Microprism를 사용하여 딥 두피 레이어의 생체내 이미징에서

형광 현미경 검사 기술은 특히 뇌 조직과 같은 고광 산란 물질에서 조직 내부 깊숙한 곳의 구조를 이미지화하는 능력이 제한적입니다. 두 개의 광자 현미경 검사의 경우에도 신피질 표면에서 500미크론 이상 떨어진 신경 구조의 고품질 생체 내 이미지를 생성하는 것은 매우 어려울 수 있습니다. 여기서 녹색 선은 500미크론의 깊이를 나타냅니다.

일반적으로 신피질층 4, 5, 6층은 표면에서 500미크론 이상 떨어져 있습니다. 우리는 신피질에 삽입된 1mm 유리 마이크로 프리즘이 어떻게 표면을 형성하고 깊은 피질층 안팎으로 빛을 전달할 수 있는지 보여줄 것입니다. 마우스에서 이 기술을 사용하면 1mm 시야각을 가지며 일반적으로 절단된 뇌 조직에서만 발견되는 이미징 관점에서 6개의 피질 층을 모두 동시에 시각화할 수 있습니다.

마이크로 프리즘은 긴 정점 수상돌기와 신피질의 복잡한 혈관 네트워크를 가진 5층 초금속 세포체를 시각화할 수 있는 넓은 시야를 제공하는 동시에 미세 모세혈관을 통한 수지상 가시와 적혈구 흐름을 해결할 수 있는 공간 해상도를 유지합니다. 제 이름은 토마스 치아(Thomas Chia)이고, 예일 대학교 의생명공학과 마이클 레빈(Michael Levine) 교수 연구실의 대학원생입니다. 이 비디오에서 논의할 프로토콜은 1mm 직각 유리 마이크로 프리즘을 사용하여 마우스 신피질에서 1mm 깊이의 구조물에 대한 형광 이미지를 생성하는 방법에 대한 것입니다.

우리가 사용하는 마이크로 프리즘은 Opto Sigma Corporation에서 구입한 BK seven glass로 만든 1mm 직각 프리즘입니다. 마이크로 프리즘은 가능할 때마다 집게를 사용하여 취급합니다. 마이크로 프리즘의 빗변은 400에서 2000 나노미터까지 97% 이상의 반사율을 제공하기 위해 향상된 은으로 코팅되어 있습니다.

이것은 laser excitation light와 허용된 형광 모두의 내부 반사를 제공합니다. 우리는 작은 동물 이미징이 가능한 맞춤형 2광자 현미경을 사용합니다. 정위 장치에 부착된 동물은 3축 전동 스테이지에 배치됩니다.

현미경은 스캔 이미지를 실행하는 Windows PC에 연결됩니다. 소프트웨어 스캔 이미지는 Polo Gudo 등이 MATLAB으로 작성한 이미지 획득 소프트웨어입니다. 마이크로 프리즘 이미징의 경우 10 24 x 10 24 또는 5개의 12 x 5 12 픽셀의 해상도로 이미지를 수집합니다.

또한 일반적으로 라인당 2밀리초 또는 라인당 4밀리초로 스캔합니다. 이 프로토콜의 중요한 측면은 마이크로 프리즘과 함께 사용되는 현미경 대물렌즈의 유형입니다. 실험에는 두 가지 유형의 목표가 사용됩니다.

왼쪽의 대물렌즈는 넓은 시야 이미징을 위한 낮은 개구수 공기 대물렌즈이며, 이 경우 4 x 0.28 NA Olympus 대물렌즈입니다. 오른쪽의 대물렌즈는 0에서 2mm의 유리로 유도되는 구면 수차를 최소화할 수 있는 유리 보정환이 있는 40 x 0.60 높은 NA 공기 대물렌즈입니다. 수술 및 마이크로 프리즘 삽입을 위해 마우스를 준비하기 위해 첫 번째 단계는 외과 적 절차에 적합한 수준으로 동물을 적절하게 마취시키는 것입니다.

먼저, 정해진 복용량에 따라 동물의 체중을 기록합니다. 적절한 양의 케타민과 자일라진 칵테일을 주사기로 끌어당깁니다. 마취제는 28게이지 바늘을 사용하여 IP 주사를 통해 전달됩니다.

일단 쥐가 외과 수술에 적합한 마취 평면에 도착하면, 동물 머리의 털 대부분을 40 번 칼날로 떨림으로 깎습니다. 그런 다음 머리의 나머지 털에 나레를 적용하여 마이크로 프리즘을 방해할 수 있는 털이 없는 표면을 만듭니다. 이미징하는 동안, 5분 후, NA를 청소합니다.면봉을 사용하여 마취된 동물을 마우스 정위 장치에 적절하게 배치합니다.

수술 절차와 영상 촬영 세션 동안 동물은 섭씨 36도로 설정된 물이 채워진 발열 패드에 보관됩니다. 동물의 머리를 제자리에 제대로 고정한 후 두개골의 내측선을 따라 깨끗하게 절개합니다. 피부를 분리하기 위해 소량의 3% 과산화수소를 면봉에 넣고 두개골에 바르면 두개골과 피부 사이의 막을 제거할 수 있습니다.

과산화수소는 또한 개두술을 수행하고 마이크로 프리즘을 삽입해야 하는 위치를 아는 데 중요한 랜드마크인 BMA를 밝히는 데 도움이 됩니다. 개두술을 시작하기 전에 이어바와 바이트 바를 적절하게 조정하여 노출된 두개골이 기본적으로 테이블과 수평이 되도록 기울입니다. 이것은 개두술을 위한 더 나은 플랫폼을 제공합니다.

작은 치아 버는 개두술을 위한 Dremel 도구에 연결됩니다. 우리는 속도를 약 7, 000에서 10, 000 RPM으로 설정합니다. 치아 버는 뼈에 사각형 홈이 생길 때까지 두개골을 따라 걷어냅니다.

사각형의 측면은 길이가 약 2-3mm이고 중심이 있습니다.1.5mm의 코들, 1mm의 외측 레마는 두개골을 통해 작은 구멍이 생길 때까지 뼈를 계속 얇게 만듭니다. 한 쌍의 집게로 뼈 피판을 들어 올릴 수 있습니다.

마이크로 프리즘이 피질에 삽입되기 전에 경막을 제거해야 합니다. 출혈은 몇 분 동안 혈액이 표면에서 응고되도록 하는 것이 가장 좋습니다. 그 후, 프리즘과 피질의 정렬을 돕기 위해 수술용 스펀지를 사용하여 응고된 혈액을 제거합니다.

마이크로 프리즘의 수직면은 겸자의 손잡이와 평행하게 정렬되어 있습니다. 프리즘이 제대로 유지된 상태에서 프리즘의 상단이 신피질 표면과 같은 높이가 될 때까지 전체 마이크로 프리즘을 삽입합니다. 여기서 우리는 신피질에 놓여 있는 프리즘을 볼 수 있습니다.

올바르게 삽입되면 마이크로 프리즘은 올바른 위치에 유지되어야 합니다. 그로 인한 출혈은 경미하며 작은 수술용 스펀지로 흡수할 수 있습니다. 프리즘이 제자리에 놓이면 동물은 동물과 함께 이미징할 준비가 된 것입니다.

저배율 대물렌즈에서는 뇌 표면의 마이크로 프리즘을 통해 레이저 래스터 스캐닝을 볼 수 있습니다. 다음은 노란색 형광 단백질을 발현하는 형질전환 마우스에서 촬영한 이미지의 몇 가지 대표적인 예입니다. 마이크로 프리즘을 사용하는 5층 피질 뉴런에서, 피질 표면에서 거의 1mm 아래에 있는 5층의 큰 초금속 세포체의 집합을 볼 수 있습니다.

또한 유리 보정환과 함께 높은 개구수 대물렌즈를 사용하여 Tufts로 분기하기 전에 모든 표재층을 통해 확장되는 정점 수상돌기도 볼 수 있으며, 이 경우 수지상 가시를 분해할 수 있습니다. 층 5 초금속 뉴런의 정점 수상돌기에서 수지상 가시는 미크론 이하의 구조이며 일부는 노란색 화살촉을 사용하여 이미지에서 식별됩니다. 또한 확립된 꼬리 정맥 주입 기술을 사용하여 플루오레세인 덱스트란(fluorescein dextran)과 같은 형광 염료로 피질 혈관에 라벨을 붙일 수 있습니다.

이 기술을 사용하면 깊은 층에서 더 큰 구경의 혈관이 PIA를 향해 확장되고 분기되어 미세 모세관 네트워크를 형성하는 것을 볼 수 있습니다. 신피질에 있는 이 섬세한 미세 모세혈관 네트워크는 높은 개구수 대물렌즈를 사용하여 가장 잘 평가됩니다. 또한, 라인 스캔을 통해 깊은 신피질 모세혈관에서 적혈구 속도와 플럭스를 측정할 수 있습니다.

빨간색 선은 마이크로 프리즘을 통한 모세관 이미지의 선 스캐닝 패턴을 나타냅니다. 적혈구는 형광 염료를 흡수하지 않기 때문에 어두운 줄무늬로 나타납니다. 하단의 이미지는 한 AE에는 공간 차원이 있고 다른 AE에는 시간 차원이 있는 라인 스캔의 결과입니다.

이것의 AE는 모세 혈관을 통한 적혈구의 흐름과 속도를 계산할 수 있습니다. 마이크로 프리즘은 동물에게 사용된 후 여러 번 재사용할 수 있습니다. 그러나 남아 있는 생물학적 물질을 제거하려면 적절하게 청소해야 합니다.

이것은 프리즘을 소량의 염산에 담근 다음 메탄올에 담그면 달성할 수 있습니다. 그런 다음 깨끗한 마이크로 프리즘을 피처 사용까지 렌즈 종이로 감쌀 수 있습니다. 이것으로 마우스의 생체 내 피질 이미징을 위한 마이크로 프리즘 사용에 대한 프로토콜의 결론을 내렸습니다.

이미징 실험에서 마이크로 프리즘을 사용하는 것은 비교적 간단하며 신피질에 대한 생체 내 연구와 관련하여 많은 이점을 제공합니다. 이 기술이 흥미롭고 향후 실험실에서 사용할 수 있는 기술이라는 것을 알게 되었기를 바랍니다. 시청해 주셔서 감사하고 행운을 빕니다.