손상 3 - D 뇌 회로의 타겟팅 바이러스성을위한 확장 가능한 유체 인젝터 배열

두 개의 직사각형 아크릴 조각을 레이저로 절단한 다음 조립하여 입체 어택에 대해 인젝터 어레이를 단단히 고정하는 역할을 하는 입체 클램프를 형성합니다. 주사기 펌프에는 원하는 뇌 회로를 위해 폴리에틸렌 튜브에 연결된 주사기가 장착되어 있습니다. 밀은 용융 실리카 튜브가 삽입되는 구멍을 뚫는 데 사용되어 인젝터를 형성합니다.

인젝터는 클램프에 가역적으로 장착된 다음 관심 있는 뇌 회로를 표적으로 삼도록 트리밍됩니다. 각 인젝터는 단일 폴리에틸렌 채널에 부착됩니다. 시스템 사용 준비에는 주사기를 통해 시스템에 실리콘 오일을 채운 다음 유체 시약을 주입기에 로드하는 작업이 포함됩니다.

그런 다음 병렬 주사기를 뇌 표적에 삽입하고 시약을 주입합니다. 안녕하세요, 저는 지금까지 MIT Up의 합성 신경생물학 그룹의 Stephanie Chan입니다. 공간적으로 복잡한 뇌 회로에서 유전자를 발현하려면 느리고 비용이 많이 드는 형질전환 동물을 만들거나 한 번에 한 면씩 수행해야 하는 힘든 바이러스 주입 과정이 필요했습니다.

오늘 우리는 뇌의 복잡한 3차원 패턴에 유체를 전달할 수 있는 병렬 주입기 어레이를 구축하고 사용하는 방법을 보여 드리겠습니다. 우리는 이 어레이를 사용하여 인젝터 세트를 통해 병렬로 바이러스를 전달하는 회로 특이적 형질전환 마우스를 신속하게 만들어 모든 표적을 한 번에 공격합니다. 당사의 인젝터는 복잡한 뇌 부위 분포에 모든 유체 시약을 전달하는 데 사용할 수 있습니다.

오늘날 우리의 목표는 빛에 민감한 단백질을 암호화하는 바이러스를 전달하여 특정 회로의 특정 세포 유형을 시간적으로 정확한 방식으로 켜고 끌 수 있도록 하는 것입니다. 우리 연구실에서는 이 기술을 회로별 방식으로 빛을 전달하는 광섬유 어레이와 함께 사용합니다. 시작하겠습니다.

먼저 인젝터 어레이를 고정하고 스테레오 택스에 장착할 수 있는 입체 클램프를 구축합니다. 클램프를 만들려면 이러한 항목이 필요합니다. 외경이 1.5mm인 2인치 강철 캐뉼라 또는 한쪽 끝이 있는 OD는 약 0.5 x 0.5cm의 작은 PCB 프로토보드 조각과 두 개의 동일한 직사각형을 평평하게 만듭니다.

1/2 x 3/8 인치는 두 개의 아크릴 직사각형 각각에 하나의 8 인치 아크릴 시트로 자릅니다. 반대쪽 모서리에 두 개의 원형 구멍을 자릅니다. 첫 번째 구멍은 직경이 1.5mm여야 하며 금속 캐뉼러를 단단히 고정할 수 있을 만큼 충분히 커야 합니다.

두 번째 구멍의 직경은 1/16인치여야 합니다. 금속 캐뉼러를 한 직사각형의 1.5mm 구멍에 삽입한 다음 두 번째 직사각형의 1.5mm 구멍을 통해 캐뉼라의 하단 끝을 하단 직사각형의 하단 면과 정렬하여 하키 스틱 모양을 만들고 두 직사각형 사이에 스페이서를 놓습니다. 점토를 모델링하면 이 과정에서 스페이서를 두 직사각형 사이에 단단히 고정하면서 물건을 함께 고정하는 데 도움이 됩니다.

캐뉼라와 1.5mm 구멍 주위에 뜨거운 접착제를 사용하여 이 구조를 함께 접착합니다. 접착제가 중앙에서 건조된 후 스페이서를 사각형에 붙이지 않도록 주의하십시오. 1 72 번째 구멍 위에 16 육각 너트를 끼운 다음 직사각형의 반대쪽에서 1 72 나사를 조입니다.

너트의 가장자리 주위에 소량의 5분 에폭시를 떨어뜨려 직사각형에 고정합니다. 에폭시가 너트나 나사의 나사산에 들어가지 않도록 주의하십시오. 에폭시가 굳으면 직사각형 상단에서 1인치 구멍에 16 72 나사를 삽입하고 너트에 나사로 고정합니다.

모델링 점토를 제거하고 나사를 조여 스페이서가 제자리에 단단히 고정될 수 있는지 확인합니다. 인젝터 어레이 시스템은 뇌의 거의 모든 좌표 세트에 맞게 사용자 정의할 수 있습니다. 먼저, 관심 종의 뇌 지도(brain atlas)에서 원하는 주사 부위의 좌표를 찾고 고정 관념에서 사용하는 적절한 좌표로 변환합니다.

이 데모에서는 마우스를 사용할 것이고 세 개의 주입 부위가 있을 것이므로 주입기용 튜브가 세 개 있을 것입니다. X, y 및 Z 좌표는 마우스 뇌 아틀라스의 미디어 측면, 전방, 후방 및 또는 복부 좌표에 해당합니다. 다음으로, Harvard 장치에서 나온 것과 같은 주입 인출 주사기 펌프에 있는 3개의 10마이크로리터 해밀턴 주사기는 각 폴리에틸렌 튜빙 조각에 대해 각 해밀턴 주사기의 바늘에 3피트 길이의 폴리에틸렌 튜빙 조각을 단단히 부착합니다.

F 2 52 튜빙 슬리브를 열린 끝 부분 위로 밀어 넣고 P 6 27 너트 및 P 2 35 fal을 사용하여 P 200 튜빙 어댑터에 부착합니다. 맞춤형 인젝터 어레이를 구성하려면 모델 미니 밀과 0.011인치 직경의 드릴 비트를 사용하여 32인치 두께의 PCB 프로토보드 공간에 3개의 구멍을 뚫습니다. 밀에서 보드를 제거하기 전에 사출 부위의 상대적인 X 및 Y 좌표에 따라 3 개의 구멍을 뚫고 직경의 드릴 비트를 사용하여 작은 구멍 주위에 직사각형을 뚫습니다.

다음으로, 개별 인젝터를 각 구멍의 중간에 삽입하여 서로 평행하게 단단히 고정됩니다. 인젝터 어레이를 형성하기 위해 보드에 에폭시로 코팅합니다. 인젝터 어레이를 입체 클램프에 부착합니다.

프로토 보드의 한쪽 모서리를 아크릴 직사각형 사이에 놓고 입체 cl의 나사를 조입니다.amp. 그런 다음 고정 관념의 부착 메커니즘을 사용하여 클램프의 금속 캐뉼라를 스테레오 세금에 부착합니다. 다음 단계는 다른 인젝터와 부딪히지 않고 직선 모서리가 있는 측면에서 접근할 수 있는 외부 인젝터 중 하나에 대해 현미경으로 수행됩니다.

프로토 보드의 바닥을 넘어 확장되는 팁을 자릅니다. dremel 도구로 팁을 평평하게 만듭니다. 다음으로, 입체선 암의 범위 내에서 안정적인 기준점을 선택하고 외부 주입기의 평평한 끝이 이 기준점에 오도록 주입기 배열을 이동합니다.

해당 좌표와 함께 두 번째 인젝터를 선택합니다. 첫 번째 인젝터 좌표와 두 번째 인젝터 좌표 사이의 높이 또는 Z 방향의 상대적 차이만큼 Z축을 따라 인젝터 어레이를 이동합니다. 팁이 이제 기준점의 높이에 오도록 이 두 번째 인젝터를 자르고 Dremel 도구로 평평하게 만듭니다.

주입기 어레이는 X 및 Y 방향으로 이동하여 주입기 팁과 기준점을 쉽게 비교할 수 있습니다. 나머지 주입기에 대해 이 트리밍 프로세스를 반복하면 주입기 어레이를 전체 시스템에 조립할 준비가 됩니다. 전체 시스템을 조립하려면 이전에 제작된 정위 클램프와 맞춤형 주입기 어레이가 필요합니다.

인젝터 어레이를 멸균한 후 각 인젝터의 백엔드, 트리밍되지 않은 끝을 파란색 F two 40 튜빙 슬리브에 삽입합니다. P 2 35 너트 및 P 200 freal을 사용하여 인젝터의 뒤쪽 끝을 폴리에틸렌 튜브로 Hamilton 펌프에 이미 연결된 나사산 어댑터에 부착합니다. 27 게이지 바늘을 사용하여 멸균 실리콘 오일을 Hamilton 주사기 뒷면에 주입하여 Hamilton 주사기에서 인젝터 팁까지 전체 시스템이 채워지도록 합니다.

기포가 유입되지 않도록 각별히 주의하십시오, 그렇지 않으면 주입되는 바이러스의 양이 정확하지 않거나 바이러스가 전혀 주입되지 않을 수 있습니다. Hamilton 펌프에서 Hamilton 시린지가 교체됨에 따라 시린지에서 가능한 한 많은 양의 실리콘 오일이 유지됩니다. 실험에 두 개 이상의 주사기가 필요한 경우 여기에서 한 것처럼 Hamilton 펌프에 스페이서를 배치할 수 있습니다.

또는 Harvard 장치에서 멀티 랙 업그레이드 키트를 구입하여 한 번에 최대 10개의 주사기를 수용할 수 있습니다. 바이러스를 쥐의 뇌에 주입하려면 먼저 동물 프로토콜에 적합한 진통제를 투여하십시오. 마취된 마우스를 스테레오 공격에 넣고 발가락 꼬집음으로 동물이 충분히 마취되었는지 확인합니다.

그런 다음 눈 사이부터 귀 사이까지 피부의 정중선을 따라 한 번 절개합니다. 피부를 뒤로 당겨 두개골을 드러내고 근막을 청소합니다. 당겨진 유리 피펫을 스테레오 공격에 부착합니다.

bgma와 lambda가 같은 높이로 정렬되고 이를 연결하는 선이 스테레오 어택의 Y축과 평행이 될 때까지 이어바의 위치를 조정합니다. bgma에서 유리 피펫 끝으로 스테레오 공격을 0으로 만든 다음 팁을 주사 부위 중 하나의 x 및 Y 좌표에서 두개골 약간 위에 배치합니다. 치과 드릴을 사용하여 30 게이지 바늘로 매우 얇은 뼈 층이 남을 때까지 팁 아래의 두개골을 조심스럽게 드릴다운하고 올바른 x 및 y 좌표에서 층의 작은 조각을 부드럽게 잘라내어 경막을 노출시킵니다.

이 구멍은 이런 식으로 인젝터 중 하나에 맞을 만큼 충분히 커야 합니다. 두개골의 각 주사 부위에 해당하는 x 및 y 좌표의 두개골에 0.25mm 너비의 작은 구멍이 뚫려 있습니다. 드릴링이 완료된 후 유리 정렬 피펫을 버리고 입체 택시 클램프를 사용하여 맞춤형 인젝터 어레이를 스테레오 세금에 부착합니다.

주입기 어레이의 각도를 올바르게 설정하려면 주어진 기준점으로 보정할 두 개의 외부 주입기를 선택합니다. 주입기 중 하나를 기준점과 일치시킨 후 이 주입기의 주입 부위와 다른 주입기 사이의 상대적인 X 액센트 Y 거리를 고려하십시오. 인젝터 어레이를 x 및 y 방향으로 이러한 상대 거리만큼 이동합니다. 두 번째 인젝터가 기준점과 정렬되지 않으면 금속 캐뉼라가 느슨해지고 회전합니다.

주입기 어레이가 올바른 각도가 될 때까지 이 과정을 반복적으로 반복합니다. Hamilton 펌프의 리필 속도를 분당 1마이크로리터로 설정하고 주사기가 2마이크로리터 지점 이상이 될 때까지 인젝터에 실리콘 오일을 다시 채웁니다. 이는 완충 오일의 양을 제공하므로 앞에서 설명한 대로 주사기 뒷면에서 실리콘 오일로 전체 시스템을 다시 채울 필요 없이 Hamilton 펌프를 사용하여 오일을 앞으로 밀어 팁의 기포나 막힘을 쉽게 제거할 수 있습니다.

두개골에 깨끗한 파라폼 조각을 놓고 인젝터를 파라폼 위로 부드럽게 내립니다. 1마이크로리터의 바이러스를 각 부위에 전달하려는 경우, 1.5마이크로리터의 바이러스를 분당 1마이크로리터의 동일한 리필 속도로 각 부위의 퍼퓸에 피펫으로 주입합니다. 각 주사기에 1.2마이크로리터의 바이러스를 다시 채웁니다.

bgma에서 가장 긴 인젝터의 끝을 0으로 만든 다음 인젝터 어레이를 해당 인젝터의 x 및 Y 좌표로 이동합니다. Z 깊이를 수정하기 위해 30 게이지 바늘로 만든 작은 구멍을 통해 인젝터 어레이를 내립니다. 각 주입기를 통해 분당 0.1마이크로리터 이하로 1마이크로리터의 바이러스를 주입합니다.

주사가 확산될 때까지 30분 동안 그대로 두십시오. 30분 후 뇌에서 주입기 배열을 천천히 추출합니다. 그런 다음 각 인젝터의 막힘을 확인하기 위해 분당 0.1마이크로리터의 동일한 속도로 주입하도록 Hamilton 펌프를 설정합니다.

그런 다음 분당 2마이크로리터의 속도로 2마이크로리터의 에탄올을 다시 채우고 주입하여 인젝터를 청소합니다. 마지막으로, 인젝터에 실리콘 오일을 다시 채워 각 Hamilton 주사기에서 2마이크로리터의 완충 구역을 유지합니다. 이 그림은 방금 표시된 주입기 어레이를 사용하여 3개의 캐뉼라를 포함하고 마우스 뇌의 분산된 부분에 바이러스 시약을 전달한 결과를 보여줍니다.

이 경우, 바이러스의 유전자 페이로드에는 형광 분자 GFP가 포함되어 있어 한 번에 표지된 세포의 형광 부피가 3개 생성됩니다. 원칙적으로 임의의 수의 캐뉼러를 사용하여 바이러스 주입기 어레이를 구축할 수 있습니다. 예를 들어, 여기에는 16개의 주입기로 해마 중 하나의 ca를 표적으로 하는 양측에 적합한 주입기 배열이 있습니다.

오늘 보여드린 프로토콜을 사용하면 3차원 패턴으로 바이러스를 뇌에 전달하여 회로 수준의 형질전환 효과를 효과적으로 생성할 수 있습니다. 또한, 병렬 주입기 어레이는 임의의 유체 시약을 뇌에 전달하는 데 사용될 수 있으며, 예를 들어 도파민 작용제는 머리 고정 행동 동물의 특정 신경 회로에 패턴 방식으로 전달될 수 있습니다. 지켜봐 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.