Name: Zebrafish Oligonucleotide Microarray의 플랫폼을 사용하여 글로벌 유전자 발현 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-10T00:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 14 s
Description: 배우세요 제브라피시 올리고뉴클레오타이드 마이크로어레이를 이용한 전사체 발현 프로파일링 방법을. 형광 표지된 cDNA 하이브리다이제이션 및 스캐닝 과정을 통해 유전자 발현 수준을 정량적으로 분석할 수 있습니다.

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1 부 : cDNA의 형광 라벨링 microarray 실험에 사용된 Cy3 염료는 사진 저하에 민감합니다. 절차는 빛의 최소한의 자리를 차지할 것입니다. 라벨 프로토콜은 BioPrime 배열 CGH의 게놈 라벨 시스템 매뉴얼 1 적응했다. <ol><li> 라벨 반응에 대한 시약은 -20 ° C.에 저장됩니다 BioPrime 배열 CGH의 게놈의 라벨링 시스템 해동 2.5X 랜덤 프리머 버퍼, 10X dCTP 믹스, 그리고 nuclease없는 물. 또한 Cy3 - dCTP 염료를 녹여. 해동 후, 간단히 사용하기 전에 모든 시약을 원심 분리기. </li><li> 별도의 레이블 반응 분석 각 cDNA 샘플에 대해 완료해야합니다. 0.6 ML 두꺼운 벽으로 둘러싸인 튜브에 86 μl의 총 볼륨을 달성하기 위해 cDNA 500 NG, 40 μl 2.5X 랜덤 프리머 버퍼와 nuclease없는 물을 추가합니다. </li><li> 잘 믹스하고 짧게 원심 분리기. 100 5 분 반응 ° thermocycler에서 C를 품어. </li><li> 즉시 10 분 동안 얼음 목욕 슬러리에 반응을 전송합니다. </li><li> 각각의 튜브하려면 다음 10 μl 10X dCTP 믹스, 2 μl 1 ㎜ Cy3 - dCTP와 2 μl의 DNA 엑소 Klenow 효소를 추가합니다. 엑소 Klenow DNA의 효소가 필요 때까지 냉장고에 남아 있어야하며 항상 얼음에 보관해야합니다. </li><li> 잘 반응을 혼합하고 간단히 원심 분리기. </li><li> thermocycler 16 시간 동안 37 ° C에서 반응을 품어. </li></ol> 2 부 : 라벨 cDNA의 강수량 <ol><li> NimbleGen의 하이브리드화 시스템에서 프로토콜 차례로 계속하고 시스템이 42 ° C.에 평형 수 있도록하기 전에 </li><li> 각 반응 들어, 1.5 ML 튜브에 Microcon 열을 넣으십시오. 라벨 반응 (100 μl)의 내용을 다음 각 열의 300 μl 0.1X SSC를 추가합니다. </li><li> 4 10 분 16,100 XG에있는 열을 포함하는 튜브 ° C.를 원심 분리기 </li><li> 컬러로 약간 핑크색 수 있으며, 컬럼에 다른 300 μl 0.1X SSC를 추가할 수 있습니다 통해 흐름을 삭제. </li><li> 4 10 분 16,100 XG에서 원심 분리를 반복 ° C. </li><li> 을 통해 흐름을 취소하고 열 추가 300 μl 0.1X SSC를 추가합니다. </li><li> 4 12 분 16,100 XG에 원심 분리기 ° C. </li><li> 을 통해 흐름을 폐기하십시오. 을 통해 흐름이 마지막으로 씻고 나서 명확해야하고,이 칼럼에서 분홍색 표시 cDNA를 볼 수 있어야합니다. </li><li> 열 100 μl nuclease 무료 물을을 적용합니다. 1.5 ML 튜브에서 열을 제거하고 새로운 1.5 ML 튜브에 열을 반전. </li><li> 4 2 분 2,300 XG에 원심 분리기 ° C. 분류 cDNA는 튜브의 아래쪽에 수집 물 속에 rehydrated해야합니다. </li><li> DNA 농도를 계산하고 Cy3 비율 뉴클레오 티드가 23.15 곱한 260 / 550 비율을 동일 어디 비율을 염색하는 기지를 계산하여 염료 정관을 평가하는 제조 업체의 지시에 따라 NanoDrop ND - 1000 분광 광도계를 사용합니다. 염색 비율 기지 50 80 사이 여야합니다. </li><li> cDNA 충분한 표시된 경우 경우의 나누어지는 6 μg는 새로운 1.5 ML 튜브로 cDNA 표시. </li><li> 3 M NaOAc, 산도 5.2의 0.1X 볼륨과 이소프로판올 1X 볼륨에 섞는다. 혼합물은 실온에서 30 분 어둠 속에 품어 수 있습니다. </li><li> 다음 실온에서 20 분 동안 16,100 XG에서 샘플을 원심 분리기. </li><li> 컬러 핑크되어야 DNA 펠렛을 방해하지 않고 표면에 뜨는를 주의깊게 폐기. </li><li> 500 μl 70 % EtOH 부드러운 역전의 믹스를 추가하여 에탄올 세척을 수행합니다. </li><li> 실온에서 5 분간 16,100 XG에 샘플을 원심 분리기. </li><li> 튜브 반전, 표면에 뜨는를 제거하고, 펠릿 5 분 동안 건조하실 수 있습니다. 이 단계에서는 펠렛은 -20에 저장될 수 있습니다 ° C 원하는 또는 프로토콜 하이브 리다이 제이션 단계로 계속 수있는 경우. </li></ol> 파트 3 : 하이브 리다이 제이션 하이브 리다이 제이션 절차는 유전자 발현 분석 2 로체 NimbleGen 배열 사용자 가이드에서 적응됩니다. <ol><li> nuclease - 무료 물 5 μl의 펠렛을 디졸브. </li><li> 일단 펠렛은 표 1에 나열된 하이브 리다이 제이션 구성 요소를 추가 해산합니다. 하이브 리다이 제이션 구성 요소는 로체 NimbleGen의 하이브 리다이 제이션 키트에서입니다. 모든 구성 요소가 추가되면 전체 볼륨이 18 μl 총해야합니다. 잘 믹스하고 간략하게 아래에있는 내용을 수집하기 위해 튜브를 스핀. </li><li> 다음 단계는 5 분 동안 95 ° C에서 열 블록에 배치하여 표시 cDNA를 변성하는 것입니다. </li><li> 배열은 다음 단계에서 준비하는 동안 즉시 NimbleGen의 하이브리드화 시스템에 튜브를 전송합니다. </li><li> Microarrays는 항상 신중하게 처리하고 제조 업체의 지침에 따라 보관해야합니다. 로체 NimbleGen는 실온에서 건조와 함께 어둠 속에서 자신의 표현의 배열을 저장하는 것이 좋습니다. </li><li> NimbleGen 배열 처리 액세서리에서 제공하는 정밀 믹서 정렬 도구 (PMAT)에 배열을로드합니다. </li> &lt;리&gt;는 PMAT에 X1 믹서를로드하고 집게와 접착 스트립을 제거합니다. 안전 PMAT를 닫습니다. PMAT에있는 구멍을 통해 믹서에 압력을 적용 천천히 배열 믹서는 PMAT에서 공격을 수 있도록 엽니다. </li><li> 단단히 배열에 인감을 위해 믹서의 외부 주위 브레 이어와 압력을 적용 완료하고 거품을 제거합니다. 따뜻하게 하이브 리다이 제이션 시스템에 배열 믹서 복잡한를 놓습니다. </li><li> 변위 피펫을 사용하여 천천히 입력 포트에 표시된 샘플의 15 μl를 추가합니다. 이것은 믹서의 중심에있는 구멍이다. 샘플 어떤 기포없이 믹서를 통해 균일하게 확산되도록 피펫으로 느리고 꾸준한 압력을 적용합니다. 포트 구멍에서 초과 샘플을 닦아 및 접착제 스트립과 포트 구멍을 밀봉. </li><li> 래치를 닫고 NimbleGen의 하이브리드화 시스템에서 프로그램 B를 사용하여 하이브 리다이 제이션 솔루션의 혼합 시작합니다. microarrays은 16-20시간에 대한 잡종 수 있습니다. </li></ol> 4 부 : 포스트 하이브 리다이 제이션 세척 및 Microarray의 스캔 세탁 및 검사 절차는 유전자 발현 분석 2 로체 NimbleGen 배열 사용자 가이드에서 적응됩니다. <ol><li> 일단 하이브 리다이 제이션은 표 2에 제시된 세척 버퍼를 준비 완료 근처​​에 있습니다. 42 미리 따뜻하게 씻으 버퍼 IA ° C 물 목욕 인치 </li><li> GenePix 4000B 배열 스캐너 전원을 켜고 스캐너를 사용하기 전에 약 15 분 동안 따뜻한하실 수 있습니다. </li><li> 접시에 미리 따뜻하게 씻으 버퍼 IA 하거라. </li><li> 치구 (NimbleGen 배열 처리 액세서리로 제공)에 NimbleGen의 하이브리드화 시스템과 슬라이드에서 배열 믹서 복잡한를 제거합니다. 잠수함의 미리 따뜻하게 씻으 버퍼 IA에 조립 조심스럽게 거리 슬라이드에서 필링하여 믹서를 제거합니다. </li><li> 와시 버퍼 아이오와에서 15 초 동안 지그과 선동의 배열을 제거합니다. </li><li> 신속하게 실내 온도 와시 버퍼 IB의 슬라이드 선반에 배열을 전송합니다. 이분에 대해 적극적으로 슬라이드 선반을 선동하다. </li><li> 와시 버퍼 II에 슬라이드 랙을 전송하고 1 분 선동. </li><li> 15 초간 씻으 버퍼 III와 선동에 슬라이드 선반을 전송합니다. </li><li> 원심 분리기를 건조 슬라이드로 배열을 전송하고 모든 수분을 제거하는 2 분 돌린다. 스캔을 진행합니다. </li><li> 이것은 염료는 빛과 오존에 모두 민감한이기 때문에 즉시 배열을 검사하는 것이 좋습니다. </li><li> GenePix 4000B 배열 스캐너로, 아래로 배열, 바코드를로드합니다. </li><li> GenePix Pro 소프트웨어를 열고 배열의 스캔을 진행합니다. 로체 NimbleGen 유전자 표현 배열 한 색상 하이브 리다이 제이션 전략을 사용합니다. 결과적으로 하나의 파장은 스캔이 필요합니다. 532 NM 레이저를 사용하여 Cy3 형광 신호를 검사합니다. 하드웨어 설정 대화 상자를 열고 500 값을 532 nm의 레이저의 PMT 값을 설정합니다. </li><li> 하드웨어 설정 대화 상자에서, 100 %, 픽셀 크기 5 미크론으로, 평균 1 라인, 전원을 설정하고 0 미크론으로 위치를 중점을두고 있습니다. </li><li> 미리보기 스캔을 수행하고 스캔 영역을 설정합니다. </li><li> 스캔 수행합니다. </li><li> 일단 스캔은 이미지 히스토그램을 확인 완료됩니다. 이상 적으로는 1E - 5 표준 카운트는 기능 ~ 1~2%가 포화되는 65,000 포화 제한 의미에서해야합니다. 표준 카운트가 1E - 5보다 적은 경우, PMT 이득과 다시 검색 슬라이드를 향상시킬 수 있습니다. 표준 카운트가 1E - 5보다 큰 경우, PMT 이득과 다시 검색 슬라이드를 감소. </li><li> 일단 스캔은 이미지를 저장 완료됩니다. 그것은 참조에 쉽게 이미지에 대한 표준 명명 규칙을 선택하는 것이 좋습니다. 이미지는 이제 데이터 정상화와 강도 값을 계산에 대한 환경의 데이터 분석 프로그램에 로드할 수 있습니다. </li></ol> 대표 결과 당신이 먼저 0.1X SSC와 세척을 시작하면 cDNA의 Cy3 형광 라벨 반응의 효율성을 평가하기 시작할 수 있습니다. 이후의 각 세척하는 동안을 통해 흐름은 분명 통해 최근 흐름과 색상이 덜 분홍색이 될 것입니다. 또한, Cy3 - 라벨 cDNA 제품이 세척 단계 동안 열을 표시해야합니다. 을 통해 흐름이 컬러 밝은 분홍색 또는 열을 핑크색 제품이 없다면, 이것은 상표 반응이 제대로 진행되지 않은 좋은 표시이다. 라벨 반응은 양적 염료 비율 (그림 1)에 표시 DNA와 기지의 농도를 결정하는 NanoDrop ND - 1000 분광 광도계를 사용하여 평가하실 수 있습니다. 레이블링 반응은 일상적으로 우리 연구실에 표시 DNA의 적어도 10 μg을 산출. 염료 법인은 Cy3 비율 뉴클레오 티드가 23.15 곱한 260 / 550 비율을 동일 간단한 기본 / 염료 비율을 사용하여 계산하실 수 있습니다. 50-80까지 값은 상표 반응에 충분한 염료 법인을 나타냅니다. 라벨 반응은 마이크에 DNA 또는 가난한 염료의 설립, 샘플 하이브 리다이 제이션의 낮은 농도를 산출하는 경우roarray 권장되지 않으며 라벨 반응은 반복해야합니다. 하이브 리다이 제이션의 품질 평가는 이미지 히스토그램 및 microarray의 스캔 이미지 (그림 2) 평가 실시하실 수 있습니다. 허용 hybridizations은 포화 기능 1-2 % (즉, 항복을 1E - 5 65,000 채도 제한에서 표준 계산)이 포함됩니다 500 근처에 설정된 PMT 값을. PMT 값을 65,000 채도 제한에 1E - 5 표준 계산을 달성하기 위해 500부터 대폭 조정해야있다면, 이것은 일반적으로 microarray에 표시된 cDNA의 가난한 하이브 리다이 제이션을 나타냅니다. 이 데이터는 이후의 분석을 통해 지속적인 경우에는 데이터 품질로 구성됩니다. 하이브리드화 품질도 질적으로 스캔 배열 (그림 3)의 이미지를 보면 평가하실 수 있습니다. 로체 NimbleGen의 하이브 리다이 제이션 키트 정렬 oligo의의 혼합 Cy3와 배열에 정렬 기능을 잡종 Cy5 - 라벨 48mer oligonucleotides가 포함되어 있습니다. 배열의 다른 기능에 대한 정렬 oligos의 강도의 질적 평가는 배열에 찬란 레이블 cDNA의 하이브리드화 효율에 대한 품질 검사를 허용합니다. 자세한 분석에 따라, 귀하의 분석 데이터의 스캐터 플롯은 유전자 발현의 상대적 수준을 결정하고 differentially하여 샘플 (그림 4) 사이에 표현됩니다 유전자를 식별하는 데 사용할 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/1471/1471figure1thumb.jpg" alt="그림 1의 축소판 이미지" /> 그림 1. cDNA Cy3와 함께 표시. 라벨 cDNA 수율 및 염료의 정관에서 NanoDrop 스펙트럼은 NanoDrop ND - 1000 분광 광도계를 사용하여 평가하실 수 있습니다. 하시기 바랍니다 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1471/1471figure1.jpg">여기를 클릭</a> 그림 1의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/1471/1471figure2thumb.jpg" alt="그림 1의 축소판 이미지" /> 그림 2. 하이브 리다이 제이션의 microarray 검사합니다. 품질 GenePix 히스토그램은 이미지 히스토그램을 평가하여 평가하실 수 있습니다. 허용 hybridizations 500 근처에 설정된 PMT 값을 65,000 채도 제한에 1E - 5 표준 계산과 포화 기능이 1-2 %를해야합니다. 하시기 바랍니다 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1471/1471figure2.jpg">여기를 클릭</a> 그림 2의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/1471/1471figure3.jpg" border="0" alt="그림 3" /> 그림 3. 스캔 microarray 이미지. 하이브리드화 품질은 microarray의 스캔 이미지를 보면 평가하실 수 있습니다. 이미지가 기능의 형광 강도의 정확한 계산을 방지하므로 먼지 또는 각 기능의 시각화를 금지 기타 방해 요인의 존재에 대한 검사해야합니다. 정렬 oligos의 강도는 하이브 리다이 제이션 효율성을 평가하기 위해 배열의 다른 기능을 비교할 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/1471/1471figure4.jpg" border="0" alt="그림 4" /> 그림 4. 분석 microarray 실험의 스캐터 줄거리.이 절차의 목적은 differentially 귀하의 샘플에 표현됩니다 유전자를 식별하는 것입니다. Microarray 데이터가 추가로 분석하고 differentially 표현 유전자를 시각화하는 스캐터 플롯에서 볼 수 있습니다. 표 1. 로체 NimbleGen의 하이브 리다이 제이션 키트의 구성 요소 하이브 리다이 제이션 2 단계에 대한 추가합니다. <table border="1"><tbody><tr><td> 구성 요소 </td><td> 음량 </td></tr><tr><td> 샘플 (물속에 녹아있는) </td><td> 5 μl </td></tr><tr><td> 2X 하이브리드화 버퍼 </td><td> 9 μl </td></tr><tr><td> Hyb </td><td> 3.6 μl </td></tr><tr><td> 정렬 Oligo </td><td> 0.4 μl </td></tr><tr><td> 총 부피 </td><td> 18 μl </td></tr></tbody></table> 표 2. 하이브리드화 다음과 같은 배열의 세척에 대비하기 위해 버퍼를 씻으십시오. <table border="1"><tbody><tr><td> 구성 요소 </td><td> 와시 버퍼 IA * </td><td> 버퍼 IB 와시 </td><td> 와시 버퍼 II </td><td> 와시 버퍼 III </td></tr><tr><td> 물 </td><td> 225 ML </td><td> 225 ML </td><td> 225 ML </td><td> 225 ML </td></tr><tr><td> 10X 워시 버퍼 I, II, III 또는 </td><td> 25 ML </td><td> 25 ML </td><td> 25 ML </td><td> 25 ML </td></tr><tr><td> 1 M DTT </td><td> 25 μl </td><td> 25 μl </td><td> 25 μl </td><td> 25 μl </td></tr><tr><td> 총 부피 </td><td> 250 ML </td><td> 250 ML </td><td> 250 ML </td><td> 250 ML </td></tr></tbody></table> 42 * 사전 따뜻한 ° C

<ol><li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22BioPrime+Array+CGH+Genomic+Labeling+System+Manual%22">BioPrime Array CGH Genomic Labeling System Manual</a>. , Version C. (2004).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Roche+NimbleGen+Arrays+User%27s+Guide+for+Gene+Expression+Analysis%22">Roche NimbleGen Arrays User's Guide for Gene Expression Analysis</a>. , Version 3 (2008).</li>
</ol>

여기에 자세한 사람 등 많은 microarray 프로토콜은 하이브 리다이 제이션을 측정하고 quantifying의 수단으로 형광 염료를 사용합니다. Cy3 형광 염료는 사진 및 오존 파괴에 민감합니다. 이것은 프로 시저가 최소한의 조명을 실시하는 것이 좋습니다. 또한, 작은 먼지 입자는 하이브 리다이 제이션 및 스캔을 방해할 수 있습니다. 특별한주의는 작업 지역 깨끗하고 먼지에서 무료로 있는지 확인하기 위해 제공해야합니다. 이 절차에서 설명하는 라벨 프로토콜 많은 대안이 있습니다. 이것은 다양한 라벨 프로토콜은 각 특정 표현 microarray 플랫폼을위한 최적의 분류 절차를 확인하기 위해 테스트하는 것이 좋습니다. 절차 여기서 보여주는 로체 NimbleGen에 의해 인쇄된 특정 표현 어레이 플랫폼에 최적화되었습니다. 또한, 우리는 똑같이뿐만 아니라 일할 수있는 로체 NimbleGen 어레이 사용자 안내서에 설명된 상표 프로토콜을 발견했다. 하이브 리다이 제이션 속성 크게 플...

<table><tbody><tr><td>어레이 마이크로원심분리기 건조기</td><td>ISC Bioexpress</td><td>C-1303-T</td><td></td></tr><tr><td>BioPrime Array CGH 게놈 표지 시스템</td><td>Invitrogen</td><td>18095-011</td><td></td></tr><tr><td>Cyanine 3-dCTP</td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>NEL576</td><td></td></tr><tr><td>GenePix 4000B</td><td>Molecular Devices</td><td>GENEPIX 4000B</td><td></td></tr><tr><td>Microcon YM-30</td><td>EMD Millipore</td><td>42411</td><td></td></tr><tr><td>NimbleGen 어레이 처리 액세서리</td><td>Roche Group</td><td>5223539001</td><td></td></tr><tr><td>NimbleGen 하이브리다이제이션 키트</td><td>Roche Group</td><td>5223474001</td><td></td></tr><tr><td>NimbleGen 하이브리다이제이션 시스템 4</td><td>Roche Group</td><td>5223652001</td><td></td></tr><tr><td>NimbleGen 세척 완충액 키트</td><td>Roche Group</td><td>5223504001</td><td></td></tr><tr><td>X1 믹서</td><td>Roche Group</td><td>5223725001</td><td></td></tr></tbody></table>

zebrafish oligonucleotide microarray의 플랫폼을 사용하여 글로벌 유전자 발현 분석

Global Gene Expression Analysis Using a Zebrafish Oligonucleotide Microarray Platform

진 microarray 기술은 게놈 전체의 기준으로 명시 수준의 양적 측정과 유전자 발현 프로 파일링을 수 있습니다. 유전자 microarray 기술은 질병 상태로 발달 단계와 관련하여 세계적인 유전자 발현 분석을 포함한 다양한 응용 프로그램에서 다양한 생물 학적 분야에 사용하고, 독성 반응 인치입니다 여기에, 우리는 포괄적인 zebrafish 특정 oligonucleotide microarray의 플랫폼을 사용하여 글로벌 유전자 발현 분석의 데모를 포함합니다. zebrafish의 표현 microarray 플랫폼은 목표 당 12 프로브까지와 37,157 목표를 심문 385,000 프로브, 길이 60 기본 쌍을 포함하고 있습니다. 이 플랫폼은 zebrafish에 대해 사용할 수있는 모든 cDNA 및 게놈 정보는 Ensembl (http://www.ensembl.org), 베가 (http://vega.sanger.ac.uk), UCSC (포함한 다양한 게놈 데이터베이스에서 수집되었습니다 http://genome.ucsc.edu) 및 ZFIN (http://www.zfin.org). 결과적으로이 표현 배열은 현재 zebrafish의 transcriptome의 완전한 혜택을받을 수 있습니다. zebrafish의 표현 microarray는 로체 NimbleGen (매디슨, WI)에 의해 인쇄되었다. 이 기술 데모는 형광 cDNA 제품의 라벨, microarray 플랫폼에 표시된 제품의 cDNA 하이브 리다이 제이션, 그리고 한 색상 분석 전략을 사용하여 신호 획득을위한 배열 검사를 포함합니다.

유전자 microarrays는 게놈 전체의 수준에서 유전자 발현 프로 파일링에 강력한 도구입니다. 이 기술은 발달 생물학 및 독성학을 포함한 생물 학적 다양한 분야에 응용 프로그램을하고 있습니다. 이 비디오에서는, 우리는 세부 zebrafish에 대한 포괄적인 oligonucleotide microarray의 플랫폼을 사용하여 글로벌 유전자 발현 분석을위한 프로토콜을.

Zebrafish Oligonucleotide Microarray의 플랫폼을 사용하여 글로벌 유전자 발현 분석

유전자 마이크로어레이 기술을 통해 게놈 전체 수준에서 전사체 수치에 대한 정량적 측정 및 유전자 발현 프로파일링이 가능합니다. 유전자 마이크로어레이는...

본 절차는 고품질 RNA 템플릿으로부터 합성된 cDNA로 시작합니다. 먼저 cDNA를 형광 염료 Cy3로 표지합니다. 표지 반응이 완료되면 표지된 cDNA를 정제 및 분리하고, 표지 반응의 품질을 평가합니다.표지된 cDNA를 마이크로어레이에 하이브리드화합니다. 하이브리드화 후, 어레이를 분석하여 샘플 내 유전자 발현의 상대적 수준을 결정합니다. 안녕하세요, 저는 퍼듀 대학교 보건과학대학 Jennifer Freeman 교수님 연구실의 Sam Peterson입니다.이전 단계에서 제브라피시 배아에서 RNA를 추출하고 이를 cDNA로 전환하는 방법을 살펴보았습니다. 오늘은 전반적인 유전자 발현 프로파일을 연구하기 위해 해당 cDNA를 라벨링하고 제브라피시 올리고뉴클레오타이드 마이크로어레이 플랫폼에 하이브리드화하는 절차를 보여드리겠습니다. 일반적으로 이 절차는 독성 물질 노출에 따른 유전자 발현의 차이를 연구하는 데 사용됩니다.이제 시작하겠습니다. 마이크로어레이 실험은 라벨링에 사용되는 형광 염료 Cy3의 광분해를 방지하기 위해 최소한의 빛 환경이 필요합니다. cDNA 라벨링을 시작하기 위해 BioPrime Array CGH Genomic Labeling System의 다음 구성 요소인 2.5x random primer buffer, 10X dCTP mix, nuclease-free water를 녹입니다. 또한, 1 mM stock의 Cy3 labeled dCTP를 녹입니다. 해동 후, 시약을 짧게 원심 분리하여 0.6 mL thick-walled tube에 혼합합니다.500 ng의 cDNA 40 µL, 2.5 x random primer buffer 및 nuclease free water를 첨가하여 총 부피를 86 µL로 맞춥니다. 잘 섞은 후 짧게 원심 분리하고, 서모사이클러(thermocycler)에서 100 °C로 5분 동안 반응시킵니다. 배양이 끝나면 즉시 반응물을 얼음물 슬러리에 옮겨 10분 동안 유지합니다.다음으로, exo DNA polymerase를 냉동고에서 꺼내 얼음에 둡니다. 그런 다음 반응 튜브에 10 X-D-C-T-P Mix 10 µL, 1 mM SI 3D CTP 2 µL, 그리고 XO cleanout DNA polymerase 2 µL를 첨가한 후 잘 섞고 짧게 원심 분리합니다. 마지막으로, 반응물을 37 °C에서 16시간 동안 배양하며, 라벨링이 완료되면 써모사이클러를 사용합니다.표지된 cDNA를 정제하고 침전시키는 과정을 진행합니다. 표지된 cDNA의 정제를 시작하기 위해, MicroCon 컬럼을 1.5 milliliter 튜브에 넣습니다.컬럼에 0.1 XSSC 300 µL를 넣은 다음 라벨링 반응물을 추가합니다. 4 °C에서 16,100 ×g로 10분 동안 컬럼을 원심분리합니다. 통과액(flow through)이 연분홍색을 띨 수 있음에 유의하십시오.통과액을 버리고 컬럼에 0.1 X SSC 300 µL를 추가합니다. 그다음 4 °C에서 16,100 G로 10분 동안 원심분리를 반복합니다. 다시 통과액을 버리고 컬럼에 0.1 X SSC 300 µL를 추가한 후, 이 마지막 세척 단계에서 4 °C, 16,100 G로 12분 동안 원심분리합니다.통과액은 투명해야 하며, 분홍색으로 라벨링된 CDNA가 컬럼에 보여야 합니다. 다시 한번, 라벨링된 CD NA를 용출시키기 위해 이 마지막 세척 단계의 통과액을 버립니다. 컬럼에 100 µL의 nuclease-free water를 추가합니다. 마이크로 원심분리 튜브에서 컬럼을 꺼내 새 튜브에 거꾸로 세웁니다.그다음, 뒤집힌 컬럼을 4°C에서 2,300 G로 2분 동안 원심분리합니다. 라벨링된 cDNA는 튜브 바닥의 물에 용해됩니다. 제조사의 지침에 따라 NanoDrop ND 1000 분광광도계를 사용하여 해당 cDNA를 확인합니다.동봉된 서면 프로토콜에 기술된 대로 DNA 농도를 계산하고 염료 결합 상태를 평가하십시오. cDNA가 충분히 라벨링되었다면, 6 µg의 cDNA를 새 튜브에 넣고 pH 5.2의 3 M sodium acetate 0.1배 부피와 1배 부피의 Isopropanol을 가하여 라벨링된 cDNA 혼합물을 침전시킨 후, 실온의 암소에서 30분 동안 배양하십시오.지금까지의 모든 단계가 최소 광량 환경에서 수행되었음을 유념하십시오. 그런 다음 시료를 실온에서 16,100 G로 20분간 원심분리합니다. 원심분리 후, 분홍색의 DNA 펠릿이 손상되지 않도록 주의하며 상층액을 조심스럽게 제거합니다.마지막으로 500 µL의 70% ethanol을 첨가하여 세척하고, 부드럽게 반전 혼합한 후 16,100 G에서 5분 동안 원심분리합니다. 상온에서 상층액을 제거하고 튜브를 뒤집어 펠렛을 5분 동안 건조시킵니다. 이렇게 하면 라벨링된 CDNA가 하이브리다이제이션 준비가 완료됩니다.하이브리다이제이션을 시작하기 전, nimble gen 하이브리다이제이션 시스템의 전원을 켜고 42 °C가 될 때까지 평형을 맞춥니다. 먼저 nuclease free water 5 µL에 표지된 CD NA 펠렛을 녹입니다. 동봉된 서면 프로토콜에 명시된 대로 Roche Nimble Gen Hybridization kit의 하이브리다이제이션 구성 성분인 Hybridization buffer hybrid A와 alignment oligo를 추가하여 총 부피를 18 µL로 맞춥니다.잘 섞어준 후, 튜브를 짧게 원심분리하여 내용물을 바닥에 모읍니다. 다음으로, 튜브를 95 °C에서 5분 동안 유지하여 표지된 cDNA를 변성시킵니다. 어레이 준비가 완료될 때까지 튜브를 즉시 NimbleGen 하이브리다이제이션 시스템으로 옮깁니다.마이크로어레이는 세심한 취급과 보관이 필요함에 유의하십시오. Roche nimble gen 어레이는 실온에서 건조제와 함께 암소에 보관합니다. 정밀 믹서 정렬 도구(precision mixer alignment tool)에 어레이를 장착하십시오.PMA T에 X one 믹서를 장착하고 포셉을 사용하여 접착 스트립을 제거합니다. 어레이와 믹서가 장착되면 PMA T를 단단히 닫습니다. 다음으로, PMA T의 구멍을 통해 믹서에 압력을 가하여 어레이와 믹서를 PMA T에서 분리합니다.마지막으로, 브레이어(brayer)를 사용하여 믹서 바깥쪽 주변에 압력을 가해 어레이가 밀폐되었는지 확인하고 기포를 제거합니다. 다음으로, cDNA 샘플을 어레이에 로딩하기 위해 어레이 믹서 복합체를 하이브리다이제이션 시스템에 올려 가온합니다. 디스플레이스먼트 펌프(displacement pump)를 사용하여 천천히 일정한 압력으로 주입하십시오.표지된 시료 15 µL를 믹서 중앙의 주입구에 넣습니다. 주입구 구멍 주변의 과잉 시료를 닦아내고 접착 스트립으로 밀봉합니다. 그다음 래치를 닫습니다.이제 nimble gen 하이브리다이제이션 시스템의 프로그램 B를 사용하여 하이브리다이제이션 용액을 혼합하기 시작합니다. 마이크로어레이를 16~20시간 동안 하이브리다이제이션 시킵니다. 하이브리다이제이션이 완료될 때쯤 마이크로어레이를 세척하고 스캔합니다. gene picks 4,000 B 어레이 스캐너의 전원을 켜고 약 15분 동안 예열하여 스캔을 준비합니다.다음으로, 함께 제공된 서면 프로토콜에 따라 세척 완충액 1 A, 1 B, 2 및 3을 준비합니다. 세척 완충액 1 A는 42 °C로 예열하고, 나머지 완충액은 실온 상태로 둡니다. 세척 완충액 1 A가 예열되면 이를 디쉬에 붓습니다.슬라이드 랙을 세척 완충액 1B에 담급니다. 이제 nimble gen 하이브리드화 시스템에서 어레이 믹서 복합체를 분리하여 지그(jig)에 밀어 넣습니다. 예열된 세척 완충액 1A에 어셈블리를 담가 세척을 시작하고, 슬라이드에서 떼어내듯 믹서를 조심스럽게 제거합니다. 그런 다음 지그에서 어레이를 분리하고 세척 완충액 1A에서 15초 동안 흔들어 줍니다. 어레이를 세척 완충액 1B에 담긴 슬라이드 랙으로 빠르게 옮기고, 슬라이드 랙을 2분 동안 강하게 흔들어 줍니다.그런 다음 슬라이드 랙을 세척 버퍼 2로 옮겨 1분 동안 흔들어 줍니다. 마지막으로, 슬라이드 랙을 세척 버퍼 3로 옮겨 15초 동안 흔들어 줍니다. 어레이를 슬라이드 건조 원심분리기에 넣고 2분 동안 회전시켜 원심분리를 수행함으로써 세척 과정을 마칩니다.D는 빛과 오존에 민감하므로 즉시 어레이를 스캔하십시오. 어레이의 바코드가 아래로 향하게 하여 gene picks 4, 000 B 어레이 스캐너에 로드한 후 스캔을 시작합니다. 하드웨어 설정 대화 상자에서 532 nanometer 레이저의 PMT 값을 500으로 설정하고, power를 100%, pixel size를 five microns, lines to average를 1, focus position을 0 microns로 설정하십시오. 설정이 완료되면 어레이를 미리 보기 합니다.스캔할 영역을 선택한 후 스캔하십시오. 스캔이 완료되면 이미지 히스토그램을 확인하십시오. 이상적으로는, 1E-5 정규화 카운트가 65,000 포화 제한값에 위치해야 하며, 이는 특징의 약 1~2%가 포화되었음을 의미합니다.정규화된 카운트(normalized counts)가 1 E-5보다 작으면, PMT 게인을 높이고 슬라이드를 다시 스캔하십시오. 정규화된 카운트가 1 E-5보다 크면, PMT 게인을 낮추고 슬라이드를 다시 스캔한 뒤 이미지를 저장하고, 데이터 분석 프로그램을 사용하여 데이터 정규화 및 강도 값 계산을 수행하십시오. 표지 반응을 통해 통상적으로 최소 10 µg의 표지된 cDNA가 생성됩니다.염료 결합률은 뉴클레오타이드 대비 SI 3 비율이 A 260 대비 A 550 비율에 23.15를 곱한 값과 같다는 간단한 기본 염료 비율을 사용하여 계산할 수 있습니다. 반응이 잘 이루어지면 50에서 80 사이의 값이 나타납니다. 허용 가능한 수준의 하이브리다이제이션(hybridization)은 특징점의 1~2%가 포화되어 나타납니다.65,000 포화 한계에서 1E-5 정규화된 카운트입니다. PMT 값이 500 부근으로 설정되면, 마이크로어레이의 스캔 이미지를 통해 정렬된 올리고뉴클레오타이드의 강도를 어레이 상의 다른 특징들과 비교함으로써 하이브리드화 품질을 정성적으로 평가할 수 있습니다. 또한 스캔 이미지를 통해 어레이 영역 내에 특정 반점이나 먼지 입자가 있는지 확인해야 합니다.이후 분석에서는 산점도를 사용하여 분석 데이터를 시각화함으로써 시료 내 유전자 발현의 상대적 수준을 결정하고 차등 발현되는 유전자를 식별할 수 있습니다. 차등 발현되는 유전자는 최적 적합선에서 크게 벗어난 값을 나타냅니다. 보완적인 절차로서, 앞서 제브라피쉬 배아에서 RNA를 추출하여 cDNA를 합성하는 방법을 설명해 드렸습니다. 여기서는 글로벌 유전자 발현 프로파일을 연구하기 위해 cDNA를 표지하고 올리고뉴클레오타이드 마이크로어레이 플랫폼에 하이브리드화하는 방법을 보여드렸습니다.이 절차를 수행할 때는 항상 고품질의 CD NA를 사용하고, 사이트 쓰리(site three) 염료가 직사광선에 노출되지 않도록 주의하십시오. 이것으로 모두 마치겠습니다. 시청해 주셔서 감사하며, 귀하의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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