Zebrafish Oligonucleotide Microarray의 플랫폼을 사용하여 글로벌 유전자 발현 분석

이 절차는 고품질 RNA 템플릿으로부터 합성된 cDNA로 시작합니다. 먼저 cDNA를 형광 염료 SI3로 표지합니다. 표지 반응이 완료되면, 표지된 cDNA를 정제 및 분리하고 표지 반응의 품질을 평가합니다.

그 다음 라벨링된 CDNA를 마이크로어레이에 하이브리드화합니다. 하이브리드화 후, 어레이를 분석하여 샘플 내 유전자 발현의 상대적 수준을 결정합니다. 안녕하세요, 저는 퍼듀 대학교 보건과학대학 Jennifer Freeman 박사님 연구실의 Sam Peterson입니다.

이전 영상에서 제브라피시 배아에서 RNA를 추출하고 이를 cDNA로 합성하는 방법을 살펴보았습니다. 오늘은 전역적 유전자 발현 프로파일을 연구하기 위해, 해당 cDNA를 제브라피시 올리고뉴클레오타이드 마이크로어레이 플랫폼에 표지 및 하이브리드화하는 절차를 보여드리겠습니다. 일반적으로 이 절차는 독성 물질 노출에 따른 차등 유전자 발현을 연구하는 데 사용됩니다.

이제 시작해 보겠습니다. 마이크로어레이 실험은 라벨링에 사용되는 형광 염료 Cy3의 광분해를 방지하기 위해 최소한의 빛 환경이 필요합니다. CDNA 라벨링을 시작하기 위해 BioPrime Array CGH Genomic Labeling System의 다음 구성 성분인 2.5x random primer buffer, 10X dNTP mix 및 nuclease-free water를 해동하십시오. 또한, 1 mM stock의 Cy3 labeled dCTP를 해동하십시오. 해동 후, 0.6 mL thick walled tube에 시약들을 넣고 짧게 원심 분리하여 혼합하십시오.

500 ng의 cDNA 40 µL, 2.5 x random primer buffer 및 nuclease free water를 첨가하여 총 부피를 86 µL로 맞춥니다. 잘 혼합한 후 짧게 원심 분리하고, thermocycler에서 100 °C로 5분 동안 반응을 배양합니다. 배양이 끝나면 즉시 반응물을 얼음 슬러리에 옮겨 10분 동안 보관합니다.

다음으로, 냉동고에서 exo DNA polymerase를 꺼내 얼음 위에 둡니다. 그 후 반응 튜브에 10 X-D-C-T-P Mix 10 µL, 1 mM SI 3D CTP 2 µL, 그리고 XO cleanout DNA polymerase 2 µL를 첨가합니다. 잘 섞은 후 짧게 원심 분리합니다. 마지막으로 37 °C에서 16시간 동안 반응시키며, 표지가 완료되면 thermocycler를 사용합니다.

표지된 cDNA를 정제하고 침전시킵니다. 표지된 cDNA 정제를 시작하려면 MicroCon 컬럼을 1.5 milliliter 튜브에 넣으십시오.

컬럼에 0.1 XSSC 300 µL를 넣은 후 표지 반응물을 추가합니다. 4 °C에서 16,100 ×g로 10분간 컬럼을 원심분리합니다. 통과액이 옅은 분홍색을 띨 수 있음에 유의하십시오.

통과액을 버리고 컬럼에 0.1 X SSC 300 µL를 추가로 넣습니다. 그런 다음 4°C에서 16,100 G로 10분간 원심분리를 반복합니다. 다시 통과액을 버리고 컬럼에 0.1 X SSC 300 µL를 추가로 넣은 후, 이 마지막 세척 단계에서 4°C, 16,100 G로 12분간 원심분리합니다.

통과액은 투명해야 하며, 분홍색으로 표지된 CDNA가 컬럼에 보여야 합니다. 표지된 CD NA를 용출하기 위해 이 마지막 세척 단계의 통과액을 다시 버립니다. 컬럼에 100 µL의 nuclease free water를 추가합니다. 마이크로 원심분리 튜브에서 컬럼을 꺼내어 새 튜브에 거꾸로 세웁니다.

그 다음, 뒤집힌 컬럼을 4°C에서 2,300 G로 2분 동안 원심분리합니다. 표지된 cDNA는 튜브 바닥의 물에 용해됩니다. 제조사의 지침에 따라 NanoDrop ND 1000 분광광도계를 사용하여 해당 cDNA를 확인합니다.

첨부된 서면 프로토콜에 따라 DNA 농도를 계산하고 염료 표지 여부를 평가하십시오. cDNA가 충분히 표지되었다면, 6 µg을 새 튜브에 넣고 0.1배 부피의 3 M sodium acetate(pH 5.2)와 1배 부피의 Isopropanol을 첨가하여 표지된 cDNA 혼합물을 침전시킨 후, 실온의 암소에서 30분 동안 배양하십시오.

지금까지의 모든 단계가 최소한의 빛 노출 환경에서 수행되었음을 유의하십시오. 그런 다음 시료를 상온에서 16,100 G로 20분 동안 원심분리합니다. 원심분리가 끝나면 분홍색의 DNA 펠렛이 흐트러지지 않도록 주의하며 상층액을 조심스럽게 제거합니다.

마지막으로 500 µL의 70% ethanol을 넣어 세척하고, 부드럽게 반전 혼합한 후 16,100 G에서 5분 동안 원심분리합니다. 상온에서 상층액을 제거하고 튜브를 뒤집어 펠렛을 5분 동안 건조합니다. 이렇게 하면 표지된 CDNA를 하이브리드화에 사용할 수 있습니다.

하이브리다이제이션을 시작하기 전, NimbleGen 하이브리다이제이션 시스템의 전원을 켜고 42 °C로 평형을 맞춥니다. 먼저 라벨링된 CD NA 펠릿을 5 µL의 nuclease-free water에 녹여 용해된 펠릿을 준비합니다. 동봉된 서면 프로토콜에 명시된 대로, Roche NimbleGen Hybridization 키트의 하이브리다이제이션 구성 요소인 Hybridization buffer hybrid A와 alignment oligo를 추가하여 최종 부피를 18 µL로 맞춥니다.

잘 혼합한 후 튜브를 짧게 원심 분리하여 내용물을 바닥에 모읍니다. 다음으로 튜브를 95 °C에서 5분 동안 유지하여 표지된 cDNA를 변성시킵니다. 어레이가 준비될 때까지 튜브를 즉시 NimbleGen 하이브리다이제이션 시스템으로 옮깁니다.

마이크로어레이는 세심한 취급과 보관이 필요함에 유의하십시오. Roche nimble gen 어레이는 실온에서 건조제와 함께 암소에 보관합니다. 정밀 믹서 정렬 도구에 어레이를 장착하십시오.

PMA T의 X 1 믹서에 PMA T 부하량을 넣고 핀셋으로 접착 스트립을 제거합니다. 어레이와 믹서가 장착되면 PMA T를 단단히 닫습니다. 그다음 PMA T의 구멍을 통해 믹서에 압력을 가하여 어레이와 믹서를 PMA T에서 분리합니다.

마지막으로, 브라이어(brayer)를 사용하여 믹서의 바깥쪽 주변에 압력을 가해 어레이가 밀폐되었는지 확인하고 기포를 제거합니다. 다음으로, cDNA 샘플을 어레이에 로딩하기 위해 어레이 믹서 복합체를 하이브리다이제이션 시스템에 올려 가온합니다. 변위 펌프를 천천히 일정한 압력으로 사용하십시오.

표지된 샘플 15 µL를 믹서 중앙의 충전 포트에 넣습니다. 포트 구멍에서 넘친 과잉 샘플을 닦아내고 접착 스트립으로 밀봉합니다. 그런 다음 래치를 닫습니다.

이제 nimble gen 하이브리드 시스템의 프로그램 B를 사용하여 하이브리드 용액을 혼합하기 시작합니다. 마이크로어레이가 16~20시간 동안 하이브리드화되도록 둡니다. 하이브리드화가 거의 완료되면 마이크로어레이를 세척하고 스캔합니다. gene picks 4,000 B 어레이 스캐너의 전원을 켜고 약 15분 동안 예열하여 스캔을 준비합니다.

다음으로, 동봉된 서면 프로토콜에 명시된 대로 세척 버퍼 1A, 1B, 2 및 3을 준비합니다. 세척 버퍼 1A는 42 °C로 예열하고, 나머지 버퍼들은 실온 상태로 둡니다. 세척 버퍼 1A가 예열되면 이를 디시에 붓습니다.

슬라이드 랙을 세척 버퍼 1 B에 담급니다. 이제 nimble gen 하이브리다이제이션 시스템에서 어레이 믹서 복합체를 분리하여 지그에 밀어 넣습니다. 미리 데워둔 세척 버퍼 1 A에 어셈블리를 담가 세척을 시작하고, 슬라이드에서 떼어내듯 조심스럽게 믹서를 제거합니다. 그런 다음 지그에서 어레이를 꺼내 세척 버퍼 1 A에서 15초 동안 흔들어 줍니다. 어레이를 세척 버퍼 1 B에 담긴 슬라이드 랙으로 빠르게 옮긴 후, 슬라이드 랙을 2분 동안 세게 흔듭니다.

그런 다음 슬라이드 랙을 세척 완충액 2로 옮기고 1분 동안 흔들어 줍니다. 마지막으로, 슬라이드 랙을 세척 완충액 3로 옮기고 15초 동안 흔들어 줍니다. 어레이를 슬라이드 건조 원심분리기로 옮겨 2분 동안 회전시킨 후 원심분리를 마쳐 세척 과정을 종료합니다.

D는 빛과 오존에 민감하므로 즉시 어레이를 스캔하십시오. 어레이 바코드가 아래로 향하게 하여 gene picks 4, 000 B 어레이 스캐너에 로드하고 스캔을 시작합니다. 하드웨어 설정 대화 상자에서 532 nanometer 레이저의 PMT 값을 500으로 설정하고, 전력을 100%, 픽셀 크기를 5 microns, 평균화할 라인 수를 1로, 초점 위치를 0 microns로 설정하십시오. 설정이 완료되면 어레이를 미리 보기 합니다.

스캔할 영역을 선택한 후 스캔하십시오. 스캔이 완료되면 이미지 히스토그램을 확인하십시오. 이상적으로는 $1 \times 10^{-5}$ 정규화 카운트가 65,000 포화 한계에 도달해야 하며, 이는 특징점의 약 1~2%가 포화되었음을 의미합니다.

정규화된 카운트(normalized counts)가 1 E-5보다 작으면 PMT 게인을 높이고 슬라이드를 다시 스캔하십시오. 정규화된 카운트가 1 E-5보다 크면 PMT 게인을 낮추고 슬라이드를 다시 스캔하여 이미지를 저장한 후, 데이터 분석 프로그램을 사용하여 데이터 정규화 및 강도 값(intensity values)을 계산하십시오. 표지 반응을 통해 통상적으로 최소 10 µg의 표지된 cDNA를 얻을 수 있습니다.

염료 통합도는 단순 염료 기준 비율을 사용하여 계산할 수 있으며, 여기서 뉴클레오타이드 대 SI 3 비율은 A 2 60 대 A 5 50 비율에 23.15를 곱한 값과 같습니다. 반응이 양호할 경우 50에서 80 사이의 값이 나타납니다. 수용 가능한 수준의 하이브리다이제이션에서는 특징들의 1~2%가 포화되어 결과가 도출됩니다.

65,000 포화 제한 시 1 E-5 정규화된 카운트입니다. PMT 값을 500 근처로 설정한 후, 마이크로어레이의 스캔 이미지를 확인하여 정렬된 올리고(oligo)의 강도를 어레이 내의 다른 피처들과 비교함으로써 하이브리다이제이션 품질을 정성적으로 평가할 수 있습니다. 또한, 스캔 이미지에서 어레이 영역 내에 특정 반점이나 먼지 입자가 있는지 확인해야 합니다.

이후 분석에서는 산점도를 사용하여 분석 데이터를 시각화함으로써 샘플 간의 상대적인 유전자 발현 수준을 결정하고 차별적으로 발현되는 유전자를 식별할 수 있습니다. 차별적으로 발현되는 유전자는 최적 적합선에서 크게 벗어나게 됩니다. 보완적인 절차로서, 앞서 제브라피쉬 배아에서 RNA를 추출하여 cDNA를 합성하는 방법을 보여드렸습니다. 여기서는 글로벌 유전자 발현 프로파일을 연구하기 위해 cDNA를 표지하고 올리고뉴클레오타이드 마이크로어레이 플랫폼에 하이브리드화하는 방법을 설명하였습니다.

본 절차를 수행할 때는 항상 고품질의 CD NA를 사용하고, 세 가지 염료가 도포된 부위가 직사광선에 노출되지 않도록 주의하십시오. 이것으로 모든 설명을 마치겠습니다. 시청해 주셔서 감사하며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.