인간의 사후 뇌 조직에서 단세포 집단의 고품질 RNA 구하기

우리는 사후에 인간의 두뇌에있는 우수한 시간적 이랑의 레이어 III에서 단일 세포 인구, 피라미드 뉴런에서 RNA를 분리하고 추출 레이저 캡처 microdissection를 사용하여 프로세스를 설명합니다. 우리는 이후 선형 (T7 기준) mRNA를 증폭하고, Affymetrix microarray 인간 X3P에 샘플을 잡종.

이 절차는 섭씨 영하 17도로 설정된 저온 유지 장치에서 8마이크로미터 액체 질소 증기 냉동 조직 블록을 충전되지 않은 일반 유리 슬라이드에 절편하는 것으로 시작됩니다. 그 후, 절편은 histo gene staining kit로 염색됩니다. 피라미드 뉴런을 확인한 후 약 500개의 세포를 HS 포획 캡에 레이저로 캡처합니다.

셀이 있는 캡을 50마이크로리터의 추출 버퍼가 들어 있는 마이크로 원심분리 튜브에 넣고 거꾸로 뒤집어 이전에 이라크에 배치된 Falcon 튜브에 넣고 섭씨 42도로 설정된 수조에 놓습니다. 짧은 원심분리 단계 후에 캡을 제거합니다. 그런 다음 나머지 용액은 RNA 분리를 위한 준비가 됩니다.

안녕하세요, 저는 McLean Hospital의 구조 및 분자 신경과학과 Wilson Wu 실험실의 Charmaine Peterson입니다. 오늘은 인간의 사후 뇌 조직에서 초금속 뉴런을 레이저로 캡처하는 절차를 보여드리겠습니다. 우리는 마이크로어레이 기술을 사용하여 정신분열증 환자의 상회랑과 불량회랑에서 차등 유전자 발현을 연구하기 위해 실험실에서 이 절차를 사용합니다.

시작하겠습니다. 뇌 조직은 조직 절편 전에 Harvard Brain Tissue Resource Center에서 액체 질소 증기 동결 블록으로 얻었습니다. RNA 오염을 줄이는 것이 중요합니다.작업 영역, 절편 블레이드 및 슬라이드를 포함한 모든 표면은 RNA SAP와 같은 RNA 오염 제거 솔루션으로 처리되고 100% 에탄올로 닦아집니다.

이 절차는 섭씨 영하 17도로 설정된 저온 유지 장치에서 액체 질소 증기 냉동 조직 블록을 충전되지 않은 일반 유리 슬라이드에 절단하는 것으로 시작됩니다. 조직 절편은 이제 histo gene quick staining kit를 사용하여 피라미드 뉴런을 식별할 준비가 되었습니다. 에탄올 탈수 시리즈, 적절한 에탄올 농도의 부분 표본 25ml와 RNA 자유 물을 histo gene kit와 함께 제공된 염색 용기에 준비합니다.

75% 에탄올 항아리 하나를 제외한 모든 항아리를 얼음 양동이에 넣습니다. 75% 에탄올을 섭씨 영하 20도의 냉동고에 넣습니다. 다음으로, 염색 용액 100마이크로리터당 1마이크로리터의 RNA 억제제를 첨가하여 염색 용액을 준비합니다.

2개의 슬라이드에서 4개의 조직 절편을 염색할 것이기 때문에 마이크로 원심분리 튜브의 염색 용액 400마이크로리터에 4마이크로리터의 RNA 억제제를 첨가합니다. 염색 용액을 얼음 위에 보관하십시오. 흄 후드 아래.

자일렌 용기에 분자체를 추가하여 조직 리프팅을 손상시킬 수 있는 과도한 물을 제거합니다. 온도를 섭씨 42도로 설정하고 수조를 켜고 랙으로 지지되는 50mm Falcon 튜브를 수조에 놓습니다. 영하 80도의 냉동고에서 슬라이드 두 개를 꺼내 킴 물티슈로 해동합니다.

약 30초 동안 또는 슬라이드의 모서리가 해동되기 시작할 때까지 섭씨 영하 20도의 냉동고에서 30초 동안 75% 에탄올의 조직을 잠시 고정합니다. 그런 다음 RNA 자유 겸자를 사용하여 슬라이드를 뉴클레아제가 없는 물로 옮겨 32번째 세척을 수행합니다.슬라이드를 세척한 후 PAP 장벽 펜으로 섹션을 윤곽을 그려 염색 용액을 20초 동안 히스토 유전자 염색 용액으로 4개 섹션을 염색합니다. 섹션당 97마이크로리터의 염색 슬래시 RNA 억제제로 이전에 준비된 에탄올의 섹션을 단계당 30초 동안 얼음에서 탈수합니다.

최종 100% 에탄올 단계는 적절한 조직 리프트를 위한 충분한 탈수를 달성하기 위해 3분으로 연장되어야 합니다. 마지막으로, 레이저 캡처 현미해부를 진행하기 전에 슬라이드를 5분 동안 자일렌에 담그고 슬라이드가 공기 중에서 완전히 건조되도록 하고, 단일 세포 레이저 캡처 절차를 염색한 후 피라미드 뉴런을 즉시 제거해야 합니다. MICRODISSECTION 또는 LCM은 이전에 설정된 50ml Falcon 튜브가 포함된 섭씨 42도의 수조가 필요합니다.

단일 셀 LCM은 ARCTURUS XT 레이저 캡처 시스템 및 소프트웨어를 통해 구현됩니다. 이 절차를 시작하려면 슬라이드와 캡을 arcturus XT 장치에 로드합니다. 캡처 HS 캡을 사용하되 프로그램 설정은 매크로로 유지합니다.

개요가 있는 상자 로드를 클릭하여 각 슬라이드의 개요 사진을 가져옵니다. 밝기 초점을 2배 배율로 조정하여 레이저 캡처를 위한 최적의 단면을 결정합니다. 과도하게 접힌 조직 절편은 피하고 온전하고 매끄럽고 얼룩진 절편을 선택하십시오.

글쎄, 당신이 캡처할 일반 영역 위에 캡을 씌우고, 우리의 경우에 캡처할 영역을 포함해야 합니다. 피질의 3층. 캡 레일이 접힌 부분에 놓이지 않도록 하면 캡이 기울어져 스폿 크기가 다양해질 수 있습니다.

그런 다음 40배 배율에서 IR 레이저 스폿의 위치를 수동으로 확인합니다. 파란색 십자가는 IR 레이저 스폿의 중앙에 있어야 합니다. 그렇지 않은 경우 스폿을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 위치한 IR 스폿을 선택하여 위치를 조정하십시오.

40배 확대에서 다음 기준에 따라 피라미드 뉴런을 식별하는데, 하나는 피라미드 모양으로 세포를 형성하고 두 번째는 정점 및/또는 기저 수상돌기의 근위 부분을 식별할 수 있습니다. position 함수에서 더하기 기호를 클릭하여 캡의 위치를 저장합니다. 이렇게 하면 캡을 이동해도 항상 스폿 크기를 조정한 것과 정확히 동일한 지점으로 돌아갑니다.

이 값을 컨트롤 상자에 입력하고 70을 전력으로, 16을 지속 시간으로 입력합니다. 이러한 매개변수는 당사 조직에 따라 다르므로 시작하기 전에 특정 조직 샘플에 따라 이러한 변수를 테스트하고 조정하는 것이 좋습니다. 단일 셀을 레이저로 캡처할 때 자동 이동 스테이지 옵션을 클릭 취소하고 올바른 크기의 기호가 오른쪽 패널의 기호와 관련이 있는지 확인합니다.

오른쪽 아래에 있는 원 옵션을 선택하여 캡처를 테스트하려는 뉴런을 선택합니다. 그리고 파란색 십자가를 원과 정렬한 후 테스트 IR 스폿을 클릭하여 레이저를 활성화합니다. 레이저에 의해 만들어진 스폿은 먼저 캡처된 물체 주위에 선명하고 어두운 고리가 있어야 합니다.

고리가 세포를 둘러쌀 수 있을 만큼 충분히 크지만 원치 않는 조직이나 다른 세포를 포함하지 않을 만큼 충분히 작은지 확인하십시오. 이 고리가 너무 가벼우면 세포가 포획되지 않은 것입니다. 어두운 고리의 중간에 어두운 점이 있으면 레이저 강도 슬래시 지속 시간이 너무 큰 것입니다.

캡처하려는 층 내 조직의 다른 부분에 대해 이 과정을 반복합니다. 위치에 따라 스폿 크기가 다르지 않은지 확인하려면 적절하게 조정하십시오. 약 500개의 세포를 포획하기 위해 피라미드 뉴런을 식별합니다.

레이저 캡처 버튼을 눌러 세포를 캡처합니다. 캡을 QC 스테이션으로 이동합니다. 뉴런의 90% 이상이 제거되었는지 확인하십시오.

그렇지 않은 경우 대부분의 세포가 포획된 영역에서 더 많은 세포를 포획합니다. 50마이크로리터의 추출 버퍼가 들어 있는 0.5ml 마이크로 원심분리기 튜브에 캡을 놓습니다. 캡은 버퍼가 누출되는 것을 방지하기 위해 완벽하게 맞도록 설계되었습니다.

어셈블리를 거꾸로 뒤집어 추출 버퍼가 전체 캡을 덮고 섭씨 50도로 설정된 수조의 42ml Falcon 튜브 바닥에 놓습니다. 30분 동안 뉴런을 배양하여 캡에서 조직을 제거한 후 튜브와 캡 어셈블리를 800g으로 2분 동안 배양합니다. 원심분리 후 캡을 제거합니다.

RNA 분리가 나중에만 수행되는 경우. 나머지 세포 추출물은 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. 그렇지 않으면 다음 섹션에 표시된 대로 세포 추출물에서 RNA 분리를 진행하고, LCM 샘플에서 적은 수의 세포를 분리하고 낮은 농도의 mRNA를 유지하도록 설계된 PICO 순수 분리 키트를 사용하여 RNA 분리를 수행합니다.

이 절차를 시작하려면 키트와 함께 제공된 70% 에탄올을 세포 추출물에 추가하고 사전 컨디셔닝된 정제 컬럼에서 원심분리합니다. 세척 후 RNA를 컬럼 필터에 결합하려면 RNA를 D Ns로 처리하여 DNA 간섭의 위험을 제거하십시오. 이 단계는 실시간 R-T-P-C-R과 같은 다운스트림 애플리케이션에서 특히 중요합니다.

DNA 소화 후에 세척 완충기 1의 40 마이크로리터를 추가하고 8, 000 Gs.그 후에 15 초 동안 정화 란을 원심 분리하십시오, 장비로 제공된 의정서에 따라 세척으로 진행하고십시오, 그러나 아무 세척 완충기도 란에서 남아 있지 않다는 것을 보증하기 위하여 2에서 2 및 30분까지 세척 완충기 2를 가진 마지막 세척 단계를 확장하십시오, RNA 수율을 줄일 수 있습니다. 컬럼을 다른 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다. elucian buffer를 추가하고 컬럼의 필터에서 1분 동안 incubation하여 컬럼을 원심분리하여 RNA를 용리합니다.

마지막으로, 1.3마이크로리터의 시료를 0.5ml 튜브에 가상 겔 및 전기영로그램 피펫으로 제공하는 Experian High Sense 실험실 칩을 실행하여 추출된 RNA의 품질을 확인합니다. 품질 관리 테스트를 위해 나머지 샘플을 섭씨 영하 80도에서 동결합니다. RNA의 품질이 검증되면 에 의해 증폭되고 라벨링되고 혼성화될 수 있습니다.

유전자 발현 프로파일링 분석을 위해 ribo amp HS plus kit를 사용하여 두 차례의 선형 증폭을 수행하며, 이를 통해 마이크로어레이 및 Q-R-T-P-C-R 실험의 성능을 수행하기에 충분한 약 50마이크로그램의 증폭된 RNA가 생성됩니다. 터보 비오틴 라벨링 키트 및 분자 장치의 라벨링은 증폭된 RNA를 라벨링하는 데 사용됩니다. 마지막으로, atrix의 human X three P 유전자 칩 프로 베레모를 사용한 유전자 발현 프로파일링을 수행합니다.

조직 절편은 슬라이드당 2개의 섹션이 있는 2개의 슬라이드, 케이스당 총 4개의 섹션이 되어야 합니다. 각 섹션은 찢어짐, 균열 또는 접힘을 최소화하여 매끄러워야 합니다. 피라미드 뉴런은 약 20-25마이크로미터 크기로 피라미드 모양과 눈에 보이는 정점 수상돌기로 짙게 염색되어야 합니다.

LCM 동안, 레이저가 열가소성 필름을 통해 펄스를 일으킨 후, 세포는 캡에 부착되어 더 이상 슬라이드에 있지 않고 주변 조직을 떠납니다. 약 85-100%의 뉴런 뒤에 있는 뉴런은 매크로 설정에서 캡처 HS 캡과 함께 캡에 부착하고 레이저 출력과 강도를 올바르게 조정해야 합니다. 각 절편에 대해 절편당 약 500-700개의 세포를 얻어야 하며, 그 결과 사례당 최소 500피코그램의 총 RNA가 생성됩니다.

전체 RNA 분리 후 RNA 품질은 BioRad Experian을 통해 전기표상도와 가상 겔을 통해 평가됩니다. 전기표상도에서 사후 조직이 있는 18 s 및 20 a s 리보솜 RNA 단위에 해당하는 두 개의 뚜렷한 피크를 볼 수 있습니다. 그러나 절편 이전의 요인으로 인해 조직이 저하될 수 있으므로 항상 그런 것은 아닙니다.

일반적으로 성능 저하를 나타내는 큰 범프가 표시되며, 큰 피크는 약 18초 부근에 있고 더 작은 피크는 빨간색 화살표로 표시된 것처럼 28초 정도입니다. 대조적으로, 너무 많은 분해가 있는 나쁜 품질의 RNA는 곡선 아래에 큰 영역이 있는 전기표상도에 의해 표시됩니다. 두 차례의 선형 증폭 후 mRNA의 품질을 테스트하기 위해 확산 위치를 하향 이동하는 것 외에도 BioRad Experian 표준 Sense 실험실 칩과 NanoDrop 분광 광도계를 모두 사용합니다.

전통적인 Atrics 마이크로어레이 기술은 이 프로토콜로 검출하기 위해 mRNA 전사체 확산의 길이가 600개 이상이어야 합니다. mRNA 확산은 전기표상도에서 알 수 있듯이 1000 뉴클레오티드 범위에 도달했으며, 큰 피크는 시간의 함수로 천천히 하강했습니다. 이 결과는 가상 젤에 의해서도 확인됩니다.

전사체 길이가 600 뉴클레오티드보다 짧은 경우 샘플을 포함해서는 안 됩니다.혼성화를 위해 NanoDrop 판독값은 2개의 80 비율에 대해 평균 2 60 또는 샘플 전체에 걸쳐 2.5의 순도를 나타냈습니다. 평균 농도는 마이크로리터당 1.7마이크로그램으로 샘플당 약 50마이크로그램의 mRNA가 생성되었으며, 이는 마이크로어레이 분석 및 후속 검증에 모두 충분하며, 15-20마이크로그램의 mRNA가 필요하고 QR TPCR을 사용한 결과의 후속 검증이 필요합니다. 우리의 결과는 이 프로토콜을 통해 얻은 RNA의 양과 품질 모두 atrix human X three P 칩을 통해 유전자 발현 차이를 조사하기에 충분하다는 것을 나타냅니다.

Atrics Human X three P 칩에 하이브리드화한 후 평균 26.6%의 콜 퍼센트를 달성하여 적절한 하이브리드화 및 프로브 강도를 나타냈습니다. 우리는 방금 이 세포에서 얻은 RNA를 사용하기 위해 사후 인간 뇌 조직에서 초금속 뉴런을 레이저로 캡처하는 방법을 보여드렸습니다. 마이크로어레이 G 프로파일링 연구의 경우, 이 절차를 수행할 때 RNA가 없는 환경에서 모든 단계를 수행하고 RNA 무결성을 보존하기 위해 적시에 단계를 완료하는 것이 중요합니다.

그게 다야. 시청해 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.