조직 타겟 배아 Chimeras : Zebrafish Gastrula 세포 이식

이 절차는 단일 세포 단계의 제브라피시 배아를 미세주입 플레이트에 정렬하는 것으로 시작합니다. 형광 덱스트린 용액을 난황에 미세주입하십시오. 주입된 세포 바로 아래에 있는 배아들이 이식 공여자입니다.

공여체 및 수용체 배아를 코팅하고 쉴드 단계(shield stage)까지 배양합니다. DEC가 코팅되어 덱스트린이 주입된 배아 2개를 이식 플레이트의 웰 하나에 나란히 넣습니다. 각 공여체 쌍에 대해 아래 과정을 반복합니다. 전뇌의 미래 중뇌(di encephalon)로 이식될 세포를 겨냥하여 웰당 수용체 배아 1개를 추가하고, 정중선으로부터 그리고 정중선으로 세포를 이식합니다.

동물극과 쉴드(shield)의 중간 지점입니다. 공여체 가사(gasa)의 세포를 수용체 가사(Gasa)로 이식합니다. 30시간까지 배양 후 고정합니다.

필요한 경우 면역화학 염색을 수행하고, 시료를 마운팅하여 이미징합니다. 또는, 숙주를 살아있는 상태로 마운팅하여 타임랩스 이미징을 수행합니다. 안녕하세요, 저는 매사추세츠주 노샘프턴에 위치한 스미스 칼리지 생물과학과의 Michael ESI 교수 연구실 소속 Elizabeth De Shane입니다.

저는 연구실의 책임연구원인 Michael Besi 박사입니다. 오늘은 제브라피쉬 모델 시스템을 사용하여 가스트룰라 단계의 세포 이식을 통한 키메라 배아 제작 방법을 보여드리겠습니다. 저희 연구실에서는 이 절차를 통해 전뇌 교차부 발달에 미치는 특정 유전자의 기능과 교차부 형성 과정 중의 축삭-글리아 상호작용 과정을 연구하고 있습니다.

그럼 시작해 보겠습니다. 우선 1mm 직경, 4인치 길이의 비필라멘트 모세관 3개를 조심스럽게 반으로 잘라 미세주입 플레이트용 홈 몰드를 준비합니다. 순간접착제를 사용하여 모세관 반쪽 두 개를 평평한 표면 위에 나란히 붙입니다.

세 번째 모세관을 앞선 두 개의 모세관 위에 홈에 맞춰 배치하여 피라미드 모양을 만듭니다. 세 개의 모세관이 배치된 상태에서 몰드를 건조시킵니다. 각 인젝션 플레이트당 약 3~5개의 몰드를 제작해야 합니다.

다음으로, 100 millimeter 페트리 접시에 1.5% aros 배아 배지 용액 20 to 25 milliliters를 부어 주입 플레이트를 준비합니다. 준비된 트로프 몰드 3~5개를 즉시 플레이트 바닥에 배치하며, 이때 몰드의 평평한 면이 페트리 접시 바닥에 닿고 aros로 완전히 덮이도록 합니다. aros가 응고되면 몰드가 포함된 커다란 aros 사각형 조각을 잘라내어 트로프 몰드를 제거합니다.

절단된 사각형 주변의 한천(agar)을 조심스럽게 떼어내어 폐기합니다. 사각형 한천 조각을 뒤집은 다음, 미세 핀셋을 사용하여 트로프 몰드(trough molds)를 완전히 제거합니다. 새롭게 형성된 웰(well)들을 고정하기 위해 사각형 주변의 페트리 접시에 용융된 아가로스(agarose)를 붓습니다.

그대로 굳힙니다. 플레이트는 파라필름으로 밀봉하여 4 °C에서 수 주 동안 보관할 수 있습니다. 한천 배지에 성장 징후가 보이면 폐기해야 합니다.

마지막으로, 주사 바늘을 준비하기 위해 마이크로 피펫 모세관 인장기를 사용하여 내부 필라멘트가 있는 1mm 직경, 4인치 길이의 유리 모세관으로 바늘을 제작합니다. 이제 미세 주입 플레이트와 바늘이 준비되었습니다. 배아 수집 및 미세 주입 장치 설정 과정을 살펴보겠습니다. 수정란은 산란 직후에 수집하여 배아 배지로 채운 페트리 접시에서 유지합니다.

끝이 넓은 유리 피펫을 사용하여 배아를 실온의 배아 배지가 채워진 인젝션 플레이트 웰로 옮깁니다. 끝이 뭉툭한 핀셋을 사용하여 배아를 트로프 바닥에 부드럽게 고정시키며, 난막이나 난황이 손상된 배아는 폐기해야 합니다.

다음으로, 희석된 형광 Alexa 594 dextrin 용액 1~2 µL를 주사 바늘에 채웁니다. 모세관 현상에 의해 dextrin이 주사 바늘 끝까지 이동하도록 둡니다. 주사 바늘을 정위 고정 마이크로 조작기(stereotactic micro manipulator)의 모세관 홀더에 부착하고, 마이크로 인젝터 장치의 압력을 조정하여 시작 준비를 합니다.

40 to 50 PSI의 압력과 500 milliseconds의 펄스 지속 시간을 사용합니다. 핀셋을 사용하여 주사 바늘의 끝부분을 살짝 긁거나 잘라 밀봉을 제거합니다. 이상적인 직경은 0.05 to 0.15 millimeters여야 합니다.

바늘을 교정하려면 실체 현미경을 사용하고, 미네랄 오일이 도포된 마이크로미터 위에 덱스트린을 분출하십시오. 펄스의 공기압 지속 시간과 바늘의 크기를 조정하여 볼루스 크기를 변경하십시오. 팁. 주입 과정 전반에 걸쳐 0.8에서 1 nanoliters의 부피에 해당하는 볼루스 크기를 유지해야 합니다.

이제 실체 현미경의 약 3.2배 배율을 사용하여 덱스트린 미세주입을 시작할 수 있습니다. 트로프의 한쪽 끝부터 배아 주입을 시작하며, 배아의 난막과 세포막을 부드럽게 관통하여 난황으로 진입합니다. 세포 바로 아래에 덱스트린 용액을 주입하십시오.

배아에 진입할 때와 동일하게 부드러운 동작으로 주입 바늘을 제거하십시오. 페트리 접시를 이동시켜 다음 배아를 위치시키고, 홈의 길이를 따라 계속해서 주입하십시오. 주기적으로 압력과 볼러스 크기를 확인하십시오.

이제 핀셋을 사용하여 배아를 트로프 밖으로 조심스럽게 밀어냅니다. 배아를 항생제가 포함된 배아 배지로 채운 페트리 접시에 옮깁니다. 배아를 28.5 °C에서 배양하며, 무정란이나 사망 여부를 모니터링합니다.

이제 배아를 향후 이식에 사용할 준비가 되었습니다. 난황낭 형성 과정이 완료되기 전에는 난황의 일부가 노출된 상태로 남게 됩니다. 이 난황은 매우 취약하여 페트리 접시의 플라스틱 표면에 달라붙어 쉽게 찢어질 수 있습니다.

따라서 이식 전날 코팅된 플레이트에 배아를 코팅해야 합니다. 100 mm Petri dish에 녹인 agarose 5~10 mL를 부어 이러한 데코레이션 플레이트를 제작하십시오. 데코레이션 과정에서 배아를 보호하기 위해서는 약 2~3 mm의 얇은 agarose 층만 있으면 됩니다.

플레이트를 식힙니다. 다음으로, 100 millimeter 페트리 접시에 1.5% aros 용액 30 milliliters를 부어 별도의 이식용 플레이트를 만들고 이식 웰 몰드를 삽입합니다. 몰드에는 90도 각도의 변 3개와 45도 각도의 변 1개로 구성된 삼각형 홈이 104개 포함되어 있어야 합니다.

웰은 두 개의 배아를 나란히 배치할 수 있도록 설계되었습니다. 몰드 아래에 기포가 갇히지 않도록 주의하며 아가로스를 경화시키십시오. 몰드를 제거하면 경사진 가장자리를 가진 정사각형 웰들이 포함된 오목한 영역이 나타납니다.

이식할 수용체 및 공여자 배아를 준비하기 위해, 연령이 거의 일치하는 쌍을 유지할 수 있도록 발달 과정을 모니터링해야 합니다. 이를 위해 배아를 23°C에서 31°C 사이의 다양한 온도에서 배양하여 발달 속도를 늦추거나 앞당길 수 있습니다. 수용체와 공여자 배아 모두 원하는 연령에 도달하기 한 시간 전에 코팅된 플레이트 위에 수동으로 코팅되어야 합니다.

위장 발달 단계(gastro stage) 이식의 경우, 수정 후 5시간(5 HPF) 또는 5.5 HPF의 쉴드 단계(shield stage) 이전에 완료해야 합니다. 유리 피펫을 사용하여 항생제 배양액이 채워진 이식 플레이트에 숙주 배아와 공여 배아를 분주합니다. 이때 첫 번째 줄에는 웰당 두 개의 공여 배아를 채우고, 이어지는 두 줄에는 웰당 하나의 숙주 배아를 채웁니다.

이식 작업을 위해, 조이스틱으로 줌과 초점을 완전히 자동 조절할 수 있는 Zeiss luer 형광 실체 현미경을 사용합니다. 이러한 자동 현미경이 필수적인 것은 아니지만, 특히 다수의 이식 작업이 필요한 경우, 이러한 정밀한 외과적 이식의 용이성과 효율성을 획기적으로 높여줍니다. 이식 장치를 설정하려면, einor 에어 트램을 눈금의 중간 위치에 맞추고, 에어 트램 튜빙을 모세관 홀더에 연결한 후 홀더를 einor 자동 마이크로 매니퓰레이터에 고정합니다. 배아와 이식 장치 준비가 완료되었으므로, 이제 위장 단계 세포 이식으로 넘어갈 수 있습니다.

가스트룰라 단계의 세포 이식을 성공적으로 수행하는 데 가장 중요한 기술은 제브라피시의 쉴드(shield)라고도 알려진 배측 블라스트(dorsal blasts) APO 립의 세포 해부학적 구조를 인식하는 능력입니다. 여기에서 다양한 관점에서 본 가스트룰라의 연속 영상을 제시하며, 이 측면도에서 쉴드가 어디에 위치하는지 강조하여 보여줍니다. 쉴드 또는 배측은 빨간색 외곽선으로 표시된 오른쪽에 있으며, 전뇌로 이식될 세포와 중앙선으로 이식될 세포의 표적 위치입니다.

동물극과 쉴드(shield)의 정확히 중간 지점에서, 먼저 배아를 사용자 쪽으로 회전시켜 동물극을 관찰하며 그 과정에서 쉴드와 이식 부위를 확인하겠습니다. 다음으로, 배아가 축을 중심으로 회전하여 쉴드가 아래쪽에 위치하게 합니다. 이제 낭배(gastro)를 다시 위로 회전시켜 등쪽(dorsal) 정면 모습을 보여줍니다.

이제 배아를 다시 순차적으로 회전시켜 6 HPF의 측면 모습으로 맞춥니다. 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 모세관 끝으로 배아를 부드럽게 밀어, 중앙선과 쉴드(shield)가 보이고 모세관 끝과 마주 보는 세포 추출 위치로 회전시킵니다. 명시야 조명에서 형광 조명으로 전환하여 공여 배아를 쉽게 확인할 수 있습니다. 여기서 가스트룰라(gastrula)의 세포들은 빨간색 형광을 띱니다. 세포가 공기-물 계면에 접촉하여 손상될 가능성을 없애기 위해, 소량의 배아 배지를 모세관 안으로 흡입합니다.

공여체 배아의 동물극과 쉴드(shield) 정중앙 지점에서 외배엽을 조심스럽게 뚫습니다. 가사(gasa) 부위의 표면 외배엽과 그 아래의 난황 사이에는 약 20 micrometers 정도의 세포층만 존재합니다. 따라서 난황을 찌르지 않도록 주의하십시오. 난황을 찌를 경우 수 시간 내에 배아가 사망하는 경우가 많습니다.

에어 트램(air tram)을 사용하여 세포를 모세관 안으로 천천히 흡입합니다. 팁을 약간 흔들어 수위(water line)가 항상 보이도록 유지하십시오. 공여 세포 내부에 있는 동안에는 세포 간 접촉을 느슨하게 하는 데 도움이 됩니다.

공여 배아에서 약 10~50개의 세포를 추출해야 합니다. 그다음, 공여체에서 모세관을 제거합니다. 수용체를 동일하게 정렬한 후, 수용 배아의 정확히 같은 위치를 찔러 세포를 배출합니다. 명시야 조명에서 형광 조명으로 전환하면 모세관 바늘 속의 덱스트린 표지 세포가 수용 배아로 이동하는 것을 확인할 수 있습니다.

마지막으로, 이식 후 공여자 및 수용자 배아를 웰에서 꺼냅니다. 배아들을 분리하여 항생제 배아가 채워진 A 코팅 페트리 접시에 조심스럽게 놓습니다. 배아를 28.5 °C에서 배양하면 이식이 완료됩니다.

시각화 및 이미징 단계를 시작하겠습니다. 먼저 이미징에 적합한 단계의 배아를 면역화학적으로 검증된 보존액으로 고정합니다. 본 실험의 경우, 4% formaldehyde 내에서 실온으로 2시간 동안 또는 4°C에서 하룻밤 동안 회전시키며 고정합니다.

이어서 고정된 배아를 두 번 헹군 다음, 0.1 molar pb에서 3분에서 5분 동안 세척합니다. 필요한 경우 적절한 면역 표지를 수행하십시오.

배아를 75% glycerol에 넣고 상온에서 가라앉힌 후 4 °C에서 보관하십시오. 슬라이드 글라스 위에 정사각형의 내경과 일치하는 바셀린 사각형 윤곽선 두 개를 그려 배아 두 개를 고정할 슬라이드를 준비하십시오. 배아 옆에 커버 슬립을 덮고, 전뇌의 전면 뷰를 얻기 위해 필요한 해부를 수행하십시오.

중뇌를 수직으로 절단하여 전뇌를 분리합니다. 이 조직을 최소량의 glycerol과 함께 petroleum 내에 배치합니다. 조직을 적절한 위치에 잘 정렬시킨 후, 시료 위에 커버 슬립을 덮습니다.

또는, 살아있는 배아의 경우 agro 용액 0.75%를 사용하여 유리 바닥 배양 접시에 고정합니다. agro가 응고되기 전에 텅스텐 바늘을 사용하여 배아를 이미징에 적절한 방향으로 조정합니다. 고정된 호스트와 살아있는 호스트 모두 이미징합니다.

Leica SP five 레이저 스캐닝 공초점 현미경을 사용하여 Z-stack을 획득하고, velocity 소프트웨어를 이용해 3차원 또는 4차원 이미지 프로세싱을 수행함으로써 배아 내 성상교세포 집단의 일부가 유전자형 또는 표현형에 따라 서로 다른 키메라 배아를 생성합니다. 본 연구에서는 성상교세포를 표지하는 GFP 형질전환 배아의 사용과, 클론을 두부(cephalon)에 특이적으로 표적화하기 위한 가스트룰라 단계의 세포 이식을 결합한 다각적 접근 방식을 사용했습니다. 또한, 제브라피시 가스트룰라 운명 지도를 활용하여 동물극(animal pole)과 쉴드(shield)로부터 동일한 거리에 있는 정중선의 세포를 선택적으로 추출하였습니다.

이렇게 추출된 세포들을 야생형 호스트 가사(gasa)의 동일한 위치에 이식한 후, 30 HPF까지 성장시켜 전뇌 해부학의 참조 지표가 되는 모든 축삭에 대해 면역 표지를 실시했습니다. 여기에 제시된 예시의 경우, 호스트 배아 하나를 공초점 영상으로 촬영하여 두부와 체절 전반에 걸쳐 고립된 GFP 양성 세포들이 나타나는 것을 확인할 수 있습니다. 이러한 GFP 양성 세포들의 전체적인 형태는 이 클론 분석을 통해 관찰할 수 있으며, 대부분의 세포가 세포체가 뇌실 구역에 인접해 있고 커다란 말단 발이 피질 표면에서 방사형 돌기를 끝맺는 특징적인 방사형 글리아 형태를 띠고 있음을 보여줍니다.

수집된 광학 절편들의 3차원 렌더링을 통해 라벨링된 축삭에 대한 이 세포들의 위치를 명확하게 확인할 수 있습니다. 이식된 세포를 시각화하기 위해 일반적으로 사용되는 또 다른 방법은 1세포기 단계의 야생형 또는 GFP 형질전환 배아의 난황에 형광 세포 계보 염료를 미세 주입하는 것입니다. 본 예시에서는 야생형 배아에 Alexa 594 dextrin을 주입하였습니다.

1세포기 단계에서 배아가 방패 단계(shield stage)까지 발달하도록 한 후, 앞서 언급한 바와 같이 뇌 표적 이식을 4회 수행하였습니다. 다만, 이번에는 형질전환된 호스트 배아의 등쪽 머리 부분을 레이저 스캐닝 공초점 현미경으로 이미징하여 이식하였습니다. 공초점 현미경 관찰 결과, 전뇌 내의 GFP 양성 핵들 사이에 공여 세포들이 붉은색 형광 클러스터를 형성하고 있는 것이 확인되었습니다.

우리는 레이저 주사 공초점 현미경을 사용하여 2시간 동안 3분 간격으로 Z-stack을 수집하여 이 숙주를 추가로 분석했습니다. IMP에서 제공한 velocity 소프트웨어를 이용한 이 타임랩스의 4차원 렌더링은 간상체 우세 세포막과 GFP 양성 핵의 역동적인 세포 이동을 보여줍니다. 지금까지 제브라피시 배아의 세포 이식에 필요한 모든 장치와 시약을 준비하는 방법을 살펴보았습니다.

구체적으로, 우리는 이 기술을 가스트룰라(gastrula) 단계에서 시연하였습니다. 하지만 이 방법은 포배(blastula) 단계의 이식에도 적용 가능합니다. 이 절차를 사용할 때는 이식된 세포의 최종 희망 위치를 가스트룰라 시기의 초기 운명 지도(fate map) 위치와 정확하게 연관시키는 것이 중요합니다. 더 자세한 안내를 위해, 1995년에 발표된 Scott Frazier 박사의 제브라피시 운명 지도에 관한 상세 연구인 'Fate Maps of the Zebrafish Embryo'를 참고하십시오.

여기까지입니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.