인간의 사후 뇌 조직에서 단세포 집단의 고품질 RNA 구하기

이 절차는 -17°C로 설정된 크라이오스탯(cryostat)을 사용하여 액체 질소 증기로 동결된 조직 블록을 8µm 두께로 절편화하여 전하 처리가 되지 않은 일반 유리 슬라이드에 부착하는 것으로 시작합니다. 그 후, 절편을 histo gene 염색 키트로 염색합니다. 피라미드 뉴런을 확인한 후, 약 500개의 세포를 레이저 캡처하여 HS capture 캡으로 수집합니다.

세포가 포함된 캡을 50 µL의 추출 완충액이 들어 있는 마이크로 원심분리 튜브에 넣고 뒤집은 다음, 미리 랙에 배치된 Falcon 튜브에 넣고 42 °C로 설정된 항온수조에 배치합니다. 짧게 원심분리한 후 캡을 제거합니다. 그러면 남은 용액을 RNA 분리에 사용할 수 있습니다.

안녕하세요, 저는 McLean 병원 구조 및 분자 신경과학과의 Wilson Wu 연구실 소속 Charmaine Peterson입니다. 오늘은 인간 사후 뇌 조직에서 파라메탈 뉴런을 레이저 캡처링하는 절차를 보여드리겠습니다. 저희 연구실에서는 마이크로어레이 기술을 사용하여 조현병 환자의 상측두회와 하측두회 내 차등 유전자 발현을 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다.

그럼 시작하겠습니다. 뇌 조직은 조직 절편 제작 전, 하버드 뇌 조직 리소스 센터(Harvard Brain Tissue Resource Center)에서 액체 질소 증기 동결 블록 형태로 제공받았습니다. RNA 오염을 줄이는 것이 중요하므로, 작업 영역, 절편 제작용 칼날, 슬라이드를 포함한 모든 표면을 RNA SAP와 같은 RNA 제거 용액으로 처리하고 100% ethanol로 닦아내었습니다.

본 절차는 -17°C로 설정된 크라이오스탯(cryostat)을 사용하여 액체 질소 증기로 동결된 조직 블록을 전하 처리가 되지 않은 일반 유리 슬라이드 위에 절편으로 만드는 것으로 시작합니다. 이제 조직 절편은 histo gene 퀵 염색 키트를 사용하여 피라미드 뉴런을 식별할 준비가 되었습니다. 에탄올 탈수 시리즈를 준비하기 위해, histo gene 키트에 제공된 염색 용기에 적절한 농도의 에탄올과 RNA-free water를 각각 25mL씩 분주합니다.

75% ethanol이 담긴 병 하나를 제외한 모든 병을 아이스 버킷에 넣으십시오. 해당 75% ethanol 병은 -20 °C 냉동고에 보관하십시오. 다음으로, 염색 용액 100 µL당 1 µL의 RNA inhibitor를 첨가하여 염색 용액을 준비하십시오.

두 개의 슬라이드에 네 개의 조직 절편을 염색할 예정이므로, 마이크로 원심분리 튜브에 염색액 400 µL와 RNAs 억제제 4 µL를 첨가합니다. 염색액은 흄 후드 아래에서 얼음 위에 보관하십시오.

조직 박리를 저해할 수 있는 과잉 수분을 제거하기 위해 자일렌 용기에 분자체(molecular sieves)를 넣습니다. 워터배스의 온도를 42 °C로 설정하여 전원을 켜고, 랙으로 고정한 50 mL Falcon 튜브를 워터배스에 넣습니다. -80 °C 냉동고에서 슬라이드 2개를 꺼내 Kim wipe 위에서 해동합니다.

슬라이드의 모서리가 해동되기 시작할 때까지 약 30초 동안, -20 °C 냉동고 내의 75% ethanol에서 조직을 짧게 고정합니다. 그런 다음 RNA free forceps를 사용하여 슬라이드를 nuclease free water로 옮겨 30초 동안 세척합니다. 슬라이드 세척 후, 염색액이 절편에 집중될 수 있도록 PAP barrier pen으로 절편의 외곽선을 그립니다. 4개의 절편을 histo gene 염색액으로 20초 동안 염색합니다. 절편당 97 µL의 stain/RNA inhibitor를 사용하여, 미리 얼음 위에 준비해 둔 ethanol에서 각 단계별로 30초 동안 절편을 탈수합니다.

조직이 충분히 들뜨도록 충분한 탈수를 달성하기 위해 마지막 100% ethanol 단계는 3분으로 연장해야 합니다. 마지막으로 슬라이드를 xylene에 5분 동안 담근 후, 레이저 캡처 미세절제술을 진행하기 전 슬라이드를 완전히 자연 건조시킵니다. 단일 세포 레이저 캡처를 위한 염색 과정 후에는 피라미드 뉴런을 즉시 제거해야 합니다. 미세절제술 또는 LCM에는 이전에 준비한 50 mL Falcon tube가 들어 있는 42 °C 항온 수조가 필요합니다.

단일 세포 LCM은 ARCTURUS XT 레이저 캡처 시스템 및 소프트웨어를 사용하여 수행합니다. 이 절차를 시작하려면 슬라이드와 캡을 arcturus XT 장치에 장착하십시오. capture HS 캡을 사용하되, 프로그램 설정은 macro로 유지하십시오.

각 슬라이드의 전체 사진을 얻으려면 overview가 표시된 상자를 클릭하십시오. 2배 배율에서 밝기 초점을 조정하여 레이저 캡처를 위한 최적의 구역을 결정하십시오. 조직 절편의 접힘이 심한 부분은 피하고, 손상되지 않고 매끄러우며 염색이 잘 된 절편을 선택하십시오.

캡을 캡처할 전반적인 영역 위에 배치하되, 이번 실험의 경우 캡처 대상 영역인 대뇌 피질의 세 번째 층이 포함되도록 합니다. 캡 레일이 주름진 부위에 놓이지 않도록 주의하십시오. 레일이 주름에 걸리면 캡이 기울어져 스폿 크기가 일정하지 않게 될 수 있습니다.

다음으로, 40배 배율에서 IR 레이저 스팟의 위치를 수동으로 확인합니다. 파란색 십자선이 IR 레이저 스팟의 중앙에 위치해야 합니다. 그렇지 않은 경우, 스팟을 우클릭한 후 'located IR spot'을 선택하여 위치를 조정하십시오.

40배 배율에서 다음 기준에 따라 피라미드 뉴런을 식별하십시오. 첫째, 세포가 피라미드 형태여야 하며, 둘째, apical 또는 basal 수지상 돌기의 근위부가 식별되어야 합니다. 위치 기능의 플러스(+) 기호를 클릭하여 캡의 위치를 저장하십시오. 이렇게 하면 캡이 이동하더라도 스팟 크기를 조정한 정확한 지점으로 항상 되돌아오게 됩니다.

제어 상자에 출력 값으로는 70을, 지속 시간 값으로는 16을 입력하십시오. 이러한 매개변수는 현재 사용 중인 조직에 특화된 것이므로, 작업을 시작하기 전 사용자의 특정 조직 샘플에 맞춰 이 변수들을 테스트하고 조정할 것을 권장합니다. 단일 세포의 레이저 캡처 시에는 스테이지 자동 이동(auto move stage) 옵션을 해제하고, 적절한 크기의 기호가 오른쪽 패널의 기호와 일치하는지 확인하십시오.

오른쪽 하단의 원형 옵션을 선택하여 캡처를 테스트할 뉴런을 선택하십시오. 파란색 십자선을 원형과 일치시킨 후, test IR spot을 클릭하여 레이저를 활성화하십시오. 레이저로 생성된 스폿은 캡처된 대상 주변으로 뚜렷하고 어두운 고리가 먼저 형성되어야 합니다.

링이 세포를 충분히 둘러쌀 만큼 크되, 원치 않는 조직이나 다른 세포가 포함되지 않을 만큼 충분히 작은지 확인하십시오. 링의 색이 너무 밝으면 세포가 포획되지 않은 것입니다. 어두운 링 중앙에 어두운 점이 있다면, 레이저 강도 또는 조사 시간이 너무 긴 것입니다.

포착하고자 하는 층 내의 조직의 서로 다른 부분에서 이 과정을 반복하십시오. 위치에 따라 스팟 크기가 달라지지 않는지 확인하고, 그에 맞게 조정하십시오. 포착할 피라미드 뉴런을 약 500개 세포 정도 식별하십시오.

레이저 캡처 버튼을 눌러 세포를 캡처하십시오. 캡을 QC 스테이션으로 이동하십시오. 뉴런의 최소 90%가 제거되었는지 확인하십시오.

그렇지 않은 경우, 대부분의 세포가 포집된 영역에서 더 많은 세포를 포집하십시오. 50 µL의 추출 버퍼가 들어 있는 0.5 mL 마이크로 원심분리 튜브에 캡을 넣으십시오. 캡은 버퍼가 새는 것을 방지하기 위해 완벽하게 맞도록 설계되었습니다.

추출 버퍼가 캡 전체를 덮도록 조립체를 뒤집어 42 °C로 설정된 항온 수조 내의 50 mL Falcon tube 바닥에 놓습니다. 뉴런을 30분 동안 배양하여 캡에서 조직을 제거한 후, 튜브와 캡 조립체를 800 g에서 2분 동안 원심분리합니다. 원심분리가 끝나면 캡을 제거합니다.

RNA 분리를 나중에 수행할 예정이라면, 남은 세포 추출물을 -80°C에서 보관하십시오. 그렇지 않은 경우 다음 섹션에 설명된 대로 세포 추출물에서 RNA 분리를 진행하십시오. RNA 분리는 LCM 샘플에서 소량의 세포를 분리하고 저발현 mRNA를 보존하도록 설계된 PICO pure isolation kit를 사용하여 수행합니다.

이 절차를 시작하려면, 키트에 제공된 70% ethanol을 세포 추출물에 첨가하고 전처리된 정제 컬럼에서 원심분리하십시오. 세척 후 RNA를 컬럼 필터에 결합시키기 위해, DNase를 처리하여 DNA 간섭 위험을 제거하십시오. 이 단계는 real-time R-T-P-C-R과 같은 하위 응용 분석에서 특히 중요합니다.

DNA 소화를 마친 후, wash buffer one 40 µL를 첨가하고 정제 컬럼을 8,000 Gs에서 15초 동안 원심분리합니다. 그 후 키트에 제공된 프로토콜에 따라 세척 과정을 진행하되, wash buffer two를 이용한 마지막 세척 단계를 2분에서 2분 30초로 연장하여 컬럼에 세척 버퍼가 남아 있지 않도록 합니다. 세척 버퍼가 남아 있을 경우 RNA 수율이 감소할 수 있습니다. 컬럼을 다른 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. elucian buffer를 첨가하고 컬럼 내 필터에서 1분 동안 배양한 후, 컬럼을 원심분리하여 RNA를 용출합니다.

마지막으로, 가상 젤과 전기영동도를 제공하는 Experian High Sense 랩 칩을 사용하여 추출된 RNA의 품질을 확인합니다. 샘플 1.3 µL를 0.5 mL 튜브에 피펫팅하십시오. 품질 관리 테스트를 위해 샘플의 나머지는 -80 °C에서 냉동 보관하십시오. RNA의 품질이 확인되면, 이를 증폭하고 표지하여 하이브리드화할 수 있습니다.

유전자 발현 프로파일링 분석을 위해 ribo amp HS plus 키트를 사용하여 두 차례의 선형 증폭을 수행하며, 이를 통해 마이크로어레이와 Q-R-T-P-C-R 실험을 모두 수행하기에 충분한 약 50 micrograms의 증폭된 RNA를 얻을 수 있습니다. 증폭된 RNA의 표지를 위해 Molecular Devices사의 turbo biotin labeling kit 및 labeling 제품을 사용합니다. 마지막으로 Agilent사의 human X three P gene chip pro beret를 사용하여 유전자 발현 프로파일링을 수행합니다.

조직 절편 제작 결과, 슬라이드당 2개의 절편이 포함된 슬라이드 2개가 생성되어 사례당 총 4개의 절편이 확보되어야 합니다. 각 절편은 찢어짐, 균열 또는 접힘이 최소화되어 매끄러운 상태여야 합니다. 피라미드 뉴런은 크기가 약 20 to 25 µm이며, 피라미드 형태와 가시적인 정단 수지상 돌기를 가진 채로 진하게 염색되어야 합니다.

LCM 과정 중 레이저가 열가소성 필름을 투과하여 펄스되면, 세포가 캡에 부착되어 슬라이드 위의 주변 조직에서 분리됩니다. 매크로 설정에서 캡처 HS 캡을 사용하고 레이저 출력과 강도를 적절히 조절하면, 약 85%에서 100%의 뉴런이 캡에 부착되어야 합니다. 각 섹션당 약 500에서 700개의 세포를 얻어야 하며, 이를 통해 케이스당 최소 500 picograms의 총 RNA를 확보할 수 있습니다.

총 RNA 분리 후, BioRad Experian을 통해 일렉트로페로그램과 가상 젤로 RNA 품질을 평가합니다. 사후 조직의 경우, 일렉트로페로그램에서 18 s 및 20 a s 리보솜 RNA 단위에 해당하는 두 개의 뚜렷한 피크가 확인되어야 합니다. 하지만 절편 제작 전의 요인으로 인해 조직이 분해되었을 수 있으므로 항상 이러한 결과가 나타나는 것은 아닙니다.

일반적으로 빨간색 화살표로 표시된 것처럼 18 s 부근의 큰 피크와 더 작은 28 s 피크가 나타나며 분해를 나타내는 큰 돌출부가 보일 것입니다. 반면, 분해가 너무 많이 진행되어 품질이 좋지 않은 RNA는 곡선 아래 면적이 넓은 전기영동도를 통해 확인할 수 있습니다. 두 차례의 선형 증폭 후 mRNA의 품질을 테스트하기 위해 분포 위치의 하향 이동을 확인하는 것 외에도, BioRad Experian standard Sense lab 칩과 NanoDrop 분광광도계를 모두 사용합니다.

전통적인 Atrics 마이크로어레이 기술은 본 프로토콜을 통해 검출하기 위해 mRNA 전사체 확산 길이가 최소 600 뉴클레오타이드여야 합니다. 시간의 경과에 따라 큰 피크들이 천천히 하강하는 전기영동도를 통해 mRNA 확산이 1000 뉴클레오타이드 범위에 도달했음을 확인하였습니다. 이 결과는 가상 겔(virtual gel)을 통해서도 확인됩니다.

전사체 길이가 600 뉴클레오티드보다 짧은 경우, 해당 샘플은 포함하지 않아야 합니다. 하이브리드화의 경우, NanoDrop 측정 결과 샘플 전반에서 260/280 비율 또는 순도가 평균 2.5로 나타났습니다. 평균 농도는 1.7 µg/µL였으며, 이는 샘플당 약 50 µg의 mRNA에 해당하여 마이크로어레이 분석과 이후의 검증 과정에 충분한 양이었습니다. 검증 과정 및 이후 qRT-PCR을 이용한 결과 검증에는 15~20 µg의 mRNA가 필요합니다. 본 연구 결과, 이 프로토콜을 통해 얻은 RNA의 양과 질 모두 Atrix human X3P 칩을 통해 유전자 발현 차이를 조사하기에 충분한 수준임을 확인하였습니다.

Atrics Human X three P 칩에 하이브리드화한 후, 평균 26.6%의 call percentage를 얻었으며, 이는 하이브리드화 및 프로브 강도가 적절했음을 나타냅니다. 지금까지 사후 인간 뇌 조직에서 파라메탈 뉴런을 레이저 캡처하여 해당 세포에서 얻은 RNA를 사용하는 방법을 보여드렸습니다. 이 절차를 이용한 마이크로어레이 G 프로파일링 연구를 수행할 때는 RNA 무결성을 유지하기 위해 모든 단계를 RNase-free 환경에서 진행하고 신속하게 완료하는 것이 중요합니다.

이상입니다. 시청해 주셔서 감사하며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.