2009년 8월 21일
우리는 조사 스캔 전기 분무 이온화 질량 분광법 (ESI / MS)를 사용하여 효모의 수많은 지질 수종을 식별하기위한 새로운 양적 lipidomics 방법을 설명합니다. 이 방법은 현재 lipids, 감도 및 속도의 다양한 분자 형태를 해결하는 능력 지질 식별 및 부량 사용할 방법을 초과했습니다.
이 프로토콜을 사용하면 효모 지질의 주요 성분을 신속하게 분석할 수 있습니다. 효모 세포를 수확하고 세척하는 것으로 시작됩니다. 세척된 세포를 1-2개의 클로로포름, 메탄올 혼합물에 넣고 유리 구슬로 용해시킵니다.
클로로포름과 물을 첨가하면 두 상이 분리됩니다. 유기상(organic phase)을 수집하여 건조시킨 다음 지질막을 클로로포름에 용해시켜 질량 분광법(mass spectroscopy) 전에 보관합니다. 추출된 지질은 클로로포름 및 메탄올에 수산화암모늄으로 희석되고 내부 표준물질의 혼합물이 추가됩니다.
이제 지질 용액을 질량 분석기에 직접 주입할 수 있습니다. 안녕하세요, 저는 콘코디아 대학교 생물학과 블라디미르 테코 연구실의 사이먼 보크입니다. 오늘은 질량 분광법을 사용하여 효모 지질을 정량화하는 방법을 보여 드리겠습니다.
우리는 실험실에서 이 절차를 사용하여 다양한 성장 조건에서 효모 지질의 변화를 연구합니다. 시작하겠습니다. 이 절차를 시작하기 위해 Resus는 이전에 준비된 냉동 효모 펠릿을 1.6ml의 얼음, 차가운 증류수에 현탁시키고 1.6ml의 세포 현탁액을 고속 유리 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
이 절차 전반에 걸쳐 추출된 지질을 사용한 모든 조작은 유리 피펫 또는 주사기를 사용하여 수행됩니다. 플라스틱은 큰 배경 신호를 생성하므로 클로로포름과 접촉할 경우 1:2 비율로 클로로포름 메탄올 혼합물 6ml를 추가하고 einor 튜브에서 측정한 유리 구슬 0.8ml를 세포 현탁액에 추가하여 지질 추출을 시작합니다. 물에 현탁된 클로로포름, 메탄올 및 효모에 대해 1:2 대 0.8의 비율이 유지되는 한 정확한 부피는 중요하지 않습니다. 소용돌이.
세포 현탁액과 유리 구슬은 매번 1 분씩 두 번 혼합하고, 2 밀리리터의 클로로포름을 첨가하고 부드럽게 혼합 한 다음 실온에서 가끔 혼합하여 5 분 동안 배양합니다. 5분 배양 후 증류수 2ml를 넣고 부드럽게 섞습니다. 그런 다음 다시 실온에서 가끔 섞어 5분 동안 배양합니다.
여기에서도 클로로포름, 메탄올, 물에 대해 특정 부피보다 2:2:1.8의 비율을 유지하는 것이 더 중요합니다. 두 번째 배양이 완료되면. 실온에서 3000Gs에서 5분 동안 원심분리하고, 이 첫 번째 추출의 모든 상층액을 새로운 고속 유리 원심분리기 튜브에 수집하고 나머지 세포 펠릿에 3.2ml의 클로로포름을 첨가하여 두 번째 지질 추출을 수행합니다.
클로로포름이 첨가된 세포 알갱이를 매번 1분씩 두 번 소용돌이칩니다. 그런 다음 실온에서 3000Gs에서 5분 동안 원심분리하고 이 두 번째 추출의 상층액을 첫 번째 추출 후에 수집된 상층액에 첨가합니다. 다음으로 수집된 상등액을 5분 동안 원심분리합니다.
실온에서 3000Gs에서 추출된 지질은 이제 하부 유기상에 용해됩니다. 상부 수성상을 버리고 하부상을 새로운 고속 유리 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 질량 분석기 원심 분리기에서 더 깨끗한 스펙트럼을 생성하기 위해 실온에서 3000Gs에서 5분 동안 유기상을 만들고 전체 상층액을 유리 바이알로 옮깁니다.
용해된 지질을 질소로 건조시키고 건조된 지질 필름을 500마이크로리터의 클로로포름에 용해시킨 다음 질량 분석법으로 샘플을 분석할 준비가 될 때까지 섭씨 영하 20도에서 보관합니다. 먼저 함께 작성된 프로토콜에 있는 표 1에 나열된 대로 클로로포름의 지질의 표준 혼합물을 준비합니다. 각 지질은 서로 다른 클래스를 나타냅니다.
이 용액은 추출된 지질을 질량 분석기에 주입하기 전에 나중에 사용할 수 있도록 섭씨 영하 20도에서 보관할 수 있습니다. 10마이크로리터의 시료를 10마이크로리터의 표준 지질 혼합물과 결합했습니다. 표준 대 표본 비율은 필요에 따라 변경할 수 있습니다.
분당 1마이크로리터의 유속으로 작동하는 나노 전기 분무 소스가 장착된 마이크로 질량 Q - F 2 질량 분석기를 사용하여 샘플과 표준 지질 혼합물을 분리합니다. 설정은 함께 제공되는 서면 프로토콜의 표 2에 자세히 설명되어 있습니다. Q to F 질량 분석기의 고분해능을 사용하는 것이 유리하지만 필수 요구 사항은 아닙니다.
정확한 기기 매개변수는 질량 분석기마다 다릅니다. 데이터 수집 후 질량 스펙트럼이 평활화되고 배경이 제거되며 피크가 중앙에 배치됩니다. 마지막으로 피크 목록을 Excel로 내보냅니다.
그런 다음 각 지질 유리의 피크를 내부 표준물질로 정규화합니다. 응용 분야에 따라 de isotope 및 deconvolution과 같은 추가 후처리를 수행해야 할 수도 있습니다. 이 방법을 사용하면 효모 지질의 주요 성분을 신속하게 심층적으로 측정할 수 있습니다.
여기서 우리는 하나의 지질을 강조했는데, 이는 de 동위원소 de 뒤얽히고 내부 표준으로 정규화되었습니다. 방금 효모 지질을 분리하는 방법과 전기 디스플레이 이온화 질량 분광법을 사용하여 효모 지질을 측정하는 방법을 보여 드렸습니다. 이 절차를 수행할 때 플라스틱 사용을 피하고 시료를 선형 농도 범위로 유지하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.
이 방법은 매우 유연하며 많은 볼륨에서 필요에 따라 변경할 수 있습니다. 이 추출 프로토콜은 박층 크로마토그래피 및 다차원 질량 분광법과 같은 다른 지질 분석 방법에도 적합합니다. 그게 다야.
시청해 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.
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이 기사는 조사 스캔 전기분무 이온화 질량 분석법(ESI/MS)을 사용하여 효모에서 다양한 지질 종을 식별하는 새로운 정량적 지질체학 방법을 제시합니다. 이 방법은 지질 식별, 정량화, 감도 및 속도 측면에서 기존 기술을 크게 개선합니다.
Quantitative lipidomics using electrospray ionization mass spectrometry (ESI/MS) enables rapid, high-sensitivity profiling of yeast lipidomes, supporting mechanistic de-risking and target validation in early discovery. This workflow accelerates lipid identification and quantification, providing robust data for pathway interrogation and functional studies. The approach is directly relevant for biopharma teams seeking scalable, reproducible lipidomic analyses to inform discovery-stage decisions.
This ESI/MS lipidomics method fits from early discovery through lead identification, supporting both hypothesis-driven and screening workflows.