기판의 패턴을 전송하는 PMMA 마스터에 대한 핫 - 양각입니다. 첫째, PMMA의 금형 마스터와 유리 기판은 수동 정렬 및 핫 언론에 게재됩니다. 그러면, 온도가 115로 올랐을 ° C. 일단 원하는 온도 중량 0.5 톤 5 분 적용, 도달합니다. 5 분 후에, 온도는 40 ° C와 압력이 릴리스로 냉각합니다. PMMA 마스터는 다음 50.8 mm X 50.8 mm 크기의 블록으로 절단됩니다. </li><li> 무게 : 1 PDMS 사전 중합체 (Sylgard 184은) 10의 비율로 치료 요원과 함께 혼합됩니다. </li><li> PMMA 마스터는 캐스크와 PDMS 혼합물은 PDMS 마스터를 조작하는 PMMA 마스터 위에 부어 안에 있습니다. 그것은 다음 진공 펌프에 연결된 건조기에 배치됩니다. PDMS 다음 PDMS 믹싱 과정에서 발생하는 거품을 제거하는 15 분 동안 degassed입니다 PMMA 마스터 위에 부어. </li><li> 모든 거품을 제거하는 경우, PDMS는 중합 한 시간 동안 뻗었 85 ° C 오븐 안에 넣어 수 있습니다. </li><li> 일단 PDMS이 완전히 치료되어 PDMS 마스터는 PMMA 마스터에서 출발 벗겨 trichlorosilane로부터 2-3 방울과 건조기 안에와 수증기 코팅 15 분 PDMS 마스터 표면을 위해 진공 청소기로 청소를합니다. Trichlorosilane 코팅은 PDMS 마스터에서 최종 PDMS 신경 세포 공동 배양 장치의 릴리스를 용이하게합니다. 코팅 후, PDMS 마스터는 간단히 과도한 trichlorosilane을 제거하는 이소 프로필 알코올로 씻어서이며, N 2 가스로 건조. </li></ol> 2 부 : 뉴런 문화 장치 복제 <ol><li> 무게 : 1 PDMS 사전 중합체 (Sylgard 184은) 10의 비율로 치료 요원과 함께 혼합됩니다. </li><li> PDMS 혼합물의 PDMS 마스터 위에 붓고 15 분 동안 진공 펌프에 연결된 건조기 내부 degassed입니다. 이것은 마스터에서 3.5 mm 높은 PDMS의 구조가 완전히 잠겨되지 않도록 너무 PDMS 잔하지 않는 것이 중요합니다. </li><li> 모든 거품을 제거하는 경우, PDMS는 중합 한 시간 동안 뻗었 85 ° C 오븐 안에 넣어 수 있습니다. </li><li> PDMS 한 시간 후 오븐에서 제거하고 진정 실온에서 왼쪽입니다. 그런 다음, PDMS 뉴런 문화 장치 부드럽게 PDMS 마스터에서 해제 벗겨 수 있습니다. PDMS 장치 해제 벗겨 먼지 또는 파편으로부터 그들을 보호하기 위해 parafilm으로 싸여있다. </li><li> parafilm과 포장 PDMS 기기, 블레이드 장착된 드릴 프레스를 사용하여 개별 조각으로 절단됩니다. </li></ol> 제 3 부 : 장치 조립 <ol><li> PDMS 뉴런 문화 장치는 플라즈마 청소기 내부 배치와 PDMS 장치의 표면이 친수성 ​​만들어 90 초 동안 공기 플라즈마에 노출됩니다. 이 플라즈마 처리는 폴리 - D - 라이신 코팅 기판에 조립 후 문화 매체와 기입에 microchannels를 촉진합니다. </li><li> 플라즈마로 처리 장치는 다음 살균을 위해 30 분 동안 70 %의 에탄올에 열중하고 소독 바이오 후드 안쪽 이동됩니다. </li><li> 멸균 장치는 70 % 에탄올에서 제거하고 Millipore 여과 N 2 가스로 건조됩니다. 말린 디바이스는 6 잘 문화 플레이트와 부드러운 압력이 기판과 장치 사이의 밀봉을 보장하기 위해 적용되는 폴리 - D - 라이신 코팅 폴리스티렌 상단에 표시됩니다. </li><li> 문화 미디어 다음 여섯 축삭 / glia 구획을 작성하여 다음, 소마 짐칸에 가득 차 있습니다. 이것은 거품이 microchannels 내에 갇혀되지 않습니다 않도록 소마의 구획으로 문화 미디어를 삽입한 후 축삭 / glia 구획을 작성하기 전에 1~2분에게 주저하는 것이 좋습니다. </li><li> 문화 미디어로 가득 장치는 37 가능한 모든 이물질이나 독성 잔류물을 씻어하기 ° C 배양기 안에서 하룻밤 incubated입니다. </li></ol> 4 부: 셀 로딩 및 신경 세포 - oligodendrocyte 공동 문화 <ol><li> 세포 배양의 첫 날, 배아 날부터 기본 forebrain의 신경 세포는 16-18 쥐 500 세포 / mm 2 면적 밀도에서 소마 짐칸에로드됩니다. 첫째, 소마 구획 및 축삭 / glia 구획 모두 내부 문화 미디어는 이전의 셀 로딩에 피펫을 사용하여 aspirated 있습니다. 그런 다음, 문화 미디어 40 μl에 희석 38,500 전지는, microchannel 인레츠 주변의 소마 구획에로드됩니다. 그것은 장치와 기판 사이의 봉인을 깰 수 있기 때문에 그것은 세포를 로딩하는 동안 PDMS 장치를 만지지 않는 것이 중요합니다. </li><li> 기판에 세포 부착을 향상시키기 위해 37 ° C 배양기 안에서 30 분 동안 셀 로드된 장치를 품어. 부화 후, 모든 구획은 문화 미디어로 가득 차 있습니다. </li><li> 전지는 37 양식 아르 ° humidified 5% CO 2 배양기에서 C 및 문화 매체의 절반 밖에이 모든 3~4일 밖으로 변경됩니다. </li><li> 체외에서 신경 세포 문화 날로부터 14 일 후, oligodendrocytes가 공동 문화 축삭 / glia 구획에 추가됩니다. 출생 후의 일 1-2에서 스프 라그 - 돌리 쥐의 대뇌 반구의 해부 Oligodendrocytes은 1000 셀 / mm 2 면적 밀도 각 축삭 / glia 구획에 추가됩니다. 이전 로딩 세포로 구획 내부 문화 미디어의 약 60 %는 피펫과 aspirated 있습니다. 이 기판에 형성 axonal 네트워크를 손상 수 있기 때문에주의가 바닥 기판을 만지지 않도록하셔야합니다. 그런 다음, 문화 미디어 5 μl에 희석 6,700 oligodendrocyte 세포, 축삭 / glia 구획에 추가됩니다. 세포는 1 시간 동안 incubated하고 구획은 문화 미디어로 가득 차 있습니다. </li><li> 전지는 37 양식 아르 ° humidified 5% CO 2 인큐베이터에만 문화 미디어의 절반이 두 주 동안 매일 3-4일 밖 변경에 C. </li></ol> 제 5 부 : 대표 결과 : 실험이 제대로 수행되면 소마 구획에 로드된 신경 세포는 문화의 일주 후 축삭 / glia 구획 내부 형태로 시작 가까운 microchannel 인레츠 및 axonal 레이어 찾을 수 없습니다. 소마 구획 내부에 신경 세포의 집합의 로그인 세포가 건강하지 않는 표시하실 수 있습니다. 신경 세포 문화의 2 주 후에 oligodendrocytes를 로드할 때, 축삭 / glia 구획을 axons와 oligodendrocytes의 밀도 층으로 덮여 있어야이 axonal 레이어 위에 적재해야합니다. <img src="/files/ftp_upload/1399/1399fig1tmb.jpg" border="0" alt="그림 1" /> 그림 1. 높은 처리량 microfluidic 다중 구획 CNS 신경 공동 문화 플랫폼의 도식 그림. 소마의 연결 및 dendrites뿐만 아니라 분 유체 수준의 차이와 구획 사이의 유체 고립에서 axons의 고립을 보여주는 교차 단면 볼 수 있습니다. 하시기 바랍니다 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1399/1399fig1.jpg">여기를 클릭</a> 그림 1의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/1399/1399fig2tmb.jpg" border="0" alt="그림 2" /> 그림 2. 제작 및 다중 구획을 위해 조립 단계 PDMS microfluidic 공동 문화 장치. 각 장치는 종래의 6 자 폴리스티렌 세포 배양 접시 하나에 잘 맞는 데요. 하시기 바랍니다 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1399/1399fig2.jpg">여기를 클릭</a> 그림 2의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.

<ol><li>Sherman, D. L., Brophy, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+axon+ensheathment+and+myelin+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of axon ensheathment and myelin growth.</a> Nature Reviews. 6, 683-690 (2005).</li>
<li>Xia, Y., Whitesides, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+Lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem%22%5BJournal%5D)">Soft Lithography.</a> Angew. Chem. 37, 550-575 (1998).</li>
<li>Taylor, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+culture+platform+for+neuroscience+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Microfluidic culture platform for neuroscience research.</a> Nature Methods. 2, 599-605 (2005).</li>
<li>Li, J., Baud, O., Vartanian, T., Volpe, J. J., Rosenberg, P. A., A, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peroxynitrite+generated+by+inducible+nitric+oxide+synthase+and+NADPH+oxidase+mediates+microglial+toxicity+to+oligodendrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Peroxynitrite generated by inducible nitric oxide synthase and NADPH oxidase mediates microglial toxicity to oligodendrocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 102, 9936-9941 (2005).</li>
</ol>

저자들은 공개할 이해관계가 없음을 밝힙니다.

우리는 포유 동물 CNS 축삭 - glia 상호 작용을 연구를위한 다중 구획 공동 문화 플랫폼을 개발했습니다. CNS의 axons가 성공적으로 세포의 연결 기관 / dendrites과 격리되어 있었고, oligodendrocytes가 성공적으로 장치 내부에 공동 교양되었습니다. 신경 세포 밀도는 애플 리케이션에 의해 변경될 수 있지만, 너무 낮게 또는 너무 높은 농도는 세포가 죽는 원인이 될 수 있습니다. 또한, 기판의 셀 또는 axonal 레이어가 손상되지 않도록 문화 미디어의 절반 밖에를 변경하는 것이 중요합니다. 우리는이 시스템 CNS 축삭 - glia은 체외에서 네트워크 신호를 공부를위한 강력한 도구와 myelination와 myelin 복구를 촉진 심사 성장 요인 또는 잠재 약물 후보에 대한 높은 처리량 플랫폼을위한 경로를 제공하는 것으로 기대합니다.

다중 구획 cns 뉴런 - glia 공동 문화 microfluidic 플랫폼

A Multi-compartment CNS Neuron-glia Co-culture Microfluidic Platform

우리는 더 높은 처리량을위한 병렬 여섯 독립적인 실험까지 수행 능력이 체외의 CNS에서 축삭 - glia 상호 작용 연구를위한 새로운 다중 구획 신경 공동 문화 microsystem 플랫폼을 제시한다. 우리는 좋은 repeatability와 대량 제조를 가능하게 한 부드러운 리소그래피 프로세스를 통해 동일한 장치 내에서 마이크로 및 매크로 모두 규모 구조를 가지고 microfluidic 장치를 만들 수있는 새로운 제조 방법을 개발했습니다. 다중 구획 microfluidic 공동 문화 플랫폼 oligodendrocytes (OLs)의 뉴런 여섯 축삭 / glia 구획 하나의 소마 구획으로 구성되어 있습니다. 소마 구획 및 축삭 / glia 구획은의 배열에 의해 연결되어 있습니다 축삭 -지도 microchannels 그 axons은 축삭 / glia의 구획으로 성장할 수 있도록하면서 물리적 장벽이 소마 구획에의 연결 소마 범위를 제한하는 등 기능을 수행합니다. 축삭 / glia 구획에 로드된 OLs은화된 축삭 - glia 상호 작용 연구를 활성화, axons과 함께하지만 소마의 연결 또는 dendrites에만 연계해서 실행할 수 있습니다. microchannels은 또한 6 독립적인 실험이 더 높은 처리량을위한 단일 장치에서 실시 수 있도록, 구획 사이에 유체 절연을 활성화. 폴리 (dimethylsiloxane) (PDMS)을 사용하여 소프트 리소그래피는 생물 의학 microdevices에서 일반적으로 사용되는 기법입니다. 이러한 장치에 대한 저수지는 일반적으로 수동 펀칭에 의해 정의됩니다. 간단 가난한 정렬 및 프로세스의 시간이 소요되는 자연은 저수지 많은 수의 반복 작성해야 할 때이 과정이 적합하지합니다. 있지만 새로 개발된 방법은 이러한 한계를 극복, 저수지의 수동 펀칭을 필요로하지 않았다. 첫 번째, 일곱 저수지 (깊이 : 3.5 mm)는 마이크로 밀링 머신을 사용하여 폴리 (메틸 메타 크릴 레이트) (PMMA) 블록에되었다. 그런 다음, 유리 기판에 대한 조작 리지 microstructures의 배열은, 소마와 축삭 / glia 구획을 연결 microchannels을 정의하는 PMMA 블록에 대한 핫 - 양각되었다. 이 프로세스는 하나의 PMMA 마스터 내에서 일치하는 매크로 규모의 저수지 (3.5 ㎜)와 마이크로 규모의 채널 (2.5 μm의) 결과. 금형 마스터 역할을 PDMS 복제는 소프트 리소그래피와 최종 PDMS 장치가이 마스터에서 복제되었다를 사용하여 얻은 것입니다. E16 - 18 쥐의 기본 뉴런은 소마의 구획을 읽어 두 주 동안 교양되었습니다. 세포 배양 후 일주일 후, axons가 microchannels를 건너와 축삭 / glia 구획 안에 axonal는 네트워크 계층을 형성했다. Axons은 P1 - 2 쥐 6 축삭 / glia 구획 및 OLs에 걸쳐 균일하게 성장은 공동 문화 체외에 14 일 동안 축삭 / glia 구획에 추가되었습니다.

우리는 시험 관내 CNS 축삭 - glia의 상호 작용 연구를위한 새로운 다중 구획 신경 공동 문화 microsystem 플랫폼을 개발했습니다. 플랫폼은 병렬 여섯 독립적인 실험까지 실시 수 있으며, 새로 개발된 마이크로 / 매크로 하이브리드 제조 방법을 사용하여 가공했습니다.

다중 구획 CNS 뉴런 - glia 공동 문화 Microfluidic 플랫폼

우리는 최대 ...까지 수행 가능한, 인비트로(in vitro) 중추신경계(CNS) 축삭-글리아 상호작용 연구를 위한 새로운 다구획 뉴런 공동 배양 마이크로시스템 플랫폼을 제시합니다.

다구획 미세유체 신경세포 공동 배양 장치 제작은 먼저 밀링 머신을 사용하여 PMMA 블록에 리저버를 정의하는 것으로 시작하며, 이어서 구획들을 연결하는 미세 채널 어레이를 핫 엠보싱으로 형성합니다. PMMA 몰드가 준비되면, PMMA 몰드로부터 PDMS 몰드 마스터를 복제하고 트리클로로에틸렌으로 코팅합니다. 최종 장치는 PDMS 몰드 마스터로부터 복제되어 PDL이 코팅된 배양 플레이트 위에 조립됩니다.그 다음, E 16에서 18 단계의 1차 쥐 뉴런을 soma 구획에 로딩하고 2주 동안 배양한 후, 공동 배양을 위해 axon ggl 구획 내의 axonal 층 위에 P 1에서 2 단계의 쥐 희소돌기아교세포를 추가합니다. 안녕하세요, Texas A&M University 전기컴퓨터공학과의 Nano Bio Systems Laboratory 소속 J Par입니다. 오늘은 다구획 미세유체 뉴런 공동 배양 플랫폼을 제작하는 절차를 보여드리겠습니다.본 연구실에서는 인비트로(in vitro) 환경에서 중추신경계 뉴런과 글리아의 상호작용을 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다. 그럼 시작하겠습니다. 이 절차를 시작하려면 마이크로 밀링 머신을 사용하여 3.5 millimeter 깊이의 구획을 만듭니다.A-P-M-M-A 블록에서 하나의 soma 구획과 6개의 axon ggl 구획을 정의합니다. 구획을 준비한 후, 이소프로판올로 10분 동안 초음파 처리하여 이물질을 제거하고, 일반적인 포토리소그래피 및 습식 식각 공정을 사용하여 유리 슬라이드 위에 마이크로 리지 구조를 제작하며, 유리에서 마이크로 리지 패턴을 핫 엠보싱합니다. PMMA 마스터 위에 슬라이드를 올린 후, PMMA 몰드 마스터와 유리 기판을 수동으로 정렬합니다.그 다음 핫 프레스를 사용하여 온도를 115 °C까지 올립니다. 설정 온도에 도달하면 0.5 tons의 하중을 5분 동안 가합니다. 5분 후, 40 °C까지 냉각시키고 압력을 해제합니다.이제 PDMS 마스터 준비를 시작합니다. PDMS 프리폴리머와 경화제를 무게비 10:1로 혼합하고, PMMA 마스터를 50 millimeter × 50 millimeter 크기의 블록으로 자릅니다. 밴드 쏘를 사용하여 PMMA 마스터를 용기에 넣고 그 위에 PDMS 혼합물을 붓습니다. 용기를 진공 펌프 및 DGA가 연결된 데시케이터에 넣고 15분 동안 유지합니다.PDMS 혼합 과정 중에 발생한 기포를 제거합니다. 모든 기포가 제거되면, 중합을 위해 용기를 수평이 맞춰진 85 °C 오븐에 1시간 동안 넣습니다. PDMS가 완전히 경화되면, PMMA 마스터에서 PDMS 마스터를 떼어냅니다. 트리클로로에틸렌 2~3방울을 넣은 데시케이터 안에 PDMS 마스터를 넣고 15분 동안 진공을 가하여 PDMS 마스터를 증기 코팅합니다.PDMS 마스터에 코팅을 하면 PDMS 마스터 몰드로부터 최종 PDMS 뉴런 공동 배양 장치를 쉽게 분리할 수 있습니다. 코팅 후, PDMS 마스터를 이소프로필 알코올로 짧게 헹궈 과도한 트리클로로에틸렌을 제거하고 질소 가스로 건조합니다. PDMS 폴리머를 이용한 뉴런 공동 배양 장치 제작 과정은 앞 섹션에서 설명한 PDMS 마스터 몰드 준비 과정과 유사합니다. 먼저 PDMS 프리폴리머와 경화제를 10:1의 중량비로 혼합한 다음, PDMS 혼합물을 PDMS 마스터 위에 붓습니다. 이때 PDMS를 너무 많이 붓지 않아야 마스터의 3.5 mm 높이 PDMS 구조가 완전히 잠기지 않습니다.진공 펌프가 연결된 데시케이터 내부에서 15분 동안 DGAs를 처리합니다. 모든 기포가 제거되면, PDMS를 수평이 맞추어진 85 °C 오븐에 넣고 1시간 동안 중합시킵니다. 1시간이 지나면 PDMS를 오븐에서 꺼내 실온에서 식힙니다. 그 다음, PDMS 마스터에서 PDMS 뉴런 배양 장치를 조심스럽게 떼어냅니다.먼지나 이물질로부터 보호하기 위해 PDMS 장치를 파라폼(paraform)으로 감쌉니다. 블레이드가 장착된 드릴 프레스를 사용하여 파라폼으로 감싼 PDMS를 개별 조각으로 절단하여 마무리하면, 뉴런 공배양 PDMS 장치가 세포 배양 플레이트에서 사용될 준비가 거의 완료됩니다. 뉴런 공배양 PDMS 장치를 세포 배양 플레이트에 넣기 전에, 장치를 플라즈마 세척기에 넣고 90초 동안 공기 플라즈마에 노출시켜 표면을 친수성으로 만듭니다.이 처리는 poly-D-lysine이 코팅된 플레이트에 조립한 후, 배양액이 미세 채널 내부로 잘 채워지도록 돕습니다. 플라스마 처리된 장치를 멸균하려면, 70% ethanol에 30분 동안 담근 후 용기를 멸균 바이오 후드 내부로 옮기십시오. 30분 후, 장치를 꺼내어 0.2 micron millipore 필터로 여과된 질소 가스로 건조시키십시오.다음으로 건조된 장치를 poly D lysine이 코팅된 폴리스티렌 6웰 배양 플레이트 위에 올리고, 배양 플레이트 표면과 장치의 얼음 사이가 밀착되도록 가볍게 눌러줍니다. 이제 soma 구획에 배양 배지를 채웁니다. 마이크로 채널 내에 기포가 갇혀 있지 않은지 확인하기 위해 1~2분 정도 기다립니다.그런 다음 6개의 축삭 글리아 구획을 채웁니다. 마지막으로, 가능한 모든 잔해물이나 독성 잔류물을 제거하기 위해 배양액으로 채운 장치를 37 °C 인큐베이터에서 하룻밤 동안 배양합니다. 하룻밤 배양이 끝나면 장치에 세포를 로딩하기 위한 배양 준비를 시작할 수 있습니다.피펫을 사용하여 Soma 및 Axon 구획에서 배양액을 흡입하여 제거합니다. 그런 다음, 배아 16~18일 된 쥐의 일차 전뇌 뉴런 세포 40 µL를 mm²당 500 cells의 면적 밀도로 마이크로채널 입구 주변의 soma 구획에 로딩합니다. 세포를 로딩하는 동안 PDMS 장치를 건드리지 않는 것이 중요한데, 장치와 세포 배양 플레이트 사이의 밀봉이 깨질 수 있기 때문입니다.이 현미경 이미지들은 칼슘으로 염색된 신경세포를 보여줍니다. 세포체 구획 내부에서 세포들이 구획 내에 균일하게 로딩되어 있으며 미세유체 채널과 가깝게 위치해 있습니다. 세포가 로딩된 장치를 37 °C 인큐베이터에서 30분 동안 배양하여 기판에 대한 세포 부착을 강화하십시오.이 배양 단계가 끝나면, 모든 구획을 배양 배지로 채웁니다. 장치 내에서 세포를 37°C의 습윤화된 5% CO2 인큐베이터에서 배양하며, 3~4일마다 배양 배지의 절반만 교체합니다. Axon glia 구획 내에 조밀한 축삭 네트워크가 형성되어야 합니다.14일간의 배양 후, 체외 primary neurons CLIA 세포에 세포를 로딩하기 전 각 구획의 배양액을 약 60% 흡입하여 제거합니다. oligodendrocyte는 생후 1~2일 된 Sprague Dawley 랫드의 대뇌 반구에서 적출하였습니다. 각 axon glia 구획에 oligodendrocyte 세포 5 µL를 1,000 cells/mm²의 밀도로 첨가합니다. 로딩 중 피펫으로 바닥 기질을 건드리지 않도록 주의해야 하며, 이는 기질에 형성된 axonal network를 손상시킬 수 있기 때문입니다. oligodendrocyte를 첨가한 후, 세포를 37 °C에서 1시간 동안 배양한 다음 구획을 가득 채웁니다.배양액을 사용하여 CLIA 추가 전과 동일하게 뉴런을 계속 배양하십시오. 포유류 중추신경계의 axon-glia 상호작용을 연구하는 동안 2주 더 매 3~4일마다 배양액의 절반만 교체하십시오. 실험이 적절하게 수행되면, soma 구획에 로딩된 뉴런 세포들이 마이크로채널 입구 근처에 위치하며 axon-glia 구획 내부에 축삭층이 형성되기 시작합니다.1주일간 배양 후, soma 구획 내부에서 신경세포 응집 징후가 나타나면 희소돌기아교세포를 로딩할 때 세포 상태가 건강하지 않음을 나타내는 지표가 될 수 있습니다. 2주일의 신경세포 배양 후에는 axon ggl 구획이 조밀한 축삭 층으로 덮여 있어야 하며, 그 축삭 층 위에 희소돌기아교세포를 로딩해야 합니다. 지금까지 다구획 신경-교세포 공동 배양 플랫폼을 제작하는 방법과 이를 이용하여 체외에서 중추신경계(CNS) 신경-교세포 상호작용을 연구하는 방법을 살펴보았습니다.이 절차를 수행할 때, 장치를 먼지로부터 보호하고 에탄올로 너무 오래 멸균하지 않는 것이 중요합니다. 이는 본딩(bonding) 상태가 저하될 수 있기 때문입니다. 이것으로 모든 설명을 마칩니다. 시청해주셔서 감사하며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

a-multi-compartment-cns-neuron-glia-co-culture-microfluidic-platform

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 비디오에서 우리는 culturing의 뉴런에 microfluidic 장치를 farbricate을 사용 polydimethyl 실록산 (PDMS)과 소프트 리소그래피의 기술을 보여줍니다.

신경 소마와 Axons의 Compartmentalization위한 Microfluidic 장치의 제작

이 비디오에서는 E18 두피 랫 뉴런의 준비를 보여줍니다.

Microfluidic 장치에서 Compartmentalization에 대한 E18 두피 랫 뉴런 준비

BioMEMS : 생물학 자와 엔지니어 사이에 새로운 협력 단조

이 연구는 소설 neuronal 축삭과 (천체) glia 공동 문화 플랫폼을 설정하는 절차를 설명합니다. 이 공동 문화 시스템에서 하나의 축삭 (및 단일 glial 세포) 사이의 직접 상호 작용 조작은 glial 신호에 대한 상호 신경 세포의 기계론의 분석을 수 있도록 가능한된다.

마이크로 유체 문화 플랫폼에 Glia 상호 작용 (MCP) 기반 Neuronal 축삭과 Glia 공동 문화 시스템에 신경의 영상 분석

이 비디오는 1차 쥐 해마 뉴런의 구획화된 배양을 위해 사전 조립된 플라스틱 미세유체 칩의 활용을 보여줍니다. 뉴런은 미세유체 구획 중 하나에 도금되어 부착되고 성장하여 칩의 미세 홈을 통해 축삭을 인접한 구획으로 확장합니다. 좁은 미세홈은 신경 세포체가 들어가는 것을 방지하여 체세포와 축삭 구획 사이의 물리적 분리를 가능하게 합니다.

Plastic Microfluidic Chips를 사용한 분류된 1차 쥐 뉴런 배양

이 비디오는 다전극 어레이가 있는 미세유체 장치를 사용하여 hiPSC 유래 피질 글루타메이터 뉴런과 신경교종 세포의 공동 배양에서 뉴런 전기 활동을 평가하는 방법을 보여줍니다.

공동 배양에서 글루타메이트성 뉴런과 신경교종 세포 상호작용 평가

하나의 신경 세포의 미세 유체의으로 배열 및 생체 적합 물질 코팅의 칩 플라즈마 패턴 물 마스킹을위한 프로토콜을 설명합니다. 고도로 상호 공동 배양은 최소 셀 입력을 사용하여 제조 될 수있다.

단일 셀의 정밀도와의 연결을 공동 문화의 준비

이 프로토콜 문화 분류 기본 murine 뉴런을 플라스틱 칩의 사용을 설명 합니다. 이 칩은 소, 사용자 친화적인, 고해상도와 호환, 라이브, 그리고 형광 영상. 이 프로토콜에서는 이러한 칩 내 쥐 hippocampal 신경 격판덮개 유체 절연, axotomy 및 immunostaining을 수행 하는 방법을 설명 합니다.

Compartmentalizing 기본 Murine 뉴런에 대 한 조립된 플라스틱 미세 칩의 사용

이 프로토콜은 인간 줄기 세포로부터 분화된 배양 뉴런에 순환 올레핀 공중합체로 성형된 구획화된 미세 유체 칩의 사용을 입증한다. 이 칩은 기존의 구획 형 폴리 (디메틸 실록산) 장치보다 사전 조립되고 사용하기 쉽습니다. 바이러스성 표지, 유동성 격리, 축사 절제술 및 면역 염색을 포함하여 다중 일반적인 실험 패러다임은 여기에서 기술됩니다.

사전 조립된 플라스틱 미세유체 칩 내에서 인간 줄기 세포 유래 뉴런의 구획화

이 프로토콜은 배아 15-16일에 마우스 배아에서 분리한 일차 신경 세포와 출생 후 1-2일에 신생아 마우스의 뇌에서 생성된 일차 미세아교세포에서 확립된 미세아교세포-뉴런 공동 배양을 설명합니다.

Generating and Co-culturing Murine Primary Microglia and Cortical Neurons

이 프로토콜은 축삭 손상 후 신경 대사 역학을 모델링하는 미세유체 시스템을 설명하여 내재 대사 리모델링의 이미징, 다중 오믹스 분석 및 기계론적 연구를 가능하게 합니다.

축삭 손상 모델 구성 및 다중 오믹스 분석 가능을 위한 미세유체 칩

배우세요 중추신경계 축삭-교세포 상호작용 연구를 위한 다중 구획 미세유체 뉴런 공동 배양 플랫폼 제작법입니다. 쥐 원발 뉴런과 과교세포를 동시에 배양하여 체외에서 신경교 상호작용을 정밀 분석할 수 있습니다.

다중 구획 CNS 뉴런 - glia 공동 문화 Microfluidic 플랫폼

더 많은 동영상 탐색