Zebrafish Oligonucleotide Microarray의 플랫폼을 사용하여 글로벌 유전자 발현 분석
August 10th, 2009
유전자 microarrays는 게놈 전체의 수준에서 유전자 발현 프로 파일링에 강력한 도구입니다. 이 기술은 발달 생물학 및 독성학을 포함한 생물 학적 다양한 분야에 응용 프로그램을하고 있습니다. 이 비디오에서는, 우리는 세부 zebrafish에 대한 포괄적인 oligonucleotide microarray의 플랫폼을 사용하여 글로벌 유전자 발현 분석을위한 프로토콜을.
이 절차는 고품질 RNA 주형에서 합성된 CDNA로 시작합니다. CDNA는 먼저 형광 염료 SI 3로 표지됩니다. 라벨링 반응이 완료되면 라벨링된 CDNA가 정제 및 분리되고 라벨링 반응의 품질이 평가됩니다.
그런 다음 표지된 CDNA는 마이크로어레이로 혼성화됩니다. 혼성화 후, 어레이를 분석하여 샘플에서 유전자 발현의 상대적 수준을 결정합니다. 안녕하세요, 제 이름은 퍼듀 대학교 보건 과학 대학의 Jennifer Freeman 박사 실험실의 Sam Peterson입니다.
이전에는 제브라피시 배아에서 RNA를 추출하고 해당 RNA를 CDNA로 전환하는 방법을 보여주었습니다. 오늘은 전 세계 유전자 발현 프로파일을 연구하기 위해 해당 CDNA를 제브라피시, 올리고 뉴클레오티드 마이크로어레이 플랫폼에 라벨링하고 하이브리드화하는 절차를 보여드리겠습니다. 일반적으로 우리는 이 절차를 사용하여 독소에 대한 노출에 대한 반응으로 차등 유전자 발현을 연구합니다.
시작하겠습니다. 마이크로어레이 실험은 바이오 프라임 어레이 CGH 게놈 라벨링 시스템의 다음 구성 요소인 sci three로 CD NA를 라벨링하기 시작하기 위해 라벨링에 사용되는 형광 염료 SI three의 광 분해를 방지하기 위해 최소한의 광 환경을 필요로 합니다. 또한, 해동 후 DCTP로 표시된 SI 3의 1밀리몰 스톡을 해동하고, 0.6 밀리리터 두께의 벽으로 된 튜브를 결합하여 간단히 원심분리 또는 시약을 합니다.
500 나노그램의 CDNA 40 마이크로리터, 2.5 x 무작위 프라이머 완충액 및 뉴클레아제 자유 물을 사용하여 총 86 마이크로리터의 부피를 달성합니다. 잘 섞고 짧게 분리기를 하고십시오, 그 후에 5 분 동안 thermocycler에 있는 100 섭씨 온도에 반응을 배양하십시오. 배양이 끝나면 즉시 반응을 얼음 수조 슬러리에 10 분 동안 옮깁니다.
다음으로, 냉동실에서 엑소 DNA 중합효소를 꺼내 얼음 위에 올려 놓습니다. 그런 다음 반응 튜브에 10 X-D-C-T-P 10 마이크로 리터를 1 밀리 몰 SI 3D CTP와 XO cleanout DNA 중합 효소 2 마이크로 리터를 잘 혼합하고 간단히 원심 분리합니다. 마지막으로, 섭씨 37도에서 16시간 동안 반응을 배양하고 라벨링이 완료되면 열순환기로 배양합니다.
라벨링된 CDNA를 정리하고 침전시킵니다. 레이블이 지정된 CDNA 청소를 시작합니다. MicroCon 컬럼을 1.5ml 튜브에 넣습니다.
컬럼에 300마이크로리터를 첨가하고 0.1 XSSC를 추가한 다음 라벨링 반응을 추가합니다. 16, 100G에서 4도 SIU에서 10분 동안 컬럼을 원심분리합니다. 흐르는 흐름은 연한 분홍색일 수 있습니다.
플로우 스루를 버리고 컬럼에 300마이크로리터의 nought 0.1 XSSE를 더 추가합니다. 그런 다음 섭씨 4도에서 10분 동안 16, 100G에서 원심분리를 반복합니다. 다시, 흐름을 버리고 이 마지막 세척 후 섭씨 4도에서 12분 동안 16, 100G에서 지금 원심분리하는 컬럼에 300마이크로리터 T 0.1 XSSC를 추가합니다.
플로우 스루(flow through)는 명확해야 하며 분홍색으로 표시된 CDNA가 컬럼에서 볼 수 있어야 합니다. 다시 말하지만, 레이블이 지정된 CD NA를 피하기 위해 이 최종 세척의 흐름을 폐기합니다. 컬럼에 100마이크로리터의 뉴클레아제가 없는 물을 추가합니다. 마이크로 원심분리기 튜브에서 컬럼을 꺼내 새 튜브로 뒤집습니다.
그런 다음 2, 300G에서 섭씨 4도에서 2분 동안 반전된 컬럼을 원심분리합니다. 라벨링된 CDNA는 튜브 바닥의 물에 용해됩니다. 제조업체의 지침에 따라 NanoDrop ND 1000 분광 광도계를 사용하여 언급된 CDNA를 확인합니다.
DNA 농도를 계산하고 함께 제공되는 서면 프로토콜에 설명된 대로 염료 혼입을 평가합니다. CDNA가 충분히 라벨링 된 경우, 6 마이크로 그램을 새 튜브에 넣어 pH 5.2 및 1 x 부피에서 3 몰 아세트산 나트륨의 0.1 x 부피에 표시된 CD NA 혼합물을 침전시킵니다. 이소프로판올은 실온에서 30분 동안 어둠을 배양합니다.
이 시점까지의 모든 단계는 최소한의 조명 환경에서 수행되었음을 염두에 두십시오. 그런 다음 실온에서 16, 100G에서 20분 동안 샘플을 원심분리합니다. 원심분리 후 분홍색의 DNA 펠릿을 건드리지 않고 SUP natant를 조심스럽게 버립니다.
마지막으로 500 마이크로 리터, 70 % 에탄올을 첨가하여 세척하고 16, 100G에서 5 분 동안 부드러운 반전 원심 분리기로 혼합합니다. 실온에서 supinate를 제거하고 튜브를 뒤집은 다음 펠릿을 5분 동안 건조시킵니다. 라벨링된 CDNA는 혼성화 준비가 되었습니다.
혼성화를 시작하기 전에 민첩한 세대 혼성화 시스템을 켜고 섭씨 42도까지 평형을 이루도록 합니다. 먼저 라벨링된 CD NA 펠릿을 5마이크로리터의 뉴클레아제 자유수에 용해시켜 용해시킵니다. Roche Nimble Gen Hybridization 키트, Hybridization buffer hybrid A 및 alignment oligo의 hybridization 구성 요소를 함께 제공되는 서면 프로토콜에 설명된 대로 총 부피 18μliter에 추가합니다.
잘 섞고 튜브를 짧게 돌려 바닥에 내용물을 모으십시오. 다음으로 튜브를 섭씨 95도에서 5분 동안 배치하여 표지된 CDNA를 변성시킵니다. 어레이가 준비될 때까지 튜브를 민첩한 세대 혼성화 시스템으로 즉시 옮깁니다.
마이크로어레이는 신중한 취급 및 보관이 필요합니다. Roche 민첩한 발전기 어레이는 실온에서 건조제와 함께 어두운 곳에 보관됩니다. 배열을 정밀 믹서 정렬 도구에 로드합니다.
PMA T는 X개의 믹서를 PMA T에 로드하고 집게로 접착 스트립을 제거합니다. 어레이와 믹서가 로드된 상태에서 PMA T를 단단히 닫습니다. 다음으로, PMA t의 구멍을 통해 믹서에 압력을 가하여 PMA T에서 어레이와 믹서를 분리합니다.
마지막으로, 브레이어를 사용하여 믹서 외부 주위에 압력을 가하여 어레이가 밀봉되었는지 확인하고 기포를 제거합니다. 다음으로, 어레이 믹서 복합체를 혼성화 시스템에 배치하여 예열하고 CDNA 샘플을 어레이에 로드합니다. 변위 퍼펫을 천천히 일정한 압력으로 사용하십시오.
라벨이 붙은 샘플 15마이크로리터를 믹서 중앙의 주입 포트에 추가합니다. 포트 구멍에서 여분의 샘플을 닦아내고 접착 스트립으로 밀봉합니다. 그런 다음 걸쇠를 닫습니다.
이제 민첩한 세대 하이브리드화 시스템에서 프로그램 B를 사용하여 하이브리드화 솔루션 혼합을 시작합니다. 마이크로어레이가 16 내지 20시간 동안 혼성화되도록 허용한다 혼성화 후에, 마이크로어레이는 혼성화가 거의 완료될 때 세척되고 스캔될 것이다. gene picks 4, 000 B array scanner를 켜서 스캔을 준비하고 약 15분 동안 예열합니다.
다음으로, 함께 제공되는 서면 프로토콜에 설명된 대로 세척 버퍼 1, B 1, 2 및 3을 준비합니다. 전쟁 전 완충액은 1A에서 섭씨 42도로 세척하고 다른 완충액은 실온에 두십시오. 세척 버퍼 one A가 따뜻해지면 접시에 붓습니다.
슬라이드 랙을 세척 버퍼 1 B.Now에 담그십시오.민첩한 세대 혼성화 시스템에서 어레이 믹서 복합체를 제거하고 지그에 밀어 넣습니다. 어셈블리를 예열 세척 버퍼 one A에 담그고 슬라이드에서 벗겨내어 믹서를 조심스럽게 제거하여 세탁을 시작합니다. 그런 다음 지그에서 어레이를 제거하고 세척 버퍼 1에서 15초 동안 교반합니다. A. 어레이를 세척 버퍼 1 B에 잠긴 슬라이드 랙으로 빠르게 옮기고 슬라이드 랙을 2분 동안 격렬하게 교반합니다.
그런 다음 슬라이드 랙을 세척 버퍼 2로 옮기고 1분 동안 교반합니다. 마지막으로 슬라이드 랙을 세척 버퍼 3으로 옮기고 15초 동안 교반합니다. 어레이를 슬라이드 건조 원심분리기로 옮기고 원심분리 후 2분 동안 회전시켜 와셔를 마무리합니다.
D가 빛과 오존에 과민하기 때문에 즉각 배열을 검사하고십시오, 유전자 후비는 물건 4, 000의 B 배열 스캐너로 배열 바코드를 아래로 적재해서 스캐닝을 시작하십시오. 하드웨어 설정 대화 상자 세트에서 532 나노미터 레이저는 PMT 값이 500으로 설정되고 100% 픽셀 크기로 출력이 5미크론으로 설정되며 선은 평균으로 1로, 초점 위치는 0미크론으로 설정됩니다. 설정이 완료되면 어레이를 미리 봅니다.
스캔할 영역을 선택한 다음 스캔합니다. 스캔이 완료되면 이미지 히스토그램을 확인합니다. 이상적으로, 1 E에서 5 개의 정규화 된 카운트를 뺀 값은 65, 000 채도 한계에 있어야하며, 이는 기능의 약 1-2 %가 포화 상태임을 의미합니다.
정규화된 카운트가 1 E에서 5를 뺀 값보다 작으면 PMT 게인을 늘리고 슬라이드를 다시 스캔합니다. 정규화된 카운트가 1 E에서 5를 뺀 값보다 크면 PMT 게인을 줄이고 슬라이드를 다시 스캔하고 이미지를 저장한 다음 데이터 정규화 및 강도 값 계산을 위해 데이터 분석 프로그램을 사용합니다. 라벨링 반응은 일상적으로 최소 10마이크로그램의 라벨링된 CDNA를 생성합니다.
염료 혼입은 뉴클레오타이드와 SI 3의 비율이 A 2, 60 대 5, 50 비율에 23 포인트 15를 곱한 간단한 염기 염료 비율을 사용하여 계산할 수 있습니다. 반응이 좋으면 50에서 80 사이의 값이 됩니다. 허용 가능한 혼성화는 1-2%의 특징이 포화 수율을 갖습니다.
1 E에서 65, 000 채도 제한에서 5개의 정규화된 카운트를 뺀 값입니다. PMT 값을 설정하면 마이크로어레이의 스캔된 이미지를 보고 어레이의 다른 특징에 대한 정렬된 올리고의 강도를 평가하여 500에 가까운 하이브리드화 품질을 정성적으로 평가할 수도 있습니다. 스캔한 이미지에는 어레이 영역 내의 특정 또는 먼지 반점도 평가해야 합니다.
후속 분석에서는 산점도를 사용하여 분석 데이터를 이미지화하여 샘플에서 유전자 발현의 상대적 수준을 결정하고 차등적으로 발현되는 유전자를 식별할 수 있습니다. 차등적으로 발현된 유전자는 무료 절차에서 가장 적합한 라인에서 크게 벗어날 것입니다. 제브라피시 배아에서 RNA를 추출하여 c CD NA를 합성하는 방법을 보여드렸습니다. 여기에서는 글로벌 유전자 발현 프로파일을 연구하기 위해 CD NA를 올리고뉴클레오티드 마이크로레이 플랫폼에 라벨링하고 하이브리드화하는 방법을 보여드렸습니다.
이 절차를 수행 할 때는 항상 고품질 CD NA를 사용하고 사이트 3 염료를 직접 조명에 노출시키지 마십시오. 그게 다야. 지켜봐 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.
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개요
이 비디오는 제브라피쉬에 대한 포괄적인 올리고뉴클레오티드 마이크로어레이 플랫폼을 사용한 글로벌 유전자 발현 분석을 위한 프로토콜을 제시합니다. 유전자 마이크로어레이는 다양한 생물학 분야에서 유전자 발현 프로파일링을 위한 필수 도구입니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 유전자 발현 프로파일링
- 발달 생물학
- 독성학
배경
- 유전자 마이크로어레이는 게놈 전체 수준에서 분석이 가능합니다.
- 여러 생물학 연구 분야에 적용 가능합니다.
- 이 기술은 유전자 기능에 대한 이해를 향상시킵니다.
- 제브라피쉬는 발달 연구에서 모델 유기체로 사용됩니다.
연구 목적
- 유전자 발현 분석을 위한 프로토콜을 시연합니다.
- 포괄적인 프로파일링을 위한 마이크로어레이 플랫폼을 활용합니다.
- 제브라피쉬의 유전자 발현에 대한 통찰력을 제공합니다.
사용된 방법
- 고품질 RNA로부터 cDNA 합성.
- 형광 염료 SI three로 cDNA 라벨링.
- 라벨된 cDNA의 정제 및 품질 평가.
- 라벨된 cDNA의 마이크로어레이 하이브리드화.
주요 결과
- cDNA의 성공적인 라벨링 및 정제.
- 마이크로어레이에서의 효과적인 하이브리드화.
- 샘플의 유전자 발현 수준 분석.
- 글로벌 유전자 발현 패턴에 대한 통찰력.
결론
- 이 프로토콜은 포괄적인 유전자 발현 분석을 가능하게 합니다.
- 마이크로어레이 기술은 다양한 생물학 연구에 귀중합니다.
- 연구 결과는 제브라피쉬의 유전자 기능에 대한 이해에 기여합니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Global gene expression analysis using zebrafish oligonucleotide microarrays enables mechanistic de-risking in early discovery by providing genome-wide transcript profiling. This approach supports target validation and phenotypic screening in toxicology and developmental biology applications. The platform delivers quantitative, reproducible data that informs predictive confidence for lead identification and portfolio triage decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses through genome-wide expression profiling to clarify pathway involvement and biological mechanisms.
- Operational Value: Enables functional target validation by identifying differentially expressed genes in response to toxicant exposure or disease models.
- Predictive Value: Supports predictive confidence and portfolio triage by revealing mechanistic insights that de-risk target selection.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream screening by establishing baseline expression profiles in zebrafish models.
- Operational Value: Delivers standardized, quantitative outputs with high reproducibility due to robust probe design and normalization controls.
- Screening Readiness: Enables reliable compound evaluation through scalable, platform-reusable workflows compatible with automated hybridization and scanning systems.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery findings to preclinical validation by maintaining disease-relevant expression patterns across model systems.
- Biomarker Alignment: Supports translational biomarker discovery through consistent transcriptomic readouts that correlate with phenotypic outcomes.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by providing expression-based safety and efficacy signals early in the pipeline.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification to preclinical validation, enabling iterative refinement of biological understanding.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by detecting expression changes across the entire transcriptome in response to perturbations.
- Screening: Ensures assay readiness through standardized labeling, hybridization, and scanning protocols that yield reproducible intensity values.
- Analytics: Generates normalized count data and intensity values that allow statistical comparison of conditions and identification of differentially expressed features.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by preserving zebrafish-specific transcriptomic signatures relevant to human disease pathways.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability across projects due to standardized array design, labeling chemistry, and scanning parameters.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence through mechanistic de-risking and reduction of biological ambiguity in target selection.
- Operational Value: Ensures standardization, reproducibility, and scalability via validated labeling, hybridization, and quality control steps.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions, capital efficiency, and reduces late-stage biological risk by delivering early expression-based insights.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on genome-wide expression profiles and differential analysis.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular biology, nucleic acid labeling, and microarray handling to ensure data integrity.
- Depends on specialized instrumentation including thermocylers, microarray hybridization systems, and laser scanners for signal detection.
- Necessitates cross-team standardization of labeling efficiency thresholds, wash protocols, and PMT gain settings for consistent results.
- Involves adaptation considerations when applying the platform to different zebrafish strains, developmental stages, or exposure conditions.
- Includes practical limitations such as light sensitivity of fluorescent dyes and the need for optimized cDNA input and dye incorporation ratios.
