Name: 효모 세포 Mitochondria의 정화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-24T16:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: 배우세요 효모 Saccharomyces cerevisiae에서 미토콘드리아를 정화하는 효과적인 방법을. 세포벽 소화, 유리 테플론 균질화, 연속 원심분리 및 자당 농도 구배 원심분리를 통해 고순도 미토콘드리아를 분리합니다.

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이 작품은 CIHR과 캐나다의 NSERC에서 보조금에 의해 지원되었다. VIT는 CIHR 새로운 인베스티게이터와 게놈의 콩코디아 대학 연​​구 위원장, 세포 생물학 및 노화입니다.

재료 및 방법 효모 변종과 성장 조건 야생 형 변형 BY4742는 (MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0) (1 % 효모 추출물, 펩톤 2 %, 2 % 포도당) 풍부한 YEPD 매체에서 재배되었다. 전지는 30 ° C 회전이 5시 1분의 &quot;플라스크 볼륨 / 볼륨 매체&quot;비율 Erlenmeyer flasks의 200 rpm으로 잡고 교양되었습니다. 원유 mitochondrial 분획의 분리 <ol><li> 48 H.위한 야생 형 스트레인 BY4742 문화 1 L 그로 </li><li> 500 ML Nalgene의 원심 분리기 튜브의 문화를 하거라. 상온에서 3,000 XG에서 5 분 원심 분리하여 부하와 수확 세포를 균형. </li><li> dH2O 250 ML에 가만히 따르다 뜨는 및 resuspend pelleted 세포. 상온에서 3,000 XG에서 5 분 원심 분리하여 세포 펠렛. </li><li> dH2O 250 ML에 가만히 따르다 뜨는 및 resuspend pelleted 세포. 상온에서 3,000 XG에서 5 분 원심 분리하여 세포 펠렛. </li><li> 세포 펠렛의 서부 유럽 표준시 무게를 결정합니다. </li><li> DTT 버퍼 [버퍼 / G (서부 유럽 표준시 무게) 전지 2 ML]에서 pelleted 세포를 Resuspend. </li><li> 50 ML 팰컨 플라스틱 튜브에 세포 현탁액을 전송합니다. </li><li> 30 ° C. 20 분 쉐이크 70 RPM에서 튜브를 회전 </li><li> 상온에서 3,000 XG에서 5 분 원심 분리하여 세포를 수확. </li><li> Zymolyase [버퍼 / G (서부 유럽 표준시 무게) 전지 7 ML]없이 Zymolyase 버퍼에 pelleted 세포를 Resuspend. </li><li> 상온에서 3,000 XG에서 5 분 원심 분리하여 세포 펠렛. </li><li> Zymolyase [버퍼 / G (서부 유럽 표준시 무게) 전지 7 ML]없이 Zymolyase 버퍼에 pelleted 세포를 Resuspend. </li><li> 유리 플라스크에 세포 현탁액을 전송합니다. </li><li> Zymolyase - 100T의 분말을 추가 [1 Zymolyase - 100T / G (서부 유럽 표준시 무게) 세포의 MG] 세포 현탁액 수 있습니다. </li><li> 30 ° C. 30 분 쉐이크 70 rpm으로 세포 현탁액으로 술병 회전 </li><li> 전송 spheroplasts 인해 Zymolyase - 100T 50 - ML의 플라스틱 원심 분리기 튜브와 세포 벽의 소화에 형성했다. </li><li> 펠렛 4 2,200 XG 8 분 원심 분리하여 spheroplasts ° C. </li></ol> ** 모든 후속 단계 ° C 또는 얼음 4 시에 실시한다. spheroplasts의 Suspensions는 부드럽게 organelles을 위반하지 않도록 컷 팁을 pipettes를 사용하여 처리되어야합니다 .** <ol start="18"><li> 얼음처럼 차가운 균질화 버퍼 [버퍼 / G (서부 유럽 표준시 무게) 세포의 6.5 ML]에서 pelleted spheroplasts을 Resuspend. </li><li> 펠렛 4 2,200 XG 8 분 원심 분리하여 spheroplasts ° C. </li><li> 얼음처럼 차가운 균질화 버퍼 [버퍼 / G (서부 유럽 표준시 무게) 세포의 6.5 ML]에서 pelleted spheroplasts을 Resuspend. </li><li> 얼음 유리 균질 화기에 미리 차게하기 위해 세포를 전송합니다. </li><li> 꽉 유봉을 사용하여 유봉 15 스트로크를 만들어 세포를 균질. </li><li> 얼음처럼 차가운 균질화 버퍼 1 볼륨을 추가합니다. </li><li> 50 ML의 플라스틱 원심 튜브에 균질 spheroplasts를 전송합니다. </li><li> 펠렛 4 1,500 XG에서 5 분 centrifuging에 의해 손상되지 않은 세포, 핵, 대형 부스러기 ° C. </li><li> 4 3,000 XG에서 5 분 결과 뜨는을 원심 분리기 ° C. </li><li> 4 ° C.를 XG 12,000 15 분 결과 뜨는을 원심 분리기 </li><li> 얼음처럼 차가운 균질화 버퍼에 가만히 따르다 뜨는 및 resuspend 펠렛 [버퍼 / G (서부 유럽 표준시 무게) 세포의 6.5 ML]. </li><li> 4 3,000 XG에서 5 분 원심 분리기 ° C. </li><li> 4 ° C.를 XG 12,000 15 분 결과 뜨는을 원심 분리기 </li><li> 얼음처럼 차가운 SEM 버퍼 3 ML에 가만히 따르다 뜨는 및 resuspend 펠릿. </li></ol> **이 정지가 mitochondria에 풍부한이지만,이 또한 endoplasmic reticulum (microsomes), 잠돌군 Zz 및 vacuoles 같은 다른 organelles가 포함되어 있습니다. 순수 mitochondria를 얻으려면,이 원유 mitochondrial 분획은 아래 설명한 바와 같이, 추가 분류를 받게 될 수 있습니다 .** 다른 organelles에 의해 오염의 mitochondria 찾아볼 수의 정화 <ol><li> 베크맨 울트라 클리어 원심 튜브에 EM 버퍼에 얼음처럼 차가운 60 % 플레이스 1.5 ML (W / V)은 자당. </li><li> 오버레이 60% (W / V) 32 %의 4 ML과 자당, 23 %의 1.5 ML 15 %의 자당 (모든 EM에서 WT / V 버퍼)의 1.5 ML. </li><li> 15 % (W / V) 자당 위에 SEM 버퍼에 원유 mitochondrial 분수 3 ML 놓습니다. </li><li> 4 134,000 XG (33,000 RPM) 1 H ° C.에 대한 베크맨 SW41 티 스윙 - 양동이 로터의 원심 분리기 </li><li> 60 % / 32 % 자당 인터페이스에서 그대로 mitochondria 형태는 갈색 밴드. </li><li> 조심스럽게 mitochondrial 밴드에 도달하기 전까지 자당를 제거합니다. </li><li> 절단 팁과 피펫을 사용하여 mitochondrial 밴드를 제거하고 MLS - 5 로터에 대한 베크맨 원심 관에 넣습니다. </li><li> SEM 버퍼로 튜브를 입력합니다. </li><li> 펠렛 4 30 분 10,000 XG (31,000 RPM)에서 30 분 MLS - 5 로터에서 원심 분리하여 순수 mitochondria ° C. </li><li> 사용 가만히 따르다 뜨는피펫. </li><li> mitochondrial 기능, mitochondrial 프로테옴 및 lipidome하고, mitochondrial DNA의 분석을위한 순수 mitochondria를 사용합니다. </li></ol> 시약 <ol><li> DTT 버퍼 [100 MM Tris/H2SO4 (산도 9.4), 10 MM dithiothreitol] (15 ML 용) <ul style="list-style-type:none;"><li> 1 M Tris/H2SO4 버퍼의 1.5 ML (산도 9.4) </li><li> 1 M DTT 150 μl </li><li> 15 ML에 볼륨 </li></ul></li><li> Zymolyase 버퍼 [20 MM의 칼륨 나트륨 (산도 7.4), sorbitol 1.2 M] (100 ML에 대한) <ul style="list-style-type:none;"><li> 1 M의 칼륨 인산 버퍼 2 ML (산도 7.4) </li><li> sorbitol이 M 60 ML </li><li> 100 ML에 볼륨 </li></ul></li><li> 균질화 버퍼 [10 MM 트리스 / HCL (산도 7.4), sorbitol 0.6 M, 1 ㎜ EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 0.2 % (W / V) BSA] (250 ML에 대한] <ul style="list-style-type:none;"><li> 1 M 트리스 / HCL 버퍼 (산도 7.4) 2.5 ML </li><li> sorbitol이 M의 75 ML </li><li> 500 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 500 μl </li><li> BSA 0.5 g </li><li> 250 ML에 볼륨 </li></ul></li><li> SEM 버퍼 [10 MM의 걸레 / 코 (산도 7.2), 250 MM의 자당, 1 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)] (250 ML에 대한) <ul style="list-style-type:none;"><li> 1 M의 걸레 / 코 버퍼 (산도 7.2) 2.5 ML </li><li> 2 M의 자당의 31.25 ML </li><li> 500 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 500 μl </li><li> 250 ML에 볼륨 </li></ul></li><li> EM 버퍼 [10 MM의 걸레 / 코 (산도 7.2), 1 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)] (250 ML에 대한) <ul style="list-style-type:none;"><li> 1 M의 걸레 / 코 버퍼 (산도 7.2) 2.5 ML </li><li> 500 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 500 μl </li><li> 250 ML에 볼륨 </li></ul></li></ol>

<ol><li>Voet, D., Voet, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Biochemistry.</a> , 3rd Edition, John Wiley & Sons, Inc. Hoboken, NJ. (2004).</li>
<li>Suen, D. -F., Norris, K. L., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dynamics+and+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dynamics and apoptosis.</a> Genes Dev. 22, 1577-1590 (2008).</li>
<li>Cheng, W. C., Berman, S. B., Ivanovska, I., Jonas, E. A., Lee, S. J., Chen, Y., Kaczmarek, L. K., Pineda, F. &amp, Hardwick, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+factors+with+dual+roles+in+death+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial factors with dual roles in death and survival.</a> Oncogene. 25, 4697-4705 (2006).</li>
<li>Detmer, S. A., Chan, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functions+and+dysfunctions+of+mitochondrial+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Functions and dysfunctions of mitochondrial dynamics.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 870-879 (2007).</li>
<li>McBride, H. M., Neuspiel, M., Wasiak, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%3A+more+than+just+a+powerhouse%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Mitochondria: more than just a powerhouse.</a> Curr. Biol. 16, R551-R560 (2006).</li>
<li>Balaban, R. S., Nemoto, S., Finkel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%2C+oxidants%2C+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondria, oxidants, and aging.</a> Cell. 120, 483-495 (2005).</li>
</ol>

저자들은 공개할 사항이 없습니다.

이 방법은 효모 세포에서 순수 mitochondria의 높은 수율 격리 수 있습니다. 이 방법에 의해 정화 Mitochondria 다른 organelles에 의해 오염의 기본적 자유 및 정화 후 자신의 구조와 기능 무결성을 유지합니다. 필수 mitochondrial 프로세스 셀 - 무료 reconstitution에 적합 mitochondria 설명한 방법 산출. 이 높은 순수 mitochondria는 mitochondrial 구조와 기능, mitochondrial 프로테옴 및 lipidome과 mitochondrial DNA의 분석에도 사용될 수 있습니다.

효모 세포 mitochondria의 정화

Purification of Mitochondria from Yeast Cells

Mitochondria ATP 생산의 주요 사이트는 진핵세포 이외의 광합성 세포에 산소 신진 대사 중에 아르<sup&gt; 1</sup&gt;. 이러한 복잡한 organelles은 apoptotic 세포의 죽음에 필수적인 역할을<sup&gt; 2</sup&gt;, 세포 생존<sup&gt; 3</sup&gt; 포유 동물 개발<sup&gt; 4</sup&gt;의 연결을 개발 및 기능<sup&gt; 4</sup&gt;, 세포내 신호<sup&gt; 5</sup&gt;과 장수 규제<sup&gt; 6</sup&gt;. mitochondria에 의해 제어되는 이러한 복잡한 생물 학적 과정에 대한 우리의 이해는 형태, 그들의 단백질과 지질 조성, 그들의 DNA의 무결성, 그들의 수많은 중요한 기능을 평가하기위한 강력한 방법에 의존합니다. 신진 효모<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; 주석 게놈하고 잘 정의된 프로테옴과 유전자와 화학적으로 manipulable 단세포 진핵세포 생물은 mitochondria의 필수적인 생물 학적 기능을 기본 분자 및 세포 메커니즘을 연구를위한 가치있는 모델입니다. 연구 이러한 유형의 경우, 그것은 매우 순수한 mitochondria을 가지고 중요합니다. 여기 mitochondria 효모의 정화에 대한 신속하고 효과적인 방법에 대한 자세한 설명을 제시한다. 이 방법은 다른 organelles에 의해 오염의 기본적 자유 및 정화 후 자신의 구조와 기능 무결성을 유지 높은 순수 mitochondria의 절연을 수 있습니다. 이 방법에 의해 정화 Mitochondria은 필수 mitochondrial 프로세스의 셀 - 무료 reconstitution에 적합하고 mitochondrial 구조와 기능, mitochondrial 프로테옴 및 lipidome하고, mitochondrial DNA의 분석에 사용될 수 있습니다.

우리는 효모에서 mitochondria의 정화에 대한 신속하고 효과적인 방법을 설명<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;. 이 방법은 다른 organelles에 의해 오염의 기본적 자유 및 정화 후 자신의 구조와 기능 무결성을 유지 순수 mitochondria의 높은 수율 격리 수 있습니다.

효모 세포 Mitochondria의 정화

미토콘드리아는 진핵 비광합성 세포의 유산소 대사 과정 중 ATP가 생성되는 주요 장소입니다1. 이 복잡한 소기관들은 또한 ...

본 프로토콜은 먼저 simul liase를 사용하여 세포벽을 소화함으로써 효모 세포를 sphero plast로 전환하는 것으로 시작하며, 이후 유리 테플론 균질기(glass Teflon homogenizer)를 사용하여 sphero plast를 균질화합니다. 생성된 균질액을 두 번 원심분리하여 파괴되지 않은 세포, 핵 및 커다란 잔해물을 침전시킵니다. 다음으로, 얻어진 상층액을 12,000 Gs에서 15분 동안 원심분리하여 미토콘드리아를 침전시킵니다.마지막으로, 다른 소기관들이 여전히 포함되어 있는 조분획 미토콘드리아 분획을 sucrose 밀도 구배에서 134, 000 Gs로 60분 동안 원심분리하면, 60% w/v와 32% w/v sucrose의 계면에서 다른 소기관의 오염이 없는 순수한 미토콘드리아를 회수할 수 있습니다. 안녕하세요, 저는 Concordia University 생물학과 Vladimir tko 박사 연구실의 Christopher Greg 박사입니다. 오늘은 효모 *Saccharomyces cerevisiae*에서 미토콘드리아를 분리하는 방법을 보여드리겠습니다.우리는 미토콘드리아에서 일어나는 동역학과 연령 관련 변화를 연구하기 위해 이 작업을 수행합니다. 세포가 노화됨에 따라, 우리는 미토콘드리아의 단백질체, 지질체 및 DNA의 변화를 살펴볼 것입니다. 그럼 시작하겠습니다.열 개의 250 mL 플라스크에 효모 균주를 배양하여 이 프로토콜을 시작하십시오. 각 플라스크에는 50 mL의 YP 배지를 넣고 30 °C에서 48시간 동안 회전 진탕 배양합니다. 그런 다음, 배양액을 500 mL Nalgene 원심분리 튜브에 붓습니다.실온에서 3000 Gs로 5분 동안 원심분리하여 세포를 수확합니다. 상층액을 따라내고 펠렛 형태의 세포를 250 milliliters의 증류수에 재현탁한 후, 실온에서 3000 Gs로 5분 동안 세포를 원심분리합니다. 이 단계를 반복합니다. 펠렛 형태의 세포를 250 milliliters의 증류수에 재현탁하고 5분 동안 원심분리합니다.상온에서 3000 Gs로 원심분리하여 얻은 젖은 세포 펠릿의 무게를 측정한 후, 펠릿화된 세포를 DTT 버퍼에 재현탁하고 세포 현탁액을 250 mL 플라스크로 옮깁니다. 30 °C에서 70 RPM으로 20분 동안 플라스크를 회전시킵니다. 20분 후, 상온에서 3000 Gs로 5분간 원심분리하여 세포를 수확하고, 펠릿화된 세포를 Xs가 포함되지 않은 Xs 버퍼에 재현탁한 다음 5분 동안 원심분리합니다.실온에서 3000 Gs로 원심분리한 후, 펠렛 형태의 세포를 Xs 없이 Zy 버퍼로 다시 현탁하고 세포 현탁액을 유리 플라스크로 옮깁니다. 세포 현탁액에 zy liase 100 T 분말을 첨가하고 30 °C 쉐이커에서 70 RPM으로 30분 동안 회전시킵니다. Zy liase 100 T는 세포벽을 소화시켜 Sphero plat을 형성합니다. 앞서 설명한 X 소화 이후의 모든 단계는 4 °C 또는 얼음 위에서 수행해야 합니다.세포소기관의 파괴를 방지하기 위해 팁 끝을 자른 피펫을 사용하여 splat 현탁액을 조심스럽게 다뤄야 합니다. 30분간의 XMO 소화를 마친 후, Sphero plat을 50 milliliter 플라스틱 원심분리 튜브로 옮겨 4 °C에서 2200 Gs로 8분 동안 원심분리하고, 펠릿화된 S splat을 얼음처럼 차가운 균질화 버퍼에 재현탁합니다. S splat을 4 °C에서 2200 Gs로 8분 동안 원심분리합니다.펠렛 형태의 sphero plast를 얼음 위에서 차가운 균질화 완충액(homogenization buffer)으로 재현탁하고, 세포를 미리 냉각시킨 유리 균질기(glass homogenizer)로 옮깁니다. 밀착된 페스틀(pestle)을 사용하여 페스틀로 15회 왕복하며 세포를 균질화합니다.균질화된 S splat에 동일한 부피의 얼음처럼 차가운 균질화 버퍼를 추가하고, 이를 50 milliliter 플라스틱 원심분리관으로 옮깁니다. 파괴되지 않은 세포, 핵 및 큰 파편을 침전시키기 위해 균질화된 splat을 4 °C에서 1500 Gs로 5분 동안 원심분리합니다. 생성된 상층액을 새 튜브에 붓고 5분 동안 원심분리합니다.4°C에서 3,000 G로 원심분리합니다. 그 후, 생성된 상층액을 4°C에서 12,000 G로 15분 동안 원심분리한 다음, 상층액을 따라내고 펠렛을 얼음처럼 차가운 균질화 완충액에 재현탁합니다.재현탁된 펠렛을 4°C에서 3000 Gs로 5분 동안 원심분리합니다. 마지막으로, 얻어진 상층액을 4°C에서 12,000 Gs로 15분 동안 원심분리합니다. 상층액을 따라내고 펠렛을 3 mL의 얼음처럼 차가운 용액에 재현탁합니다.SEM 완충액. 이 현탁액은 조분리된 미토콘드리아 분획입니다. 미토콘드리아가 농축되어 있지만, 순수한 미토콘드리아를 얻기 위해 소포체나 마이크로솜, GOGI 및 VAs와 같은 다른 세포 소기관들도 포함되어 있습니다.현탁액은 다음 섹션에서 설명하는 바와 같이 추가 분획 과정을 거치게 됩니다. 순수한 미토콘드리아를 얻기 위해 조제된 미토콘드리아 현탁액의 분획을 시작하려면, 얼음처럼 차가운 60% weight per volume Sucrose가 포함된 em buffer 1.5 milliliters를 Beckman UltraClear 원심분리관에 넣으십시오.다음으로, 60% sucrose 층 위에 32% sucrose 4 mL, 23% sucrose 1.5 mL, 15% sucrose 1.5 mL를 순서대로 조심스럽게 층을 쌓습니다(모든 농도는 SEM buffer 내 w/v 기준). 15% w/v sucrose 층 위에 SEM buffer에 포함된 조분리 미토콘드리아 분획 3 mL를 넣습니다. 이를 Beckman SW 41 TI swinging bucket rotor를 사용하여 4°C에서 134,000 Gs 또는 33,000 RPM으로 1시간 동안 원심분리합니다.원심분리 후, 손상되지 않은 미토콘드리아는 60%에서 32% Sucrose 계면에 갈색 띠를 형성합니다. 팁 끝을 자른 피펫을 사용하여 미토콘드리아 띠가 나타날 때까지 조심스럽게 sucrose를 제거하고, 미토콘드리아 띠를 채취하여 Beckman 원심분리 튜브에 넣습니다. MLS five 로터를 사용하는 경우, 튜브에 SEM buffer를 채운 뒤, 4°C에서 10,000 GS 또는 31,000 RPM으로 30분 동안 MLS five 로터로 원심분리하여 순수 미토콘드리아 펠렛을 형성하고 상층액을 제거합니다.이렇게 정제된 순수 미토콘드리아는 미토콘드리아 기능, 미토콘드리아 단백질체, 지질 및 미토콘드리아 DNA 분석에 사용할 수 있습니다. 왼쪽 레인의 조 미토콘드리아 분획과 오른쪽 레인의 수크로스 밀도 구배 원심분리를 통해 정제된 미토콘드리아에 대해 SDS page 및 다양한 소기관의 단백질 마커 항체를 이용한 면역 블로팅을 수행하였습니다. 두 시료 모두에서 PO one P 및 COX one p 면역 반응성을 통해 미토콘드리아의 존재가 확인되었으며, 면역 블로팅 결과 조 미토콘드리아 분획에서는 각각 소포체, 리소좀 및 골지 단백질을 나타내는 DP M1 P, FO 13 p 및 VPS 10 P의 존재가 확인되었습니다.반면, 이러한 마커 단백질들은 정제된 미토콘드리아에서 검출되지 않았으며, 이는 본 프로토콜을 통해 다른 소기관의 오염이 없는 미토콘드리아를 얻었음을 확인시켜 줍니다. 지금까지 효모인 *Saccharomyces cerevisiae*에서 미토콘드리아를 분리하는 방법을 살펴보았습니다. 이 실험을 수행할 때, 세포를 Zymolyase 100T에서 30분 이상 배양하지 않도록 주의하십시오. 배양 시간이 길어지면 세포 내에 존재하는 막 단백질이나 소기관 단백질이 분해될 위험이 있습니다.이는 시약에 포함된 프로테아제 때문일 수 있습니다. 또한, 미토콘드리아 분리 및 sucrose gradient 작업을 수행하기 전, 미토콘드리아를 -20 °C에서 냉동 보관했다가 실제 원심분리 단계를 진행하기 직전에 해동하여 사용할 수 있습니다. 이것으로 모두 마치겠습니다.실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

공동 정화 nucleases와 프로 테아제에 의해 전통적인 방법으로 정화 진핵세포 리보솜의 준비 오염 부정 스트림 생화학 및 구조 분석에 영향을 미칩니다. 신속하고 간단한 색층 정화 방법은 모델 시스템으로 효모 변이를 사용하여이 문제를 해결하는 데 사용됩니다.

높은 활성 효모 변이의 색층 정화

미토콘드리아 단백질을 코딩하는 대부분의 mRNA는 미토콘드리아 외부 막과 연결되어 있습니다. 우리는 관련의 mRNA와 리보솜과 효모 미토콘드리아의 고립을 목표로 세포 내 분획 절차를 설명합니다. 이 프로토콜은 mRNA의 지방화의 메커니즘과 미토콘드리아 근처 현지화 번역을 표시하기 위해 다양한 조건에서 자란 세포에 적용 할 수 있습니다.

현지화 번역의 메커니즘을 연구하는 효모 미토콘드리아와의 mRNA 관련의 분리

여기 우리가 제시 익스프레스, solubilize, 누 룩을 사용 하 여 SLC4 운송업 자 가족에 상 동으로 여러 진 핵 borate 전송기를 정화 하는 프로토콜. 우리는 또한 multimeric 어셈블리에 대 한 정화 homomeric 단백질을 평가 하기 위해 화학 가교 분석 결과 설명 합니다. 이러한 프로토콜은 다른 도전 막 단백질에 대 한 적용할 수 있습니다.

표현, 가용 화, 그리고 진 핵 Borate 전송기의 정화

베이커의 효모 미토콘드리아 게놈은 8개의 폴리펩티드를 인코딩합니다. 현재 프로토콜의 목표는 모든 프로토콜에 레이블을 지정한 다음 별도의 대역으로 시각화하는 것입니다.

베이커효모사카로미세스 세레비시아에 미토콘드리아 게놈 발현 제품의 라벨링 및 시각화

최근 진행에도 불구하고 많은 효모 미토콘드리아 단백질은 여전히 완전히 알려지지 않은 기능으로 남아 있습니다. 이 프로토콜은 분자 기능의 해명에 대한 기본이었던 단백질의 제출국국화를 결정하는 간단하고 신뢰할 수 있는 방법을 제공합니다.

신진 효모 사카로미세스 세레비시아에 제출 단백질 지역화 평가

우리는 프로테옴 규모에서 단백질 발견 및 정량화와 호환되는 고품질 미토콘드리아 분리를 위한 2단계 프로토콜을 제시합니다. 우리의 프로토콜은 유전 공학을 필요로하지 않으므로 모든 일차 세포와 조직에서 미토콘드리아를 연구하는 데 적합합니다.

단백질 발견 및 정량 분석을 개선하기 위한 미토콘드리아의 2단계 태그 없는 분리

미토콘드리아 접촉 부위는 미토콘드리아 내막 및 외막 단백질과 상호 작용하는 단백질 복합체입니다. 이 부위는 미토콘드리아 막과 세포질과 미토콘드리아 기질 사이의 통신에 필수적입니다. 여기에서는 이 특정 종류의 단백질에 적합한 후보를 식별하는 방법을 설명합니다.

미토콘드리아 접촉 부위를 분리하는 개선된 방법

이 연구는 생물학적 방법을 사용하여 효모 미토콘드리아를 형질전환하는 방법을 설명합니다. 또한 형질전환체를 선택하고 정제하는 방법과 미토콘드리아 게놈 내의 표적 위치에 원하는 돌연변이를 도입하는 방법을 보여줍니다.

베이커의 미토콘드리아 변환

효모 전체 세포의 미토콘드리아 호흡은 세포 생물 에너지학의 중요한 지표입니다. 여기에서는 다양한 효모 종에 적용할 수 있는 이 표현형을 정량화하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

효모 전체 세포의 미토콘드리아 호흡 정량화

분열 효모인 Schizosaccharomyces pombe 는 미토콘드리아를 연구하기 위한 매력적인 모델로 부상하고 있습니다. 여기에서는 S. pombe에서 미토콘드리아 호흡 복합체의 풍부함과 조립을 분석하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다. 이를 통해 미토콘드리아 호흡 사슬에서 보존된 유전자의 새로운 기능을 특성화할 수 있습니다.

핵분열 효모 schizosaccharomyces pombe에서 미토콘드리아 호흡 사슬 단백질의 발현 및 복합체 어셈블리 분석

배우세요 효모 Saccharomyces cerevisiae에서 미토콘드리아를 정화하는 효과적인 방법을. 세포벽 소화, 유리 테플론 균질화, 연속 원심분리 및 자당 농도 구배 원심분리를 통해 고순도 미토콘드리아를 분리합니다.

효모 세포 Mitochondria의 정화

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