Name: Denaturing 요소의 Polyacrylamide 젤 전기 영동 (우레아 페이지) (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-29T07:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: 학습하세요 우레아 폴리아크릴아미드 겔 전기영동법을 사용하여 단일가닥 DNA 또는 RNA를 분리하는 방법을. 이 기술은 분자생물학 연구에서 핵산 분석을 위한 신뢰할 수 있는 방법입니다.

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이 작품은 싱가포르 학술 연구위원회 (ARC) [부여 번호 90/07]에 의해 지원되었다. 우리는 지원 Radiodurans 감사합니다.

이 실험 절차에 대한 완전하고 상세한 텍스트 프로토콜은 분자 생물학의 현재 프로토콜에서 사용할 수 있습니다. 겔 샌드위치의 조립 및 겔 장치에 대한 자세한 단계별 지침은 BioRad 웹사이트 3 확인할 수 있습니다. 필수 장비 : 유리 접시 (내부 및 외부) 10cm 셀 : 10.1 X 7.3 cm (내부 판), 10.1 X 8.2 cm (외부 판), BioRad 20cm 셀 : 20 X 20cm (내부 판), 20 X 22.3 cm (외부 판), BioRad 0.5-1.5 mm 겔 빗과 스페이서 겔 주조 스탠드 덮개와 케이블로 젤 장치 고전압 전원 공급 장치 난방 장치 블록이나 물 목욕 Serological pipettes 및 피펫 에이드 피펫 및 피펫 팁 겔 건조기 스캐너 시약 및 솔루션 : 요소 (ultrapure) 40 % polyacrylamide 솔루션 (29:1) 10 × TBE 솔루션 (트리스 - Borate, EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 버퍼) Deionized, 증류수 TEMED 30 % (W / V) 암모늄 persulfate 솔루션 0.5 X TBE 솔루션 포름 아미드 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 크실렌 cyanol Bromphenol 블루 메탄올 에탄올 <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> 음량 </td><td colspan="3" style="text-align:center;"> 50 ML </td><td colspan="3" style="text-align:center;"> 60 ML </td><td colspan="3" style="text-align:center;"> 10 ML </td></tr><tr><td> 아크릴 아미드 농도 </td><td> 10% </td><td> 12.5 % </td><td> 15% </td><td> 10% </td><td> 12.5 % </td><td> 15% </td><td> 10% </td><td> 12.5 % </td><td> 15% </td></tr><tr><td> g 요소 </td><td> 24 </td><td> 24 </td><td> 24 </td><td> 28.8 </td><td> 28.8 </td><td> 28.8 </td><td> 4.8 </td><td> 4.8 </td><td> 4.8 </td></tr><tr><td> ML 40% 아크릴 (29:1) </td><td> 12.5 </td><td> 15.625 </td><td> 18.75 </td><td> 15 </td><td> 18.75 </td><td> 22.5 </td><td> 2.5 </td><td> 3.125 </td><td> 3.75 </td></tr><tr><td> UL 30 % APS </td><td> 166 </td><td> 166 </td><td> 166 </td><td> 199.2 </td><td> 199.2 </td><td> 199.2 </td><td> 33 </td><td> 33 </td><td> 33 </td></tr><tr><td> UL TEMED </td><td> 20 </td><td> 20 </td><td> 20 </td><td> 24 </td><td> 24 </td><td> 24 </td><td> 4 </td><td> 4 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> 10 × TBE </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 6 </td><td> 6 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td colspan="10"> deionized, 증류수로 볼륨을 채워 </td></tr></tbody></table> 표 1 : 단일 좌초 oligonucleotides를 해결하기위한 다양한 아크릴 아미드의 농도와 볼륨에 필요한 시약 및 솔루션 겔 샌드위치 어셈블리 및 젤 준비 <ol><li> 제조 업체의 설명에 따라 겔 조립 및 겔 - 캐스팅 챔버 3 겔을 수정. 0.5-1.5 mm 두께 스페이서를 사용합니다. </li><li> 분자 생물학의 현재 프로토콜에 따라 적절한 polyacrylamide 솔루션을 준비하거나 표 1에 나열. 20cm의 denaturing 아크릴 아미드 젤에 대한 X 22cm X 1.5 mm, 젤 솔루션 60 ML과 10.1 X 8.2 cm에 대한 X 1mm 겔 5 ML 젤 솔루션은 충분합니다. 예상 제품 / 밴드 몇 기지의 범위 내에있는 경우 큰 젤을 사용하는 다음, 더 이상 젤는 단일 염기의 차이로 밴드를 해결할 수 있습니다. 예상 밴드는 10 개 이상의 세포핵에 차이가있다면, 작은 젤은 조각을 해결하기 위해 적합한 것입니다. 귀하의 분리 요구 사항을 맞는 polyacrylamide의 비율을 선택, 높은 polyacrylamide의 농도는 낮은 분자량의 조각을 해결할 수 있습니다. 아크릴 아미드의 원하는 양의 ultrapure의 요소와 믹스를 사용합니다. 0.5-1 X TBE의 최종 농도를하고 deionized, 증류수로 볼륨을 채울 수있는 겔 믹스에 TBE 버퍼를 추가합니다. 전자렌지에 20 초 동안 솔루션을 가열하고 그것을 부드럽게 섞는다. 솔루션 손이 따뜻한 때까지 큰 겔 볼륨이 단계를 반복하십시오. </li><li> 즉시 serological 피펫과 두 개의 유리 판 사이에 자동 피펫 에이드를 사용하여 겔 하거라. 공기 방울을 도입하지 마십시오. 빗를 삽입하고 젤 30-60분을위한 중합 보자. </li></ol> 전기 영동 장치를 설정하고 젤 prerun <ol><li> 지침 3 제조에 따라 주조 챔버와 겔 장치에 어셈블리를에서 젤 분리합니다. </li><li> 유리 플레이트가 서브됩니다 낮은 버퍼 챔버 재치 실행 버퍼 (0.5-1 X TBE) 작성버퍼 2~3cm을 통합. 버퍼를 실행하는 젤의 맨 위쪽 버퍼 챔버를 입력합니다. </li><li> 조심스럽게 빗를 제거하고 도움말을 읽어 피펫 및 젤을 사용하여 실행 버퍼로 우물을 씻어. </li><li> 고전압 전원 공급 장치에 케이블에서 겔 시스템 및 플러그의 뚜껑을 연결합니다. 당신이 샘플을 로드할 수 있습니다 전에 젤을 가열하고 젤 남아 요소를 제거하려면 최소 30 분 동안 젤 prerun해야합니다. 최적 온도는 45-55 사이 여야합니다 ° C. 60보다 높은 온도 ° C 밴드는 얼룩이나 유리 조각이 균열있을 수 있으므로.을 피하십시오 prerun (겔 당 15-25 W)에 대한 지속적인 와트를 선택합니다. </li></ol> 샘플 준비 <ol><li> 그 동안에 샘플을 준비합니다. 따라서, 샘플 2 X 젤 로딩 믹스의 해당 금액을 추가합니다. 로딩 혼합은 일반적으로 90 % 포름 아미드, 0.5 % EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 0.1 % 크실렌 cyanol와 0.1 % bromphenol 파란색이 포함되어 있습니다. </li><li> 샘플이 젤에로드하기 전에 샘플을 몇 분 동안 70-90 ° C 사이의 샘플을 가열하여 열기가 변성해야합니다. </li></ol> 젤로드 및 실행 <ol><li> prerun가 완료되면 뚜껑을 제거하고 완전히 같은 요소가 우물에 leached 것처럼 언급한 주머니를 씻어. </li><li> 주머니 바닥에서 신중하게 샘플을 적용합니다. 공기 방울을 도입하지 마십시오. 버퍼를 로딩하면 실행되는 동안 같은 상태를 유지하기 위해 빈 주머니에 적용되어야합니다. </li><li> 뚜껑을 조립하고 55 젤 온도를 유지하기 위해 지속적인 와트에서 젤을 실행 ° C prerun과 유사합니다. 염료 앞에는 젤의 하단에 도달 때까지 마커 염료의 마이 그 레이션을 관찰합니다. 운영 기간은 사용되는 아크릴 아미드의 비율, 버퍼와 겔 두께의 이온 강도에 따라 좌우됩니다. 실행 2-4시간 사이에 마지막으로하실 수 있습니다. 젤의 온도를 확인합니다. 겔 온도계가 실행되는 동안 적당한 온도를 모니터링하는 데 도움이 될 수 있습니다. </li></ol> 젤 공정 <ol><li> 염료 앞에는 젤의 끝에 도달하면 낮은 버퍼 챔버의 겔을 넣어. 챔버에서 젤을 제거하고 클램프를 느슨하게. 스페이서 멀리 당겨 조심스럽게 유리 접시를 감추고 있기도 하죠. 필요한 잘 겔 부분을 포함하고있는 상위 버려야하는 경우. </li><li> 조심스럽게 겔 고정 솔루션 (TBE 플러스 5-10%의 메탄올과 에탄올의 농도가 동일)와 함께 접시에 젤을 전송하기만하면됩니다. 50~10분위한 솔루션으로 젤두고 버퍼를 두 번 변경할 수 있습니다. </li><li> 젤은 진공 겔 건조기 또는 젤 직접 스캔을 사용하여 추가 처리를위한 준비가되었습니다. </li></ol>

<ol><li>Maniatis, T., Jeffrey, A., van deSande, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chain+length+determination+of+small+double-+and+single-stranded+DNA+molecules+by+polyacrylamide+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Chain length determination of small double- and single-stranded DNA molecules by polyacrylamide gel electrophoresis.</a> Biochemistry. 14, 3787-3794 (1975).</li>
<li>Albright, L. M., Slatko, B. E. Denaturing polyacrylamide gel electrophoresis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAlbright%2C+LM+%22Curr+Protoc+Nucleic+Acid+Chem%22">Curr Protoc Nucleic Acid Chem</a>. , (2001).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22PROTEAN+II+xi+Cell+and+PROTEAN+II+xi+2-D+Cell+Instruction+Manual%22">PROTEAN II xi Cell and PROTEAN II xi 2-D Cell Instruction Manual</a>. , Biorad. (2001).</li>
</ol>

저자들은 공개할 사항이 없습니다.

<ol><li> 밴드 날카로움은 여러 가지 요인에 따라 달라집니다. 선명한 밴드를위한로드 샘플의 볼륨 즉, 이상적으로 1-5 μl 사이에 가능한 작게해야합니다. 그러나, 최대 15 μl 여전히 허용 해상도를 보장하는 로드할 수 있습니다. 선명 밴드의 적은 샘플 량 결과. </li><li> 밴드 품질 또한 겔의 두께에 따라 좌우됩니다. 같은 0.75 mm로 얇은 젤은, 1.5 mm 두께 젤보다 더 나은 결과를 보여줍니다. </li><li> 샘플은 겔 주머니에 동일하게 적용되지 않은 경우 밴드의 모양도, 젤 로딩하는 동안 영향을받을 수 있습니다. 로딩 버퍼에 10 % 글리세롤을 포함하는 것은 물론 더 쉽게로 겔로드 및 샘플 싱크하는 동안 도움이됩니다. </li><li> 예상 제품 (들)가 로딩 염료 중 하나와 같은 수준에서 실행하면 샘플 로딩 버퍼와 연결되어있는 또 다른 잠재적인 문제가 발생할 수 있습니다. 또한, 형광 라벨을 사용하는 경우, 일부 염료는 비슷한 파장에서 형광 신호를 보여줍니다. 이 경우 한 염료 또는 모든 염료를 제거하는 경우이 문제를 해결할 수 있습니다....

denaturing 요소의 polyacrylamide 젤 전기 영동 (우레아 페이지)

Denaturing Urea Polyacrylamide Gel Electrophoresis (Urea PAGE)

요소 페이지 또는 요소의 polyacrylamide 젤 전기 영동을 denaturing는 보조 DNA 또는 RNA의 구조를 denatures 및 분자량에 따라 polyacrylamide 젤 매트릭스에서 분리에 사용되는 6-8 M의 요소를 고용합니다. 2-500 기지 사이의 조각은 단일 염기만큼 작은 길이의 차이로이 방법 1을 사용하여 분리 수 있습니다. 샘플의 마이 그 레이션 선택한 아크릴 아미드의 농도에 따라 좌우됩니다. polyacrylamide의 높은 비율의 낮은 분자량 조각을 해결합니다. 요소와 45-55의 온도의 조합 ° C 젤 실행하는 동안 비정형 DNA 또는 RNA 분자의 분리 수 있습니다. 일반적으로이 방법은 단일 좌초된 DNA 또는 효소 절단 반응에서 합성 또는 분류 oligonucleotides 또는 제품으로 RNA 조각을 분석하거나 정화가 필요합니다. 이 비디오를 문서에서 우리는 denaturing 요소의 polyacrylamide의 젤류을 준비하고 실행하는 방법을 보여줍니다. 기술 팁은 원래 프로토콜 1,2 이외에 포함되어 있습니다.

Denaturing 요소의 polyacrylamide 젤 전기 영동은 단일 좌초 DNA를 분리 또는 500 세포핵의 한계까지 RNA하는 데 사용됩니다. 열 denatures 샘플 및 구조화되지 않은 단일 가닥와 함께 요소는 분자량에 따라 겔 매트릭스 내에서 마이 그 레이션.

Denaturing 요소의 Polyacrylamide 젤 전기 영동 (우레아 페이지)

우레아 PAGE 또는 변성 우레아 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동은 6-8 M 우레아를 사용하며, 이는 DNA 또는 RNA의 2차 구조를 변성시키므로 다음과 같은 용도로 사용됩니다...

일반적으로 이러한 유형의 젤은 합성 또는 표지된 올리고뉴클레오타이드나 효소 절단 반응 생성물과 같은 단일 가닥 DNA 또는 RNA 단편을 분리하는 데 필요합니다. 분리 범위는 폴리아미드 농도에 따라 달라지며, urea와 열 변성 처리를 병행하여 시료를 단일 가닥 분자로 만들면 분자량에 따라 젤 매트릭스 내에서 이동하게 됩니다. 본 영상에서는 전형적인 젤의 제작, 전기영동 및 처리 과정을 소개합니다.안녕하세요, 저는 Nanyang Technological University의 Haki입니다. 이번 시연에서는 변성 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(Denaturing polyacrylamide gel electrophoresis)을 수행하는 방법을 보여드리겠습니다.깨끗한 유리판을 사용하여 제조업체의 설명서에 따라 겔 샌드위치를 조립하십시오. 겔 캐스팅 표준 챔버에 겔을 고정하십시오. 겔이 유리판에 달라붙는 경향이 있는 경우, 대형 겔의 유리판을 이제(ize)하십시오.분리 요구 사항에 따라 겔 크기와 두께를 선택하십시오. 분자 생물학의 최신 프로토콜에 따라 겔 용액을 준비하십시오.분리 요구 사항에 적합한 폴리아미드 농도를 선택하십시오. 아크릴아미드 비율이 높을수록 저분자량 단편을 더 잘 분리할 수 있습니다. Alta pure UIA를 사용하고, 비커나 병에 원하는 양의 폴리아크릴아미드를 섞으십시오.용액에 10 XTBE 완충액을 추가하고 증류수로 필요한 부피까지 채웁니다. 용액을 전자레인지에서 20초 동안 가열하고, 모든 UIA가 녹을 때까지 부드럽게 섞어줍니다. 겔 부피가 큰 경우 필요한 만큼 용액을 보관하여 사용할 수 있습니다.용액이 손으로 만졌을 때 따뜻해질 때까지 마이크로웨이브 단계를 반복하십시오. 용액을 너무 많이 가열하지 않도록 주의하십시오. uria는 60°C 이후부터 분해되기 시작하므로 과열하지 마십시오.Centigrade는 암모니아 냄새로 감지할 수 있습니다. 용액이 투명해지고 상온 정도로 식으면, PS와 tamid를 겔 용액에 첨가하고 부드럽게 섞어줍니다. 겔 용액의 온도가 너무 높으면, 피펫 내부에서 겔이 중합될 수 있습니다.세롤로지컬 피펫과 피펫 에이드를 사용하여 두 유리판 사이에 겔을 붓습니다. 공기 방울이 생기지 않도록 주의하십시오. 테콤(tecom)을 조심스럽게 삽입하십시오.기포가 생기지 않도록 주의하며 겔을 30분에서 60분 동안 중합시킵니다. 캐스팅 스탠드에서 겔을 분리하여 상단 버퍼 챔버에 장착합니다. 제조사의 프로토콜에 따라 겔을 하단 버퍼 챔버에 넣고, 하단 저장조를 보통 0.5~1 XTBE 농도의 겔 전개 버퍼로 채웁니다.겔 제작 시와 동일한 농도의 겔 전개 완충액을 유리판 가장자리까지 상단 완충액 챔버에 채웁니다. 시료를 로딩하기 전에, 겔을 가열하고 겔 내에 남아 있는 urea를 제거하기 위해 최소 30분 동안 겔을 사전 전개해야 합니다. 최적 온도는 실제 겔 전개 시와 마찬가지로 45~55 °C 사이여야 합니다.밴드가 번지거나 유리 플레이트가 파손될 수 있으므로 60 °C 이상의 온도는 피하십시오. 가장자리에 영향을 주지 않도록 주의하며 콤을 제거하고, 웰 내부로 흘러 들어간 요소(urea)를 제거하기 위해 웰을 헹굽니다. 겔 로딩 팁을 사용하여 여러 번 파이펫팅합니다.각 겔 시스템의 덮개를 닫고 고전압 전원 장치에 케이블을 연결합니다. 예비 실행(pre-run)을 위해 겔당 약 15~20 W의 정전력(constant watts)을 선택합니다. 전원 장치를 켜면 기포가 발생하는 것을 통해 전도성이 좋음을 확인할 수 있습니다.그동안 샘플을 준비하며, 샘플에 적절한 양의 gel loading 용액 2x를 첨가하십시오. pre-run이 완료되면 덮개를 제거하고 앞서 설명한 대로 포켓을 철저히 세척하십시오. urea 잔류물을 제거하기 위해 겔 포켓을 주의 깊게 헹구는 것이 매우 중요합니다. urea는 샘플이 겔로 진입하는 것을 방해하는 조밀한 층을 형성하기 때문입니다.직전에 샘플의 열 변성을 유도하기 위해, 샘플을 최소 70 °C에서 수 분 동안 배양하십시오. 포켓 바닥부터 조심스럽게 샘플을 분주하십시오.일부 응용 분야에서는 염료가 시료와 간섭하여 밴드가 퍼지게 하거나, 염료 자체가 형광 신호를 나타낼 수 있습니다. 이럴 때는 하나의 염료 또는 모든 염료를 제거하고 표준 염료가 포함된 버퍼를 로딩하는 것이 유용합니다. 빈 웰에 사이즈 표준물을 로딩하며, 선명한 밴드를 얻기 위해 로딩해야 할 시료의 양은 이상적으로 1 µL에서 5 µL 사이이지만, 최대 15 µL까지 더 많은 양을 로딩할 수도 있습니다.시료의 양이 적을수록 밴드가 더 깔끔하게 형성됩니다. 기포가 생기지 않도록 주의하고, 시료가 웰(pocket) 안으로 천천히 가라앉아 균일한 층을 형성하도록 하십시오. 형광 표지를 사용하는 경우, 시료의 광퇴색(photobleaching)을 방지하기 위해 겔 시스템을 알루미늄 호일로 감싸 빛 노출을 차단하십시오.뚜껑을 조립하고 전원 공급 장치를 켭니다. DIA 전면이 겔의 하단 끝에 도달할 때까지 겔을 전기영동합니다. 실행 시간은 아크릴아마이드의 백분율에 따라 달라집니다.버퍼의 이온 강도와 겔의 두께 및 길이를 선택하십시오. 전기영동 시간은 1시간에서 수 시간까지 소요될 수 있습니다. 마커의 이동을 관찰하여 전기영동 지속 시간을 결정하십시오.일정한 와트(watts)를 유지하며 겔의 온도를 확인하십시오. 겔 온도계를 사용하면 전기영동 중에 적정 온도를 모니터링하는 데 도움이 되며, 시료가 끝단에 도달했을 때 겔 장치의 매뉴얼을 확인하십시오. 전원 공급 장치를 끄고 겔 장치의 뚜껑을 제거하십시오.다음으로, 하단 버퍼 챔버에서 겔 샌드위치를 꺼냅니다. 상단 버퍼 챔버의 버퍼를 비웁니다. 접시에 겔 고정액을 채웁니다.이 용액은 TB와 동일한 농도를 가져야 하며, 5~10%의 methanol 및 aesthetic acid를 포함해야 합니다. 장치에서 젤 샌드위치를 분리하고 클램프를 풉니다. 스페이서를 제거하고 스패튤라를 사용하여 유리판을 조심스럽게 분리하십시오. 필요한 경우, 젤이 들어 있는 웰 부분이나 아래쪽의 빈 젤 부분을 잘라내고, 염색약이 포함된 레인과 같이 불필요한 젤 조각들을 폐기하십시오.형광 샘플의 경우, 유리판에서 겔을 조심스럽게 떼어내어 겔 고정액이 채워진 접시에 옮깁니다. 겔을 용액에 5~10분 동안 두고 버퍼를 두 번 교체합니다. 접시를 가볍게 흔들어 겔에서 요소(urea)를 씻어내거나, 실험 목적에 따라 겔을 염색액에 넣습니다.겔의 품질은 겔의 두께에도 영향을 받습니다. 0.75 millimeter와 같이 얇은 겔은 1.5 millimeter 두께의 겔보다 더 좋은 결과를 보여주지만, 취급하기는 더 어렵습니다. 밴드의 선명도는 여러 가지 요인에 따라 달라집니다.전개 초기 단계에서 낮은 전압을 적용하면 시료가 겔 전면으로 부드럽게 진입하여 더 선명한 밴드를 얻는 데 도움이 되며, 높은 전압으로 인해 겔 포켓이 붕괴되는 것을 방지할 수 있습니다. 낮은 농도의 아크릴아마이드로 구성된 짧은 스태킹 겔(stacking gel) 또한 동일한 밴드 선명화 효과를 낼 수 있으며, 10% Glycerol을 포함하면 겔 로딩 시 시료가 웰 안으로 가라앉는 것을 돕습니다. 전개 중 동일한 조건을 유지하기 위해 빈 포켓에도 로딩 버퍼를 도포하는 것이 더 용이합니다.겔이 고정액에 담겨 있을 때, 사용 중인 표지체 또는 염색법에 따라 추가 이미징을 위해 진공 겔 건조기로 겔을 건조하거나 겔을 직접 스캔할 수 있습니다. 이 페이지는 단일 가닥 DNA 또는 RNA 샘플을 분석하거나 분리하는 데 유용합니다. 겔은 상온에서 보관할 수 있습니다.따라서 젤을 종이 타월로 감싼 후 물이나 러닝 버퍼로 적셔줍니다. 이렇게 감싸서 적신 젤을 밀봉 가능한 플라스틱 백에 넣고 48시간 이내에 사용하십시오. 자주 관찰되는 문제 중 하나는 젤 스마일링(gel smiling) 현상입니다.이는 겔을 통한 열 분포가 불균일하기 때문입니다. 겔이 완충액으로 둘러싸여 있지 않은 경우, 금속판을 부착하면 겔의 품질을 높일 수 있습니다. 안녕하세요, 저는 Hi Kasam입니다.저는 난양 기술대학교(Nanyang Technological University) 소속입니다. 지금까지 변성 폴리아크릴아마이드 젤 전기영동(denaturing polyacrylamide gel electrophoresis)을 수행하는 방법을 보여드렸습니다. 다음 시간에 뵙겠습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

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