Name: 단일 입자 수준에서 바이러스성 퓨전 속도론의 측정 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-07T16:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 59 s
Description: 학습하세요 단일 입자 수준에서 바이러스성 퓨전 속도론을 측정하는 이색 형광 분석법을 이용하여 hemifusion 및 기공 형성 동역학을 실시간으로 관찰하는 방법입니다. 이 기술은 항바이러스 전략 개발에 활용됩니다.

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작품은 NIH 교부금 AI57159 (SCH)을하고 AI72346 (AMvO)을 지원했다. SCH는 하워드 휴즈 의학 연구소의 탐정이다.

유리 커버 슬립 작용화 퓨전 분석에 사용되는 평면 이중층은 dextran의 수산화 필름에서 지원됩니다. Dextran은 평면 이중층과 유리 표면 사이에 스페이서 역할을합니다. 이것은 유리 표면에 붙어되는 것을 막 구성 요소를 방지할 수 있으며 바이러스 입자의 내용이 융합시 탈출 수있는에 공간을 제공합니다. 유리 coverslips 우리가 화학적으로 결합 dextran에 유리 (Elender, 외. 1996) 수 실란 에폭시와 치료를 통해 작용하고 있습니다. <ol><li> 세라믹 얼룩의 랙에 25mm coverslips을 마련하고, JAR 또는 비커에 선반을 배치. </li><li> 실험실 등급 유리 세제의 10 % 용액으로 컨테이너를 채웁니다. 30 분 초음파 청소기의 컨테이너를 놓습니다. </li><li> 1M postassium 수산화와 용기와 coverslip 걸이 탈이온수과 함께, 그리고 리필 린스. 다른 30 ​​분 동안 목욕 sonicator에 컨테이너를 반환합니다. </li><li> 아세톤과 에탄올을 사용하여 청소 절차를 반복합니다. </li><li> 물, 건조에 coverlips을 씻어. </li><li> 마지막으로, 3 분 산소 플라즈마 스트리퍼 coverslips를 청소하십시오. </li><li> 마지막 청소 단계는 다음 silanization 단계에있는 유리가 균일하게 친수성 ​​및 반응하고, 표면을 산화. </li><li> 이소프로판올 3 - glycidoxypropyltrimethoxy 실란의 0.2 % 용액을 준비합니다. 5 분 동안이 솔루션에 coverslips 젖어. </li><li> 실란 솔루션을 취소하고 이소프로판올에 coverslips 여러 번 씻어. </li><li> coverslips 지금 실란의 레이어 코팅 있지만, 그들은 유리에 covalently 결합하는 실란 수 있도록 치료해야합니다. 한 시간 만이라도 섭씨 27 도의 온도로 설정된 오븐에 coverslips를 놓습니다. </li><li> coverslips가 치료하는 동안, dextran 500 밖으로 무게와 30 % W / V 솔루션을 준비합니다. 물을 예열하면 해체를 지원합니다. 우리는 coverslip마다이 솔루션의 약 1 ML을 사용합니다. dextran이 해소되면, 진공 건조기에서 솔루션을 defoam. </li><li> silanized coverslips은 치료가 완료되면, 세라믹 랙에서 그들을 제거하고 플라스틱 냉동실 상자의 안쪽에 그들이 평평하게 주선해드립니다. dextran 솔루션 ~ 1 ML 각 coverslip의 상단 표면을 커버하기 위해 1 ML의 피펫을 사용합니다. 냉장고 상자를 닫고 24~36시간을위한 조용한 장소에 둡니다. </li><li> 플라스틱 집게로 coverslips 쥐고 있지만, 초과 dextran을 부어 및 세라믹 랙에 그들을 대체합니다. 물속에 coverslips 여러 번 씻어하고 coverslips는 48 시간 동안 물에 담그다 수 있습니다. 항아리는 부드럽게 테이블 톱 회전에 흥분 수 있습니다. </li><li> 80 섭씨와 진공 건조기에 저장하도록 설정 오븐에 coverslips 건조. </li></ol> 리포좀 준비 지원 지질 bilayers는 dextran 기능화 coverslip에 liposomes를 adsorbing에 의해 형성됩니다. 막 파열 및 표면에 평평하게 퍼져 때까지 둘은 서로 함께 adsorbed liposomes 퓨즈. <ol><li> 분석에 사용되는 일반적인 리포좀 제형은 1,2로 구성되어 dioleoyl - SN - glycero - 3 - phosphocholine (DOPC), 1 - oleoyl - 2 - palmitoyl - SN - glycero - 3 - phosphocholine (POPC), 콜레스테롤, 보빈 뇌 Disialoganglioside (GD 1A) 및 N - ((6 - (biotinoyl) 아미노) hexanoyl) 4:4:2:0.1:5의 비율 X10 -5에서 -1,2 - dihexadecanoyl - SN - glycero - 3 - phosphoethanolamine. 모든 구성 요소는 클로로포름 또는 클로로포름과 메탄올이 솔루션에 저장됩니다. </li><li> 유리 시험관에 각 구성 요소의 볼륨을 전송하여 지질의 두 micromoles을 포함하는 혼합물을 준비합니다. 아르곤 또는 질소 가스 스트림에서 용매를 증발. 두 시간 동안 진공 건조기에서 테스트 튜브를 떠나하여 남아있는 용매를 제거합니다. </li><li> HNE 버퍼 400 microliters (5 MM의 HEPES, 145 MM NaCl, 0.1 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산))에 말린 지질 필름을 Resuspend. </li><li> 플라스틱 microcentrifuge 관에 정지를 전송합니다. 온수 욕조에 액체 질소 욕조와 해동의 현탁액을 고정. 이 동결 / 해동 사이클에게 네 번 반복합니다. </li><li> 100 nm의 폴리 카보 네이트 막 필터와 지질 압출기를 조립하고, 지질 정지 25 번 돌출. 서스펜션은 압출 후 더 투명으로 나타납니다. </li><li> Liposomes은 그들이 준비하는 일에 사용해야합니다. 사용하기 전까지 그들은 상온에서 저장할 수 있습니다. </li></ol> Microfluidic 흐름 셀 준비 간단한 microfluidic 흐름 세포는 석영 슬라이드와 기능화 coverslip 사이의 이중 스틱 테이프를 sandwiching에 의해 이루어집니다. <ol><li> 20x20x3 mm 석영 슬라이드를 구합니다. 반대편에 두 1mm 구멍을 드릴 수있는 다이아몬드 버를 사용합니다. </li><li> 이중 스틱 테이프의 시트에서 20mm 광장 컷하고, 면도날을 사용하여 중앙에서 15 X 2mm 부분을 도려. </li><li> 하나 테이프 백업의 측면, 그리고 쿼트 테이프를 준수에서 필Z 슬라이드. 기능화 coverslip에 반대편을 준수합니다. </li><li> 폴리에틸렌 튜빙의 두 20cm 길이를 잘라 석영 슬라이드에있는 구멍에 그들을 삽입합니다. </li><li> 5 분 에폭시 접착제로 흐름 전지를 밀봉합니다. </li><li> 버퍼와 접착제가 치료가, 총리 흐름 전지 및 튜브. </li><li> 지원되는 지질 이중층은 채널로 리포좀 현탁액의 약 80 microliters를 그림으로써이 단계에서 형성된 수​​ 있습니다. </li></ol> 바이러스 입자 라벨 <ol><li> H3N2 인플루엔자는 (X - 31) 일반적으로 융합 분석에 사용하지만, 다른 독감 종자와 다른 바이러스가 성공적으로 사용되었습니다. </li><li> 바이러스는 hemifusion과 기공 - 형성의 검출을 허용하는 두 개의 서로 다른 형광 염료로와 표시됩니다. </li><li> 20 MM 솔루션을 만들기 위해 HNE 버퍼에 sulforhodamine B (SRB)을 디졸브. 바이러스 정지 10 microliters와 염료 용액 20 microliters을 결합, 20 시간 동안 실온에서 둡니다. 이 기간 동안 염료 천천히 바이러스 입자 내부에 축적됩니다. </li><li> PD - 10 탈염 칼럼을 통해 바이러스 현탁액을 통과하여 여분의 염료를 제거합니다. 충분한 바이러스 재료를 사용하는 경우, 컬러 밴드가 열에 볼 수 있습니다. 이 밴드는 레이블이 바이러스를 포함하고 그것이 eluted 그대로 수령하실 수 있습니다. </li><li> 어떤 밴드는 볼 수 없다면, 200 microliter의 분수를 수집하고 분광 광도계에서 565 nm의 흡수를 측정하여 바이러스로 분류가 포함되어있는 분수를 결정합니다. 바이러스는 약 0.8 ML의 총 볼륨 elute한다. </li><li> SRB 표시 바이러스 중지 octadecyl rhodamine 110 (Rh110C18)의 2 디메틸 포름 아미드 MM (DMF) 용액 13 microliters을 추가하여 바이러스 봉투 라벨. </li><li> 실험실 회전에 튜브를 장착하여 정지를 저어하고 3 시간 동안 둡니다. </li><li> 전에 설명한 것처럼 PD - 10 탈염 칼럼을 사용하여 초과 Rh110C18에서 바이러스를 정화. </li></ol> 현미경 구성 실험은 총 내부 반사 형광 현미경에 적합한 높은 NA 오일 침지 목적이 장착된 형광 현미경에서 수행됩니다. 아르곤 / 크립톤 가스 레이저에서 488 및 568 nm의 라인은 Rh110C18 및 SRB 라벨 바이러스를 자극하는 데 사용됩니다. 각 레이블의 동시 이미징은 분할 이색성 거울과 함께 녹색과 빨간색 형광 방출에 의해 성취와 독립적으로 전자 곱한 CCD 카메라 별도의 반쪽에 이미지를 집중하고있다. 어세 공연 표시 바이러스 입자 코팅 플루오레신와 표면, 낮은 산도 버퍼 (그림 1A)과 반응의 개시의 도킹, 평면 지질 이중층의 조립 : 퓨전 분석의 실행 흐름 세포 내에서 생화학 구성 요소 stepwise 어셈블리를 포함 . <ol><li> 현미경 단계에 흐름 세포를 탑재하고, 분당 40 microliters의 속도로 흐름으로 설정 주사기 펌프에 아웃렛 튜빙을 연결합니다. </li><li> HNE 300 microliters 흐르는 의해 초과 liposomes의 흐름 채널을 해제합니다. </li><li> 현미경을 집중하고 488 ​​nm의 라이트와 568 nm의 빛이 70 W / cm 2 350 W / cm 2 표면을 조명하는 레이저 파워를 조정합니다. 당신은 1.45 NA 60x 기름 침지 목표를 사용하는 경우에는 각각 100 마이크로 왓츠, 20 마이크로 왓츠 레이저 농도를 설정합니다. </li><li> 흐름 세포에 표시된 바이러스 (1 / 100 희석) 펌프. 바이러스가 유동 채널의 바닥 표면 diffuses으로 입자는 지질 이중층에 통합 ganglioside에 집중하기 시작합니다. </li><li> 도킹 바이러스 입자의 적절한 밀도 (최대 전망 분야 1000 주위 입자)를 달성되었을 때. 밀리리터 플루오레신 표시 streptavidin마다이 마이크로 그램을 포함하는 솔루션에 입구 튜빙을 전환합니다. 라벨 streptavidin은 이중층의 결합 지질 분자를 비오틴에 바인딩되며, 결국 희미한 녹색 배경이 표시됩니다. </li><li> HNE 300 microliters와 흐름 채널을 씻으십시오. </li><li> , 이미지 영역을 선택 현미경을 집중하고 시간 타락한 이미지 수집을위한 CCD 카메라를 준비합니다. 100 MS에 노출 시간을 설정하고 10 Hz의 속도로 프레임을 수집합니다. </li><li> 10 MM 나트륨 구연 산염 및 140 MM NaCl을 포함하는 산성 버퍼에 흐르는으로 퓨전을 시작합니다. 버퍼의 산도는 assayed되는 바이러스의 중요한 산도 아래로 조정해야합니다. 산도에서 X - 31 퓨즈는 아래 5.5의. </li></ol> 대표 결과 그림 1B는 융합 전과 중에 이중층 도킹 virions의 스냅샷을 보여줍니다. 각각의 회절 제한된 장소는 개별 바이러스 입자를 나타냅니다. 적색과 녹색의 형광은 별도로 바이러스 봉투와 컨텐츠 레이블의 동시 관찰을 허용, CCD 카메라의 상단과 하단 반쪽에 몇 군데있다. 에 비해 녹색 채널에 두 배나 많은 명소가 일반적으로있다빨강, 이것은 봉투 레이블에 비해 콘텐츠 염료로 라벨의 낮은 효율성을 반영합니다. 플루오레신를 바운드 표면에서 방출 녹색 배경 형광은 구연 산염 버퍼의 도착 사라지고 융합 반응의 시작 시간을 결정 수 있습니다. Hemifusion 이벤트 hemifusion의 줄기를 통해 바이러스 봉투 diffuses의 침묵 Rh110C18로 녹색 형광의 파열로 감지되며 평면 막에 희석합니다. 외부 확장 형광 구름은 평면 막의 지방산 - 아실 연결된 염료의 무료 보급을 보여주는, hemifused 입자 주위에 볼 수 있습니다. 기공 형성은 바이러스 입자의 내부 안에 갇힌 SRB에서 빨간색 형광의 부패로 관찰됩니다. 퓨전 기공의 개통은 염색이 관찰 지역의 평면 이중층 밖으로 아래 수성 공간으로 탈출 할 수 있습니다. 각 입자에 대한 형광 강도의 탄도는 개별 입자의 통합 농도에서 꾸몄다 hemifusion 및 기공 형성 (그림 1C)의 수율 및 시간 결정을 용이하게합니다. Hemifusion 및 기공 형성 이벤트 시간은 Rh110C18 형광 버스트 또는 SRB 신호 부패의 최대 기울기가 발생하는 시점으로 결정됩니다. 성공적인 실험에서 Rh110C18 항복 dequenching 신호 및 SRB 라벨 입자의 30 %로 표시된 입자의 약 50 %는 유용한 신호를 제공합니다. 두 염료로 표시된 입자의 약 10 %가 모두 지질 혼합 및 기공 형성 신호를 보여줍니다. 그림. 2A - C는 전형적인 실험에서 hemifusion 및 기공 형성 지연 시간의 분포를 보여줍니다. Fig.2D - F는 같은 조건에서 수행 다섯 실험에서 결합된 이벤트 이벤트 배포판을 보여줍니다. 도 관찰 겸손한 번호, histograms의 형태는 분명합니다. 각 실험은 산도 드롭 시간의 감지에 의해 동기화되기 때문에, 여러 실험은 결합 수 있으며, 중간 단계를 제한 속도에 대한 자세한 정보를 얻을 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/1484/1484fig1a.jpg" border="0" alt="그림 1"> <img src="/files/ftp_upload/1484/1484fig1b.jpg" border="0" alt="그림 1"> 그림 1. 실험 설계. A) 바이러스 입자는 hemifusion와 융합 기공 형성 속도론을 모니터하는 두 형광 염료와 함께 표시됩니다. 형광은 높은 NA 현미경의 목적이 수집하여 CCD에 몇 군데 있습니다. B) 형광 이미지를 전 (왼쪽)와 중 (오른쪽) 개별 바이러스 입자의 융합. 각 이미지의 위쪽과 아래쪽 절반 지원 이중층의 동일한 ~ 50 X 100mm이 지역의 각각 빨간색과 녹색 형광과 일치합니다. C) 붉은 SRB 바이러스성 내용 추적 (상단 트레이스)의 형광 강도는 녹색 Rh110C18 멤브레인 염료 (중앙 추적) 및 플루오레신 산도 센서 (낮은 추적) 산도 드롭, hemifusion, 그리고 퓨전 사이에 경과한 정확한 시간을 제공합니다. 하시기 바랍니다 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1484/1484fig1.jpg">여기를 클릭</a> 그림 1의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다. <img border="0" src="/files/ftp_upload/1484/1484fig2tmb.jpg" alt="그림 2"> 그림 2. 찬란 분류 바이러스의 퓨전 속도론. 산도 드롭 및 hemifusion (A, D)과 기공 형성 (B, E) 사이의 경과 시간의 배포판. 배포판의 상승과 부패는 여러 중간 단계의 존재를 나타냅니다. hemifusion 및 개별 입자의 융합 기공의 개방 사이의 전환은 기하 급수적으로 단일 속도 - 제한 단계를 제안, 배포됩니다. 패널 AC는 단일 실험의 결과를 보여줍니다. 패널 DF는 동일한 조건에서 수행 다섯 별도의 실험에서 컴파일됩니다. 하시기 바랍니다 <a href="/files/ftp_upload/1484/1484fig2.jpg1484">여기를 클릭</a> 그림 2의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.

<ol><li>Elender, G., Kuhner, M., Sackmann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionalisation+of+Si%2FSiO2+and+glass+surfaces+with+ultrathin+dextran+films+and+deposition+of+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Functionalisation of Si/SiO2 and glass surfaces with ultrathin dextran films and deposition of lipid bilayers.</a> Biosens Bioelectron. 11, 565-577 (1996).</li>
<li>Floyd, D. L., Ragains, J. R., Skehel, J. J., Harrison, S. C., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-particle+kinetics+of+influenza+virus+membrane+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Single-particle kinetics of influenza virus membrane fusion.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 15382-15387 (2008).</li>
</ol>

유체 및 지속적인 지원 지질 bilayers의 준비 도전하실 수 있습니다. 물질 또는 표면 결함을 오염 미량의은 bilayers의 확산 방지합니다. dextran의 유니폼 레이어주의 청소와 증언이 필수적입니다. 바이러스 입자의 장시간 영상 표백제 형광 라벨을하거나 그들이 inactivated 될 발생할 수 있습니다. 이런 종류의 사진 손상이 잘 바이오 이미징 및 단일 분자 분야에 알려져 있고, 일반적으로 흥분 fluorophores의 반응 산소 종의 생성에서 줄기로 생각됩니다. 사진 피해를 최소화하기 위해, 우리는 일반적으로 여기 레이저의 파워를 최소화하고 사전에 실험을 시작하기 위해 장시간 노출하지 마십시오. 보고된 여러 산소 청소 시스템 중 하나를 사용하여 버퍼에서 산소 고갈이 유용 수 있습니다. 과도 중간 상태에 대한 정보를 얻을 수있는 능력이 융합 반응을 정확하게 동기화되어야합니다. 사용 유량과 입구 관 그리고 흐름 ...

<table><tbody><tr><td>Corning 커버글라스 정사각형, 25 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS286525</td><td></td></tr><tr><td>Fused silica 슬라이드</td><td>Technical Glass</td><td></td><td></td></tr><tr><td>염색 랙</td><td>Thomas Scientific</td><td>8542E40</td><td></td></tr><tr><td>(3- glycidoxypropyl)trimethoxysilane</td><td>Gelest Inc.</td><td>SIG5840.1</td><td></td></tr><tr><td>Dextran T-500</td><td>Pharmacosmos</td><td>5510 0500 4006</td><td></td></tr><tr><td>1,2-dioleoyl-&lt;em&gt;sn&lt;/em&gt;-glycero-3-phosphocholine (DOPC)</td><td>Avanti Polar Lipid, Inc</td><td>850375</td><td></td></tr><tr><td>1-palmitoyl-2oleoyl-&lt;em&gt;sn&lt;/em&gt;-glycero-3-phosphocholine (POPC)</td><td>Avanti Polar Lipid, Inc</td><td>850457</td><td></td></tr><tr><td>콜레스테롤</td><td>Avanti Polar Lipid, Inc</td><td>700000</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-((6-(biotinoyl)amino)hexanoyl)-1,2-dihexadecanoyl-&lt;em&gt;sn&lt;/em&gt;-glycero-3-phosph&amp;#8211;thanolamine, triethylammonium salt (biotin-X DHPE)</td><td>Invitrogen</td><td>B1616</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin, fluorescein 접합체</td><td>Invitrogen</td><td>S-869</td><td></td></tr><tr><td>우뇌 유래 Disialoganglioside GD&lt;sub&gt;1a&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2392</td><td></td></tr><tr><td>미니 압출기(Mini Extruder)</td><td>Avanti Polar Lipid, Inc</td><td>610000</td><td></td></tr><tr><td>0.1 micron 폴리카보네이트 막 필터</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>800309</td><td></td></tr><tr><td>10 mm 드레인 디스크 (막 지지체)</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>230300</td><td></td></tr><tr><td>Sulforhodamine b 나트륨염</td><td></td><td>S1402</td><td></td></tr><tr><td>Octadecyl rhodamine 110 (Rh110C18)</td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;합성 프로토콜은&lt;/em&gt; Floyd &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt; 2008 참조</td></tr><tr><td>PD-10 탈염 컬럼</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0851-01</td><td></td></tr><tr><td>Nikon 형광 현미경</td><td>Nikon Instruments</td><td>TE2000-U</td><td></td></tr><tr><td>Plan Apo TIRF 60x 1.45 NA 대물렌즈</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Innova 70C Spectrum Ar/Kr 레이저</td><td>Coherent Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>시린지 펌프</td><td>Harvard Apparatus</td><td>702213</td><td></td></tr></tbody></table>

단일 입자 수준에서 바이러스성 퓨전 속도론의 측정 방법

Method for Measurement of Viral Fusion Kinetics at the Single Particle Level

막 융합이 세포로 싸여 바이러스의 항목 중에 필수적인 단계입니다. 기존의 퓨전 assays은 일반적으로 어려운 것인 관련된 분자 단계의 순서를 분석하고, 퓨전 이벤트의 다수에 대한 리포트입니다. 우리는 체외에서 본질적으로 유동적인 지원 대상 이중층 단일 바이러스 입자의 융합의 속도론을 모니터하는 두 색 형광 분석을을 개발했습니다. 인플루엔자 바이러스 입자는 멤브레인 및 바이러스 인테리어를 얼룩이 빨간색 친수성 ​​형광단를 얼룩이 녹색 lipophilic 형광단와 incubated 있습니다. 우리는 흐름 세포의 dextran - functionilized 유리 표면에 ganglioside 함유 지질 이중층을 입금, CCD의 입자의 수백을 포함, 평면 이중층 및 이미지 100 X 100 μm의 두 영역의 형광에 바이러스 입자를 품어 카메라. 이미징 모두 빨간색과 녹색 형광함으로써, 우리는 동시에 막 색소 (녹색) 및 입자의 수​​성 내용 (빨간색)의 동작을 모니터링할 수 있습니다. 퓨전 산도 아래 값을 산도를 낮출되면 입자는 세포막과 융합됩니다. Hemifusion은 대상 막의 바깥쪽 전단지와 입소문 막의 바깥 전단지의 병합, 입자의 녹색 형광의 갑작스런 변화로 볼 수 있습니다. 남은 두 말초 전단지의 후속 융합되면 기공이 형성되고 바이러스 입자의 빨간 발광 형광단은 대상 막에 따라 공개됩니다. 이 행사는 개별 입자의 붉은 형광의 감소로 상승을 제공합니다. 마지막으로, 대상 막에 포함된 산도에 민감한 형광단에서 통합 형광이 산도 드롭의 정확한 시간에보고합니다. 세 형광 시간의 흔적에서 모든 중요한 이벤트 (산도 드롭, 기공 형성에 혼합 hemifusion, 컨텐츠에 따라 혼합 지질)는 이제 간단한 방법으로 개별적으로 모든 입자에 대한 추출하실 수 있습니다. histograms에 많은 개별적인 입자에 대한 다양한 변환에 대한 경과 시간을 수집하여, 우리는 해당 중간체의 수명을 결정할 수 있습니다. 직접 형광 관찰가 없어도 숨겨진 중간체는 이러한 histograms에서 직접 시각하실 수 있습니다.

우리는을 제시<em&gt; 체외에</em&gt; 두 컬러 유체 대상 이중층 단일 바이러스 입자의 융합을 시각화하기 위해 형광 분석. differentially 바이러스 멤브레인 및 인테리어 얼룩 fluorophores와 바이러스 입자를 분류함으로써, 우리는 hemifusion과 기공 형성 속도론을 모니터 할 수 있습니다.

막 융합은 엔벨로프 바이러스가 세포 내로 진입하는 과정에서 필수적인 단계입니다. 전통적인 융합 분석법은 일반적으로 다수의 융합...

본 분석에 사용되는 커버슬립은 덱스트린으로 기능화한 후 미세유체 유동 셀(microfluidic flow cells)에 통합됩니다. 그 다음, 각 유동 셀을 리포좀 현탁액과 함께 배양하며, 리포좀은 수화된 덱스트린 위에 융합되어 지질 이중층을 형성합니다. 형광 현미경 하에서 fluoro four가 표지된 바이러스와 플루오레세인(fluorescein)이 표지된 스트렙타비딘(streptavidin)을 첨가하고, 바이러스가 이중층에 결합하도록 합니다.산성 완충액의 유입으로 이중층과의 바이러스 융합이 시작되며, 디지털 카메라가 분석 과정 전반의 형광 변화를 기록합니다. 안녕하세요, 저는 하버드 대학교 생물화학 및 분자 약리학과의 Anine Vanian 실험실에 소속된 Daniel Floyd입니다. 오늘은 단일 입자 수준에서 바이러스 융합 역학을 시각화하는 방법을 보여드리겠습니다.본 실험실에서는 바이러스가 호스트 세포에 도달하는 경로를 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다. 그럼 시작하겠습니다. 덱스트린으로 기능화된 커버슬립을 준비하여 이 프로토콜을 시작하십시오.첫 번째 단계는 커버슬립을 10% 세제 용액, 1 M 수산화칼륨 아세톤 용액, 100% 에탄올 용액 순으로 각 용액당 30분 동안 초음파 처리하는 것입니다. 각 단계 사이에는 탈이온수로 헹굽니다. 마지막 초음파 처리 후, 커버슬립을 물로 헹군 다음 80 °C 인큐베이터에서 건조합니다.다음으로, 커버 슬립을 산소 플라즈마 스트리퍼에 3분 동안 넣습니다. 이 단계는 슬라이드 표면을 산화시켜 유리를 균일하게 친수성으로 만들고, 이후의 실란화 단계에서 반응성이 있도록 합니다. 그 다음, 커버 슬립을 이소프로판올에 녹인 0.2% gly oxy propyl trimeth oxypro trim methoxy 신선한 용액에 담그고 5분 동안 배양합니다.그 후 커버슬립을 이소프로판올로 여러 번 헹굽니다. Slan이 코팅된 커버슬립을 80 °C에서 1시간 동안 둡니다. 이 경화 단계를 통해 slan이 유리에 공유 결합할 수 있게 합니다.경화 후, 커버슬립을 플라스틱 냉동 보관함 내부에 평평하게 배치합니다. 각 커버슬립의 상단 표면을 30% w/v 수용액 상태의 덱스트린 용액 약 1 mL로 덮어줍니다.냉동고 상자를 닫고 커버슬립을 조용한 곳에 24에서 36시간 동안 둡니다. 다음 날, 플라스틱 핀셋으로 커버슬립을 잡고 과잉 덱스트린을 따라낸 후, 다시 세라믹 랙에 넣습니다. 물로 여러 번 헹군 다음, 48시간 동안 물에 담가 둡니다.용기를 테이블탑 회전기로 천천히 교반할 수 있습니다. 커버슬립을 80 °C로 설정된 오븐에서 건조시킨 후, 다음 단계를 진행할 때까지 진공 데시케이터에 보관하십시오. 평면 이중층을 형성하기 위해 리포좀 혼합물로 커버슬립을 코팅합니다. 다음 단계는 지질 이중층 형성을 위한 리포좀을 준비하는 것입니다. 후드 내에서 클로로포름에 용해된 모든 지질을 유리 시험관에 혼합하십시오.리포좀 제형에는 바이러스 입자와 결합하는 dia ganglia 측면과, 스트렙타비딘이 접합된 pH 지시제 플루오레세인을 결합하는 비오틴화 지질이 포함됩니다. 다음으로, 아르곤 또는 질소 가스 기류 하에서 용매를 증발시킵니다. 그리고 시험관을 진공 데시케이터에 2시간 동안 두어 남은 용매를 제거합니다.건조된 지질 필름을 400 µL의 HNE 버퍼에 재현탁합니다. 그런 다음 현탁액을 플라스틱 미세 원심 분리 튜브로 옮깁니다. 현탁액을 액체 질소조에서 급속 동결시킨 후, 온수조에서 해동합니다.냉동-해동 주기를 4회 반복합니다. 100 nanometer 멤브레인 필터가 장착된 리피드 익스트루더(lipid extruder)를 사용하여 리피드 현탁액을 압출합니다. 25회 압출 후, 현탁액은 더 투명하게 보여야 합니다.리포솜을 상온에서 보관하고 준비한 당일에 사용하십시오. 지질 준비가 완료되었으므로, 마이크로플루이딕 유동 셀을 준비합니다. 먼저, 20 x 20 x 3 mm 크기의 쿼츠 슬라이드를 준비하고 다이아몬드 버(diamond burr)를 사용하여 반대편 양쪽에 1 mm 크기의 구멍 두 개를 뚫습니다.면도날을 사용하여 양면테이프 시트에서 20 millimeter 정사각형을 자릅니다. 중앙에서 15 by 2 millimeter 크기의 섹션을 잘라냅니다. 테이프 뒷면의 한쪽을 벗겨내고 테이프를 커버 슬라이드에 부착합니다.나머지 한 면을 기능화된 커버슬립에 부착한 후, 이제 폴리에틸렌 튜브를 20 centimeter 길이로 잘라 쿼츠 슬라이드의 구멍에 삽입합니다. 마지막으로 5분 경화 에폭시 접착제로 플로우 셀을 밀봉합니다. 쿼츠 슬라이드의 측면을 따라 접착제를 도포하여 커버슬립과 결합시킵니다.접착제 두 방울을 더 사용하여 튜빙과 석영 슬라이드 사이의 연결 부위를 밀봉합니다. 접착제가 경화되면, 유동 셀과 튜빙을 HNE 버퍼로 프라이밍합니다. 다음으로 지지 지질 이중층(supported lipid bilayer)을 생성하기 위해, 융합 실험 전날에 압출된 리포좀 현탁액 약 80 microliters를 채널 안으로 흡입합니다.바이러스 내부를 붉은색으로 염색하기 위해 바이러스 입자 표지를 시작합니다. 갓 제조한 sulfur rubrene 또는 SRB 용액 20 µL를 바이러스 현탁액 10 µL와 혼합하고 실온에서 20시간 동안 방치합니다. 다음 날, 바이러스 현탁액을 PD 10 탈염 컬럼에 통과시키고 800 µL의 HNE 버퍼로 희석하여 과량의 염료를 제거합니다.컬럼에는 표지된 바이러스가 포함된 뚜렷한 색상의 밴드가 나타나야 합니다. 다음으로 용출 단계에서 이 분획을 수집하고, SRB로 표지된 바이러스 현탁액에 13 µL의 Octa decal, RUMINE one 10 또는 RH one 10 C 18을 첨가하여 바이러스 외피를 녹색으로 표지하십시오. 튜브를 실험실 로테이터에 장착하여 현탁액을 혼합하고 3시간 동안 그대로 둡니다.다음으로, PD 10 탈염 컬럼을 사용하여 과량의 RH one 10 C 18을 제거합니다. 이전과 마찬가지로 이제 바이러스가 융합 분석(fusion assay) 준비가 되었습니다. 고개구수 오일 침강 렌즈가 장착된 형광 현미경을 사용하여 융합 역학 분석(fusion kinetics assay)을 수행합니다.Argonne 크립톤 레이저가 바이러스 막과 내부의 형광 물질을 여기시킵니다. 이후 다이크로익 미러가 적색과 녹색 형광 방출광을 분리하여, 전자 증배 CCD(electron multiplying CCD) 또는 전하 결합 소자(charge coupled device) 카메라의 각각 다른 절반 부분에 이미지를 독립적으로 집광합니다. 커버슬립을 현미경 스테이지에 장착하고, 배출 튜브를 100 µL/min의 유속으로 설정된 시린지 펌프에 연결하십시오.300 µL의 HNE를 흘려보내 유로 내의 과잉 리포좀을 제거합니다. 현미경의 초점을 맞추고, 적색 형광 단백질을 흥분시키기 위해 488 nm 광원을 350 W/cm²로, 녹색 형광 단백질을 흥분시키기 위해 568 nm 광원을 70 W/cm²로 표면에 조사하도록 레이저 출력을 조정합니다. 현미경 준비가 완료되면, 1:100로 희석한 표지된 바이러스를 플로우 셀로 펌핑합니다.바이러스가 유체 채널의 바닥 표면으로 확산됨에 따라 입자들이 결합하기 시작합니다. 입자들은 커버슬립에 통합된 평면 이중층인 DIA 신경절 쪽에 부착됩니다. 결합된 입자의 밀도가 시야당 수백 개 정도에 도달하면, 2 µg/mL 용액을 흘려보내기 시작합니다.형광체로 표지된 스트렙타비딘(streptavidin)은 pH에 민감한 형광체로, 표지된 스트렙타비딘이 이중층의 비오틴 결합 지질 분자와 결합합니다. 희미한 녹색 배경이 다시 나타나면, 300 µL의 HNE로 유동 채널을 세척합니다. 이제 바이러스가 결합하고 이중층 표면이 플루오레세인(fluorescein)으로 코팅되었으므로, 분석을 시작할 때입니다.이미징 영역을 선택하고, 현미경의 초점을 맞춘 후 타임랩스 이미지 획득을 위해 CCD 카메라를 준비합니다. 노출 시간을 100 milliseconds로 설정하고 10 hertz의 속도로 프레임을 수집합니다. 산성 sodium citrate 완충액을 흘려보내 바이러스 막 융합을 유도합니다.pH가 낮아짐에 따라 플루오레세인(fluorescein) 형광이 약해지며 산성화되는 시점을 정확히 파악할 수 있습니다. CCD 카메라는 분석 전 과정 동안 데이터를 기록하며, 이를 통해 CCD 카메라로 기록된 헤미퓨전(hemi fusion) 및 포어(pore) 형성 시점을 결정할 수 있습니다. pH가 떨어진 후, 바이러스 막과 평면 막이 융합되고 지질이 혼합되면서 바이러스 외피의 녹색 염료가 평면 막으로 희석되어 녹색 형광이 일시적으로 강하게 나타납니다.반대로, pH가 하락한 후에는 바이러스 및 지질 막에 기공이 형성되어 바이러스 내부의 적색 염료가 평면 이중층 아래의 수성 공간으로 빠져나가 시야에서 사라지기 때문에 적색 형광이 감소합니다. 이러한 경향은 융합 전과 융합 중에 촬영한 형광 스냅샷을 통해 시각화할 수 있습니다. 또한, 이 예시와 같이 각 입자에 대한 형광 강도 궤적을 그래프로 나타내십시오. 헤미융합(Hemi fusion)은 녹색 형광 강도의 기울기가 가장 가파른 시점으로 정의하며, 기공 형성은 적색 형광 감소가 일어나는 시점으로 정의합니다. 서로 다른 실험의 데이터를 동기화하기 위해 pH 하락 시점을 t=0으로 설정하여, 여기에서 보여주는 것과 같이 헤미융합 및 기공 형성 지연 시간의 히스토그램을 생성하기 위한 여러 실험의 통합 데이터를 도출하십시오.지금까지 단일 입자 수준에서 바이러스 융합 역학을 측정하는 방법을 보여드렸습니다. 이 절차를 수행할 때, 균질하고 유동적인 이중층을 형성할 수 있도록 깨끗한 커버 슬립을 사용하시기 바랍니다.또한, 광손상을 최소화하기 위해 형광 이미징 중에 사용하는 빛의 양을 최소한으로 줄이십시오. 이것으로 모두 끝났습니다. 시청해 주셔서 감사하며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

단일 바이러스 게놈 (SVG)는 단일 virons의 게놈을 분리하고 증폭하는 방법이다. 혼합 조립의 바이러스 현탁액하여 virion의 캡처 및 다운 스트림 처리하는 동안 게놈 전단을 줄이고, 아가로 오스를 포함하는 개별 우물 현미경 슬라이드에 유동 세포 계측법을 사용하여 정렬됩니다. 전체 게놈 증폭 시퀀싱에 적합한 유전 물질의 결과로 여러 변위 증폭 (MDA)를 사용하여 수행됩니다.

&#39;단일 바이러스 게놈&#39;을 사용하여 단일 비리의 분리 및 유전체 분석

이 비디오는 바이러스가 숙주 세포로 진입하고 엔도솜과 융합하는 특정 단계를 표적으로 하는 항바이러스제를 평가하기 위한 분석을 보여줍니다. 세포는 저온에서 배양된 다음 HCV에 감염됩니다. 낮은 온도는 숙주 세포에 대한 바이러스 결합을 허용하지만 내포작용(endocytosis)을 통한 내재화를 억제합니다. 테스트 항바이러스 화합물을 첨가하고 세포를 생리학적 온도에서 배양합니다. 이러한 더 높은 온도로의 이동은 바이러스 진입을 용이하게 하고 엔도솜과의 바이러스 외피 융합에 대한 테스트 화합물의 영향을 평가할 수 있습니다.

숙주 세포의 바이러스 진입 및 융합에 대한 테스트 화합물의 효과를 평가하기 위한 분석

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