Polyacrylamide의 젤의 단백질에 대한 신속하고 민감한 콜로이드 쿠매시 G - 250 스테 이닝

본 영상에서는 폴리아크릴아마이드 겔 내의 수 나노그램 수준의 단백질을 검출하기 위해 수정된 쿠마시 염색 프로토콜의 효능을 시연하겠습니다. 1차원 분리 전의 2차원 겔 전기영동 사례를 통해, 고정 pH 구배 스트립을 변성 버퍼 조건에서 재수화하는 과정을 보여줍니다.

스트립을 하룻밤 동안 재팽창시킨 후, 양극 컵 로딩 방식으로 단백질 샘플을 도포합니다. 집중 과정 동안 단백질은 각각의 등전점에 따라 분리됩니다. 2차원 분리는 SDS page를 통해 수행됩니다.

그 후 겔을 염색 용기에 옮기고 콜로이달 쿠마시(colloidal kumasi)로 염색하여 단백질을 검출합니다. 안녕하세요, 울로르 대학교(University of Olor) 생물 의학 연구 센터의 사비나 메카(Sabina Meka) 연구실 소속 나딘 드 발라(Nadine de Bala)입니다. 오늘은 Kangan 동료들에 따르면 널리 알려지지 않은 절차에 대해 설명해 드리겠습니다. Cy Brilliant Blue는 전기영동 분리 후 단백질 시각화에 흔히 사용되는 염료이지만, 비교 단백질체학에는 적용 가능성이 낮다고 간주되는 경우가 많습니다.

하지만, cos 콜로이드 염색은 민감도, 비용 및 실용성 측면에서 우수한 특징을 제공합니다. 본 연구실에서는 거의 모든 젤 기반 응용 분야, 특히 심근 단백질 발현 변화를 결정하는 분석 단백질체학에서 K 염색 프로토콜을 사용하고 있습니다. 본 영상에서는 2차원 전기영동 젤의 알칼리 pH 범위에서 심근 단백질을 검출하기 위한 이 방법의 사용법을 시연하겠습니다.

그럼 시작하겠습니다. 2D 겔 전기영동의 첫 번째 차원은 등전점 전기영동(isoelectric focusing) 또는 IEF이며, 이 분석에는 고정화 pH 구배 스트립(immobilized pH gradient strips) 또는 IPG 스트립이 사용됩니다.

IEF 수행 전, IM Mobilly dry strip swelling tray를 사용하여 4개의 IPG strip을 각각 125 microliters의 재수화 용액에서 최소 10시간 동안 재수화하며, 이후 IPG strip의 재수화가 완료되면 단백질 시료를 도포할 준비가 됩니다. 네 가지 서로 다른 심장 준비물에서 TCA로 침전시킨 단백질 시료를 IEF 시료 버퍼에 용해하여 단백질 농도가 100 microliters당 100 micrograms가 되도록 조절합니다. 단백질 시료의 가용화는 볼텍스(vortex)를 사용하여 상온에서 최소 30분 동안 진행합니다.

그동안 multi four 전기영동 장치에서 IEF를 수행하기 위해 IM Molene dry strip 키트의 추가 구성 요소를 준비합니다. 먼저 냉각 장치의 온도를 20 °C로 설정하고, 커버액 3~4 mL를 냉각 플레이트 위에 피펫팅한 다음, 빨간색 전극 연결 부위가 양극(anode)을 향하도록 Immobilien dry strip 트레이를 그 위에 배치합니다. Immobilien dry strip 트레이에 커버 오일 약 10 mL를 붓고, 홈이 파인 면이 위로 오도록 Immobilien dry strip 정렬기를 오일이 채워진 트레이 위에 놓습니다.

다음으로, 재팽윤 트레이에서 재수화된 스트립을 꺼내어 젤 면이 위로 오도록 정렬기의 홈에 옮깁니다. 스트립의 산성 끝부분이 양극을 향해야 합니다. 최종적으로 모든 스트립의 양극 가장자리가 일직선으로 정렬되어야 합니다.

증류수에 포화시킨 전극 스트립을 겔 스트립의 양 끝에 가로로 배치하고, 전극 스트립이 겔 표면과 최소한 부분적으로 접촉하도록 합니다. 마지막으로, 색 표시가 해당 전자 접점 방향을 향하도록 전극 스트립 위에 전극을 배치합니다. immobilien 건조 스트립 트레이의 양극 근처에 샘플 컵 바를 배치하고, 각 IPG 스트립 위에 샘플 컵을 놓습니다.

샘플 컵을 가볍게 눌러 IPG 스트립과 잘 접촉되도록 합니다. IPG 스트립이 잠길 정도로 커버 오일 70~80 milliliters를 트레이에 붓습니다. 오일이 샘플 컵 내부로 유입되지 않도록 주의하십시오.

오일이 컵 내부로 유입된 경우, 피펫으로 제거하고 컵의 위치를 다시 조정하십시오. 마지막으로, 샘플 컵이 완전히 잠기도록 커버 오일 약 150 milliliters를 추가합니다. 이제 커버 액체 표면 아래로 피펫팅하여 샘플 컵에 단백질 샘플을 주입하십시오.

컵의 부피는 100 µL입니다. 모든 단백질 시료를 도포한 후, 모든 리드선을 연결하십시오. multi four 장치를 전원 공급 장치에 연결하고, 구배 모드(gradient mode)에서 11.1 kVh 동안 등전점 전기영동을 수행합니다. IEF 이후 IPG 스트립을 젤 면이 위로 향하게 하여 트레이에 놓은 다음, 평형화 과정 동안 환원 및 알킬화를 진행합니다.

환원을 위해 스트립당 1% DTT 평형 용액 2.5 milliliters를 사용합니다. 그 후 15분 동안 흔들어 섞어준 다음, DTT 용액을 완전히 교체하고 2.5% iodoacetamide 평형 용액에서 다시 15분 동안 흔들어 섞어 스트립을 알킬화합니다. 평형 처리된 스트립을 물이 담긴 비커에서 한 번 헹구고, 여과지에 찍어 과잉 평형 버퍼를 제거합니다.

다음으로, 스트립을 XSDS 전기영동 완충액으로 옮깁니다. 이제 스트립 내의 단백질은 2차원 젤 전기영동의 2차 분리를 위한 준비가 되었습니다. 2차 분리는 수직 전기영동 시스템에서 SDS-PAGE를 통해 수행됩니다.

사용 하루 전, 1 mm 두께의 12% acrylamide 겔을 적절한 수량만큼 제작하여 젖은 종이로 덮어 보관합니다. 실온에서 평형화된 IPG 스트립을 분리 겔 상단에 배치하고 뜨거운 agar 용액으로 고정합니다. 단백질 분리는 80 V에서 15분간 시작하여, 염료 전선이 겔 카세트 바닥에 도달할 때까지 120 V로 2.5시간 동안 수행합니다.

SDS-PAGE로 단백질을 분리하는 동안, 겔의 colloidal Coomassie 염색을 위한 용액을 준비합니다. 염색 용액을 만들 때, 다음 순서에 따라 구성 성분을 순차적으로 첨가하는 것이 매우 중요합니다. 먼저, 비커에 100 g의 aluminium sulfate와 약 1.5 L의 milli-Q water를 넣고 녹인 후 교반합니다. aluminium sulfate가 모두 용해되면, 200 mL의 ethanol을 혼합하고 0.4 g의 CBG 250을 용액에 첨가합니다.

CBB G two 50이 완전히 용해되면, 47 milliliters의 ortho phosphoric acid를 첨가합니다. 이 단계에서 kamasi 분자들이 콜로이드 상태로 응집됩니다. 마지막으로, Milli Q water를 추가하여 최종 부피를 two liters로 맞춥니다.

최종 정지 용액에는 입자들이 부유하게 됩니다. 이 용액을 여과하지 마십시오. 염색 용액 또한 미리 준비하여 사용 전까지 암소에 보관할 수 있습니다.

SDS 젤 전기영동이 완료되면, 유리판에서 젤을 조심스럽게 분리하여 Milli Q water가 채워진 염색 용기에 옮깁니다. 젤이 담긴 용기를 수평 진동기(horizontal shaker) 위에 놓고 10분 동안 흔들어 줍니다.

세척 과정을 5~10분 동안 두 번 더 반복하십시오. 젤에 남아 있는 SDS는 염료와 단백질의 결합을 방해하여 감도를 떨어뜨릴 수 있으므로, 신선한 milli cube water로 젤을 충분히 세척하는 것이 중요합니다. 세 번째 세척이 끝나면 트레이에서 물을 따라내십시오.

이제 겔을 염색할 준비가 되었습니다. 먼저, 콜로이드 입자가 고르게 분산되도록 Kumasi 용액을 흔들어 줍니다. 그런 다음 겔이 충분히 잠길 정도로 용액을 추가합니다.

Kumasi 용액이 담긴 접시의 덮개를 닫습니다. 젤을 쉐이커 위에 올려놓고 2~12시간 동안 흔들어줍니다. 10분 후면 첫 번째 단백질 반점들이 나타나는 것을 확인할 수 있습니다.

배양 후 2시간 이내에 80~100%의 염색이 가능합니다. 하지만 100%에 가까운 염색 결과를 얻으려면 하룻밤 동안 배양하는 것을 권장합니다. 염색이 완료되면 Kamasi 용액을 제거하고 Milli Q water로 겔을 두 번 헹굽니다.

겔을 헹군 후, 보풀 없는 종이 타월을 사용하여 염색 용기에 붙어 있는 염료 입자를 제거합니다. 탈염 솔루션을 겔에 넣고 쉐이커 위에서 10분에서 60분 동안 탈염합니다. 마지막으로, Milli Q water로 겔을 두 번 헹굽니다.

겔은 원래의 두께로 돌아오며 kumasi 염색의 색 강도 또한 강화될 것입니다. 이 프로토콜을 따르면, 2D 겔은 뚜렷하게 분리되고 진한 파란색의 단백질 스팟으로 잘 염색될 것입니다. 2D 겔에 대한 kumasi 염색 결과는 은 염색(silver staining) 결과와 대등합니다.

질량 분석법과 높은 호환성 및 민감도를 갖춘 것으로 보고된 Chef Chenko 등의 프로토콜에 따라 진행하였습니다. 2차원 젤 전기영동 사례를 통해 kangs cooma 염색이 얼마나 빠르고 간단하며 민감한지 확인하였습니다. polyacrylamide 젤 내의 단백질을 검출하기 위한 염색은 2시간 이내에 완료될 수 있습니다.

해당 절차 자체는 노동력이 거의 필요하지 않습니다. 그리고 마지막으로, 단 1 ng의 단백질까지 검출할 수 있을 것입니다. 따라서 이 프로토콜은 젤 기반 프로테오믹스의 비표지법을 대체할 수 있는 확실한 대안이 됩니다.

염색 절차를 수행할 때, 분석 등급의 화학 물질과 최고 순도의 물을 사용하는 것이 중요합니다. 또한, 염색 용액에 구성 성분을 순차적으로 첨가하는 것은 준비 과정에서 매우 중요한 단계입니다. 마지막으로, 전기영동 분리 후 겔에서 잔류 SDS를 효율적으로 세척하는 것을 잊지 마십시오.

그렇지 않으면 겔에서 아무것도 확인할 수 없을 것입니다. 이것으로 모두 마치겠습니다. 시청해 주셔서 감사하며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.