Name: 형광 활성 세포 정렬 (외과)에 의해 특정 세포 인구의 정제 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-10T18:30:00.000+00:00
Duration: 15 min 29 s
Description: 학습하세요 형광 활성 세포 정렬(FACS)을 사용하여 B세포와 CD4 T세포를 정제하는 방법을. 이 기술은 림프구 및 골수 세포 기능 연구에 필수적인 고순도 세포 집단을 얻는 데 활용됩니다.

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우리는 유동세포계측법 코어를 사용하는 그의 지원을 위해 박사 빌 Cashdollar 감사하고 싶습니다.

<ol><li> 프로세스를 시작하기 전에 다음 항목 수집 및 준비에 필요 : <ol style="list-style-type:lower-roman;"><li> 얼음 </li><li> 단일 색상 컨트롤을 얼룩 얼룩을위한 세포 및 12 X 75mm 흐름 튜브 15 ML 원뿔 튜브. </li><li> 버퍼 얼룩 : 인산염은 버퍼 호수 (PBS) + 3% 소태아 혈청 (FCS) </li><li> Pipettes </li><li> FC 블록 (필요한 경우) 및 얼룩 항체. 항체가 최적의 얼룩을 위해 titrated해야합니다. </li><li> 보상 비즈 </li><li> 중지 버퍼 : 행크의 밸런스드 소금 솔루션 (HBSS) + 25 MM의 HEPES + 3% FCS </li><li> Trypan 파랑, hemocytometer </li><li> 셀 스트레이너 (40 μm의 나일론) </li><li> 컬렉션 튜브 : 컬렉션 튜브의 두 가지 유형을 사용할 수 있습니다) 12 X 75mm의 폴리스티렌 튜브 (300 μl FCS 25 MM HEPES를 포함) 또는 b) 15 ML 원뿔 튜브 (1 ML FCS + 25 MM의 HEPES를 포함). 높은 혈청 농도가 가진 풍부한 매체 정렬 세포의 수집에 사용될 수 있습니다. </li></ol></li><li> 시작 세포 인구의 단일 세포 현탁액를 생성합니다. </li><li> 선택 사항 : 보완 고갈이나 자기 정렬과 같은 대량 정화 방법으로 원하는 세포 인구 더욱 돋보이게합니다. 농축 단계의 주요 장점은 그것이 정렬 시간을 단축한다는 것입니다. </li><li> 버퍼 얼룩과 함께 한 세포를 씻으십시오. </li><li> 뜨는을 취소하고 효율적인 얼룩 50 X 10 6 농도에서 버퍼를 얼룩의 세포를 resuspend. </li><li> 옵션 : FcR 높은 수준을 표현 세포 들어, 적절한 차단 방법을 사용하여 수용체를 차단합니다. 선택 방법은 10-15 분 얼음 FcγR에 바인딩 mAb를 사용하는 것입니다. 이러한 항체는 상업적으로 사용할 수 있습니다. </li><li> 원하는 세포 인구를 얼룩 및 얼룩 버퍼 두 세척 다음 어둠 속에 얼음에 20-30 분에 대한 부화 적절한 mAb를 (미리 정해진 농도에서) 추가합니다. 옵션 : 같은 propidium 요오드화물의 같은 중요한 염료와 스테 이닝, 죽은 세포를 (5) 분별에 포함될 수 있습니다. 멀티 컬러 얼룩이 사용하는 경우, 단일 색상 컨트롤이 필요합니다. 우리는 제조 업체의 프로토콜을 사용하여 단일 색상 컨트롤을 준비하는 BD의 CompBeads를 사용합니다. </li><li> 직접 복합 항체를 사용하지 않을 경우 해당 보조 항체 또는 Streptavidin의 공액를 사용하여 7 단계를 반복합니다. </li><li> 세척 후, 배지에 세포를 resuspend 등 Trypan 파랑과 같은 중요한 염료를 사용하여 세포 농도를 결정한다. </li><li> 15-20에 세포 농도를 조절 X 10 6 / ML. 정렬하는 동안 악기를 방해할 수있는 양식 클러스터, 스트레이너를 통해 세포를 필터링 세포 집단하십시오. </li><li> 설정 및 세포 분류기을 최적화합니다. 흐름 cytometer를 설정하는 과정은 생산에 따라 다양하고 적절하게 훈련받은 요원에 의해 수행되어야합니다. 일반적인 권장 사항은 다음과 같습니다 : <ol style="list-style-type:lower-roman;"><li> 정렬하는 세포 종류에 따라 적절한 노즐을 선택합니다. </li><li> 무균 종류 들어, 악기를 소독. </li><li> 레이저가 작동 확인 비즈와 계측기 품질 관리를 수행하고 정확하게 정렬합니다. </li><li> 필요한 컬렉션 장치를 설치하고 측면 스트림을 설정합니다. </li><li> (우리 BD 외과 아리아 세 레이저를 가지고 있으며 최대 9 색상으로 검색할 수 있습니다) 사용할 수있는 형광 레이블을 결정하는 설정 악기의 레이저와 검출기보세요. </li><li> 일단 그것이 형광 라벨이 세포 분류기에서 사용될 어떤 결정, 보상 (아래 설명)을 수행할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 대조군 샘플 및 단일 긍정적인 컨트롤을 사용하여 보정을 수행합니다. 보상은 두 감지기 사이의 스펙트럼의 중복을 제거하는 것이 필요합니다. 그것은 보상 증거가 바보되지 않습니다에 관련되고 부정적인 방법을 밝게 특정 마커 얼룩, 그리고 희미한과 부정적인 인구 사이에 가난한 해상도로 이어질 수 낮은 autofluorescence를 세포의 형광에 의해 영향을받습니다. 최상의 결과를 얻으려면, 실험 설계는 낮은 표현이 있거나 알려진 얼룩 패턴을 가지고 있지 않다는 걸 마커와 밝은 fluorochromes를 사용하여 포함해야합니다. 세포 인구와 높은 표현 사이 좋은 분리를 제공합니다 마커 빨간색이나 보라색 레이저에 의해 흥분 사람 같은 이합체의 fluorochromes와 함께 사용해야합니다. <ol style="list-style-type:lower-roman;"><li> 보상은 카파 라이트 마우스 IG의 사슬, 쥐 또는 쥐 / 햄스터를 특정 항체에 결합되었습니다 폴리스티렌 microparticles 아르 보상 비즈와 함께 수행할 수 있습니다. 구슬은 얼룩 강력한 신호를 가지고 실험 샘플과 같은 형광단을 가지고 하나의 스테인드 컨트롤을 준비 쉬운 방법을 제공하기 쉽습니다. </li><li> 에 대한 앞으로 분산형 (FSC)와 사이드 분산형 (SSC), 하나의 히스토그램을 표시하는 bivariate 음모를 포함하는 템플릿을 설정사용 각 fluorochrome. </li><li> 부정적인 제어 튜브를 실행하고 전달 분산형 (FSC)와 규모에 대한 관심의 인구를 배치 사이드 흩어 (SSC)를 조정할 수 있습니다. </li><li> 히스토그램의 맨 왼쪽 부분에있는 부정적인 인구 또는 autofluorescence를 배치하기 위해 형광 PMT 설정을 조정합니다. </li><li> 부정적인 제어 튜브를 기록합니다. </li><li> 단일 긍정적인 제어 튜브를 실행하고 각각의 튜브에 대한 데이터를 기록합니다. </li><li> 히스토그램에있는 데이터의 긍정적인 부분, 그리고 히스토그램의 부정 부분에있는 다른 간격 게이트 주변 간격 게이트를 그리십시오. </li><li> 수동 보상은 조정을 통해 이루어집니다 평균은 제외의 평균과 같다 때까지 탐지 (중앙값 로그 규모 평균보다 중심 경향의 좋은 견적입니다.) 이것은 실험에 사용된 fluorochrome 레이블의 각각에 대해 수행되어야합니다. </li><li> 평균을 조정하려면, 각 높거나 낮은 각 형광 매개 변수와 일치를위한 medians 때까지으로 밀접하게 가능한 스펙트럼 오버랩 값을 조정합니다. </li><li> 보상은 또한 분석 소프트웨어와 함께 자동으로 수행할 수 있습니다. 자동 보정 실험에 사용된 모든 fluorophores에 대한 대수 행렬을 계산 보상 컨트롤에서 기록된 데이터를 사용합니다. 이 값은 기본 색상의 검출기에 출혈이있는 이외의 원색의 기여를 빼야하는 데 사용됩니다. </li></ol></li><li> 정렬에 대한 실험 샘플을 기록하고 관심의 인구를 정​​의하는 게이팅 도구 및 subsetting 방법을 사용합니다. <ol style="list-style-type:lower-roman;"><li> FSC 대 SSC를 표시하고 게이트 관심의 인구를 게이팅 도구, 다각형, 사각형, 간격 또는 사분면을 사용하여 도트 플롯과 실험 템플릿을 설정합니다. 스캐터 줄거리는 세포 유형으로 구분됩니다 세포의 물리적 특성을 표시합니다. </li><li> 형광 게이팅 전략을 결정하는 가장 좋은 방법은 형광 빼기 1 (FMO) 컨트롤을 사용하는 것입니다. FMO 제어 관에는 실험에서 사용되는 모든 시약은 관심의 한 제외한 포함되어 있습니다. FMO는 dimly 스테인드 인구 및 광범위한 부정적인 인구 구별하는 데 도움이됩니다. </li><li> 실험 튜브 내에 문을 배치 위치를 결정하는 FMO 튜브에서 기록된 데이터를 사용합니다. </li></ol></li><li> 일단 빌 게이츠가 결정되었습니다, 게이츠는 외부 수집 튜브로 정렬을 선택하실 수 있습니다. 최대 네 개까지 게이츠 (또는 집단)에이 사용할 수있는 장비에 따라 한번에 정렬할 수 있습니다. </li><li> 4 실험 시료 튜브를 실행 ° C는 편향 접시를 설정하고, 샘플을 정렬합니다. 5 X 10 5 -1.5 X 10 6 세포는 12 X 75mm 튜브 및 1.5으로 정렬할 수 있습니다 X 10 6-4.5 X 10 6 세포가 15 ML 원뿔로 정렬할 수 있습니다. </li><li> 세포의 필요한 번호가 획득되면, 수동으로 정렬 중지합니다. </li><li> 정렬 세포 인구의 순도를 결정하는 포스트 정렬 분석을 수행합니다. </li></ol> 대표 결과 우리는 여기서 마우스 지라 B와 CD4 T의 셀 정렬 (그림 1)에 대한 결과를 표시합니다. Splenocytes는 PE 텍사스 레드 - 복합 백신 마우스 B220, FITC - 복합 백신 마우스 TCRβ 및 B 세포 (B220 + TCRβ -)과 CD4 T 세포 (CD4 + TCRβ +를 식별하는 CD4 방지 마우스 Alexafluor - 700 - 복합 물들일되었습니다 ). 정렬은 BD 외과 아리아 악기와 함께 연주했다. B 세포의 순결을 정렬 후&gt; 97% 및 CD4 T 세포의 순도는&gt; 98%였습니다. <img src="/files/ftp_upload/1546/1546fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. 지라 B 세포와 CD4의 순도는 외과 후에 세포를 T. 마우스 splenocytes이 방지 마우스 B220, TCRβ 및 CD4 항체 물들일되었습니다. B 세포에 대한 외과는 B220에 게이팅하여 BD 외과 아리아를 사용하여 수행되었습니다 + TCRβ - 세포 (그림 1A, 왼쪽 패널, 오른쪽 아래 사분면). 게시물 정렬 분석은 B 세포 (그림 1A, 오른쪽 패널)의 순도를 결정하기 위해 수행되었다. B220 얼룩은 Y 축에 대한 X 축 및 TCRβ의 얼룩에 표시됩니다. CD4 T 세포에 대한 외과가에 게이팅하여 동일한 흐름 cytometer를 사용하여 수행되었습니다 TCRβ + CD4 + 세포 (그림의 1B, 왼쪽 패널, 오른쪽 사분면). 게시물 정렬 분석 CD4의 T 세포 (그림의 1B, 오른쪽 패널)의 순도를 결정하기 위해 수행되었다. TCRβ 얼룩은 X 축 및 Y 축에 얼룩 CD4에 표시됩니다. 각 사분면에있는 %가 긍정적인 세포가 표시됩니다. <!--<img src="/files/ftp_upload/1546/1546fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2. 지라 CD4의 순도는 외과 후 T 세포. Murine 지라 T 세포는 B 세포에 의해 패닝의 제거에 의해 풍부하게되었다. 그 후, 세포는 안티 - 마우스 TCRβ 및 CD4 항체 (왼쪽 패널)와 스테인드되었습니다. 외과는 TCRβ + CD4 + 세포의 게이팅하여 BD 외과 아리아를 사용하여 수행되었다 (왼쪽 패널에서, 오른쪽 상단에 quadr개미). 게시물 정렬 분석 이상 99% (오른쪽 패널)가 T 세포의 순도를 결정하기 위해 수행되었다. TCRβ 얼룩은 X 축 및 Y 축에 얼룩 CD4에 표시됩니다. 각 사분면에있는 %가 긍정적인 세포가 표시됩니다. -&gt;

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외과는 정렬 인구의 매우 고순도 (95-100%)가 얻을 수있는 관심의 세포 인구를 정​​화에 대한 매우 복잡한 기술입니다. 따라서이 기술은 고순도가 필수 요건 (예 : microarray 분석)입니다 실험을 위해 특히 중요합니다. 둘 이상의 인구가 동일한 표면 마커의 표현의 다른 수준을 보유하고있는 정화해야 할 때 셀 인구가 매주 표현 표면 마커를 기반으로 정화해야하거나 외과는 정화의 다른 가능한 방법을 통해 특히 유리합니다. 예를 들어, 한계 영역의 정화 B 세포 (B220 + CD21 CD23 안녕 INT / 낮은)과 follicular B 세포 (B220 + CD21 INT ​​/ 낮은 CD23 안녕하세요) CD21과 CD23의 표현 수준에 따라. 외과의 또 다른 성장 응용 프로그램이 개별 세포의 분석 (3, 4)를 허용하는 단세포 정렬됩니다. 외과는 일반적으로 같은 녹색 형광 단백질 단백질 태그 (5)와 같은 유전자 표현 형광 단백질을 표현 정렬 전지하는 데 사용됩니다. 멸균 정렬이 수행되면 세포는 교양 수 있습니다. 그러나, 세포 생존 능력과 생산량은 정렬하는 동안 손상된 수 있습니다. 생존은 정렬을위한 셀 - 종속 최적의 온도를 사용하여 그들이 용량에 도달 후 즉시 수집 튜브를 처리하여 향상시킬 수 있습니다. 복구는 폴리 프로필렌 수집 튜브를 사용하여 일시적으로 혈청 리치 미디어와 반전 수집 튜브의 정렬 세포를 수집, 최적의 온도에서 수집 튜브를 유지하고 ~ 10 분 (http://cyto.mednet.ucla.edu에 대한 정렬 세포를 centrifuging 증가 수 있습니다 / Protocol.htm). 매우 고속 sorters의 개발은 임상 설정에서 유동 정렬의 응용의 가능성을 확장하고 있습니다. 외과의 가능성 임상 응용은 인간의 정자와 초기 질병 탐지 (6, 7) 정렬 치료 목적, 암 치료에 응용 프로그램, amniocentesis 교체에 대한 인간의 혈액에서 혈액 줄기 세포의 정화를 포함합니다. 여러 가지 빛깔의 얼룩의 경우, 항체 선택은 중요한 단계이며 fluorochromes는 각 특정 악기에 대한 검색 시스템에 따라 선택됩니다. 사용자의 요구에 따라 셀 sorters 및 레이저 구성 다릅니다를 판매 회사의 전화 번호가 있습니다. 따라서 하나는 단순히 호환성을 확인하지 않고 출판 연구에서 사용되는 동일한 항체를 사용할 수 없습니다. 최적의 항체의 선택을 위해, 하나는 검사되는 단백질의 표현 수준을 고려해야합니다. 희미한 fluorochromes가 높은 표현 표면 마커 (8)의 얼룩 사용할 수 있지만 일반적으로 밝은 가능한 fluorochrome - 태그 항체는 dimly 표현 표면 마커를 얼룩하는 데 사용해야합니다. 또한, 항체가 자신의 방출 스펙트럼 간의 중복과 같은 방법으로 선택해야하는 것은 최소화합니다. 여러 가지 빛깔의 얼룩의 경우, 그것은 아무 스펙트럼 중복이 없다는 fluorochrome 선택하는 매우 어렵습니다. 이 상황에서 보정이 수행됩니다. 보상은 수학적 감지기 (8-10)에 의해 measureable있는 다양한 fluorochromes의 배출 스펙트럼 사이의 형광 중복을 제거하는 것이 필요합니다. 즉, 하나 fluorochrome에서 형광 중복은 다른 fluorochrome의 배출 스펙트럼에서 빼서 수 있습니다. 보상 계산은 여러 가지 빛깔의의 얼룩 (9, 10)에 사용되는 각 fluorochrome에 대한 흠없는 제어 및 단일 긍정적인 컨트롤을 필요로합니다. 보상은 세포 또는 구슬을 사용하여 진행하실 수 있습니다. 구슬은 얼룩 강력한 신호를 가지고 실험 샘플과 같은 fluorophores을 가지고 하나의 스테인드 컨트롤을 준비 쉬운 방법을 제공하기 쉽습니다. 보상 비즈 관심의 세포 인구가 초기 시작 셀 인구 제한 때 특히 관심의 세포 표면 단백질이 낮은 수준에 표현되었을 때 유리하고 있습니다. 항체가 선택되고 나면, 그들의 활동은 적정 분석을 수행하여 최적화해야합니다. 외과의 기계가 매우 강력한 레이저를 가지고있다면 이것은 특히 중요합니다. 얼룩 항체의 suboptimal 농도의 사용은 전체 세포 인구에서 원하는 세포 인구의 가난 분리 발생할 수 있습니다. 높은 항체 농도의 사용은 항원이 아닌 특정 얼룩에 대한 기회를 증가시킵니다. 따라서 항체 적정는 긍정적인 인구와 최소한의 배경 얼룩 (8)의 최대 밝기를 제공하는 항체 농도의 선택을하실 수 있습니다. 외과 이제 세포의 subpopulations의 정화를위한 표준 기술이다. 그것은 하나의 세포 현탁액이 생성되고 항체가 원하는 세포 인구를 식별하는 사용할 수있는 수있는 모든 세포 유형을 구분하는 데 사용할 수 있습니다. 외과는 선택의 방법입니다되면 Highly 순수한 세포 집단이 필요합니다.

형광 활성 세포 정렬 (외과)에 의해 특정 세포 인구의 정제

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

실험 및 임상 연구는 종종 높은 세포 인구 투석을 필요로합니다. 외과 알려진 표현형의 세포 인구를 정​​화 선택의 기술입니다. 정화의 다른 일괄 방법 패닝, 보완 고갈과 자기 비드 분리를 포함합니다. 그러나, 외과는 다른 가능한 방법을 통해 몇 가지 장점이 있습니다. 외과는 대상 세포 인구가 차동 마커 밀도에 따라 분리를 필요로 식별 마커 매우 낮은 수준을 표현하거나 세포 인구 때, 원하는 인구의 매우 높은 순도가 요구하는 기본 방법입니다. 또한, 외과는 유전자 조작 형광 단백질 마커 같은 내부 얼룩이나 세포내 단백질의 표현에 따라 세포를 분리하는 유일한 가능한 정화 기술입니다. 외과 수 있도록 크기, 입도 및 형광에 따라 각각의 세포의 정화. 관심 세포를 정화하기 위해, 그들은 먼저 원하는 세포 인구 (1)에서 특정 표면 마커를 인식 찬란 - 태그 단클론 항체 (mAb), 물들일 수 있습니다. 흠없는 세포의 부정적인 선택도 가능합니다. 외과 정화는 용량과 적절한 소프트웨어를 정렬과 흐름 cytometer이 필요합니다. 외과 들어, 정지의 세포는 레이저의 앞에 하나의 세포를 포함하는 각각 방울의 스트림으로 전달됩니다. 형광 검출 시스템은 세포의 예정된 형광 매개 변수를 기반으로 관심이 세포를 감지합니다. 악기 관심 셀과 정전기 편향 시스템 적절한 수집 튜브 (2)에 부과 방울의 수집을 용이하게 들어있는 비말에 요금을 적용합니다. 얼룩함으로써 정렬의 성공은 식별 표지와 mAb의 선택의 선택에 크게 의존합니다. 정렬 매개 변수는 순도와 수율의 요구 사항에 따라 조정할 수 있습니다. 외과 전문 장비와 인력 훈련을 필요로하지만, 높은 세포 인구 정화의 고립을위한 최고의 방법입니다.

세포 집단의 생물 학적 및 화학적 분석을 필요로하는 많은 과학적인 연구를 위해 세포는 순도 높은 상태에 있어야합니다. 형광 활성 세포 정렬 (외과)는 순수한 세포 인구를 얻을 수있는 우수한 방법입니다.

실험 및 임상 연구에서는 종종 고도로 정제된 세포 집단이 필요합니다. FACS는 알려진... 세포 집단을 정제하기 위해 선택되는 기술입니다.

안녕하세요, 저는 Blood Center of Wisconsin의 Blood Research Institute에서 유세포 분석 전문가로 근무하고 있는 Hope Campbell입니다. 안녕하세요, 저는 Bonnie Dieter 박사님 연구실의 대학원생 STR Baso입니다. 저 또한 Blood Center of Wisconsin의 Blood Research Institute에 소속되어 있습니다.오늘은 형광 활성 세포 분류법(fluorescent activated cell sorting)을 사용하여 세포를 분리하는 절차를 진행하겠습니다. 이 절차는 실험실에서 림프구 및 골수성 세포 집단의 기능을 연구하는 데 사용됩니다. 이제 시작하겠습니다.본 절차에서는 마우스 세포로부터 B 세포와 CD4 T 세포를 정제합니다. 표적 세포의 시작 수는 필요한 세포 수와 이 방법을 사용하는 장비의 회수율을 기반으로 계산해야 합니다. B 세포와 CD4 T 세포의 일반적인 회수율은 85~90%입니다. 시작 SP 세포 집단은 대략 60~70%의 B 세포와 20~30%의 T 세포로 구성됩니다.따라서 $100 \times 10^6$개의 세포로 시작하면, FACS 분석을 시작하기 전에 5,000만에서 6,000만 개의 B 세포와 2,000만에서 3,000만 개의 T 세포를 회수할 수 있습니다. 프로토콜에 필요한 용액과 시약은 얼음 위에 두어야 합니다. 여기에는 3% fetal calf serum이 포함된 phosphate buffered saline으로 구성된 염색 버퍼, 3% fetal calf serum을 함유한 Hank's balanced salt solution(HBSS)에 조제된 25 mM HEPES로 구성된 현탁 버퍼, fetal calf serum으로 조제된 25 mM HEPES 용액, 염색 항체 및 보정 비즈(compensation beads)가 포함됩니다.본 프로토콜에는 다음과 같은 소모품 및 시약이 추가로 필요합니다. 15 milliliter 원추형 튜브, 12 by 75 millimeter 폴리스티렌 또는 폴리프로필렌 유속 튜브, 나일론 세포 스트레이너, trien blue 및 혈구 계수기입니다. 또한, 이를 수행하기 위해 소팅 수집 튜브를 미리 준비해야 합니다.300 µL의 HEPES FCS 용액을 플로우 튜브에, 또는 1 mL의 HEPES FCS 용액을 15 mL 원추형 튜브에 분주합니다. 이 튜브들은 수집 과정이 시작될 때까지 얼음에 보관해야 합니다. 원하는 세포군을 단일 세포 현탁액으로 만드는 것부터 시작하십시오.이 절차를 사용하여 분리한 세포를 배양하는 경우, 모든 세포 준비 과정은 조직 배양 후드 내에서 수행해야 합니다. 멸균 기술을 사용하여 얼음처럼 차가운 염색 버퍼를 추가해 세포를 한 번 세척하고, 튜브를 여러 번 뒤집어 세포를 재현탁합니다.그런 다음 4 °C에서 약 250 ×g로 7~8분 동안 세포를 원심분리합니다. 세척 조건은 세포 유형 및 농도에 따라 다를 수 있습니다. cytes의 경우, 10 mL의 염색 버퍼로 200 × 10⁶개의 세포까지 세척하십시오.세포 펠렛이 손상되지 않도록 흡입법으로 상층액을 조심스럽게 제거합니다. 그 다음, 세포를 100 µL당 최대 50 × 10⁶개의 농도로 얼음처럼 차가운 염색 버퍼에 재부유시킵니다. 튜브를 톡톡 치거나 부드럽게 볼텍싱하여 세포 펠렛을 재부유시킵니다.그런 다음, 6개의 셀 중 0.25 ~ 1 × 10개의 셀을 얼음 위에 놓인 새로운 12 × 75 mm 폴리스티렌 또는 폴리프로필렌 유동 튜브로 옮깁니다. 이를 나중에 미염색 대조군 샘플로 사용하기 위해 따로 보관합니다. 첫 번째 튜브의 세포 현탁액에 1차 항체를 추가하여 원하는 최종 농도를 맞춥니다. 여기서는 B 세포를 염색하기 위해 PE-Texas Red 접합 anti-B220 항체를 사용하며, T 세포를 염색하기 위해 ZE 접합 anti-TCR $\beta$ 및/또는 700 접합 anti-CD4 항체를 사용합니다. 튜브 바닥을 톡톡 치거나 가볍게 흔들어 혼합합니다.볼텍싱한 후 세포를 얼음 위에 놓고 어두운 곳에서 20~30분 동안 배양합니다. 배양 후, 상층액을 조심스럽게 제거한 다음, 10 mL의 차가운 현탁 완충액에 세포를 부유시키고 이전과 동일하게 원심분리하여 라벨링된 세포를 세척합니다. 이 단계를 반복하여 세포를 두 번째로 세척합니다.마지막으로, 얼음처럼 차가운 현탁 완충액(suspension Buffer)에 세포를 재현탁합니다. 1차 항체가 형광체에 직접 결합되어 있지 않은 경우, 표지된 2차 항체 또는 strep AVID 결합체를 세포 현탁액에 첨가하고, 배양 후 다시 세포를 얼음 위 암소에서 20분에서 30분 동안 배양합니다. 얼음처럼 차가운 현탁 완충액으로 세포를 두 번 세척합니다.얼음처럼 차가운 현탁 완충액에 세포를 재현탁한 후, 트라이판 블루(trypan blue)와 같은 생존 염색약과 혈구계수기(hemocytometer)를 사용하여 세포 농도와 생존율을 측정하십시오. 분리 과정 중 사멸했을 수 있는 세포 뭉침으로 인해 FACS 기기가 막히는 것을 방지하기 위해, 현탁 완충액을 추가하여 세포 농도를 10~20 × 10⁶ cells/mL로 조정하십시오.절차 및 염색. 분리 프로토콜을 시작하기 직전에 세포를 드립 스트레이너(drip strainer)로 여과합니다. 스트레이너의 공극 크기는 세포 유형에 따라 선택해야 하며, 세포의 경우 40 micrometer 공극 크기의 스트레이너를 사용합니다.부피에 따라 15 mL 원추형 튜브 또는 12 by 75 mm 유세포 분석용 튜브에 여과된 세포를 수집합니다. 그리고 사이토미터가 분리 절차를 위해 설정되는 동안 세포를 얼음 위에 둡니다. 단일 색상 양성 대조군으로 BD comp beads를 사용하는 경우, 분석에 사용된 각 색상당 하나의 대조군 튜브와 염색하지 않은 음성 대조군 튜브 하나를 준비합니다.비드 현탁액을 충분히 볼텍싱한 후, 사용된 각 색상과 음성 대조군에 대해 100 µL의 현탁 버퍼가 담긴 튜브에 음성 및 양성 비드 현탁액을 각각 한 방울씩 첨가합니다. 다음으로, 각 양성 대조군 튜브에 라벨링된 항체 1 µL를 첨가합니다. 본 실험에서는 PE Texas'Red B 20 항체를 사용하여 하나의 튜브를 준비합니다.fit ETCR beta 항체와 lor 700 CD four 항체를 각각 사용한 것을 튜브 바닥을 튕겨 섞어준 뒤, 실온의 암소에서 15~30분 동안 배양합니다. 염색 버퍼 2 mL로 비드를 한 번 세척하고 200 Gs에서 10분 동안 원심분리합니다. 흡입법으로 상층액을 제거하고 비드 펠릿을 200~500 µL의 염색액에 다시 현탁합니다.유세포 분석기의 버퍼 설정은 제조사에 따라 다르며, 적절한 교육을 받은 인원만 수행해야 합니다. 본 세포 분리 절차는 BD FACSAria를 사용하여 수행됩니다. 분리 전, 분리할 세포 유형에 따라 적절한 노즐을 선택하십시오.사용 가능한 노즐 크기는 70 µm, 100 µm 및 130 µm입니다. 노즐 크기는 분리하려는 세포 크기의 최소 3배여야 하므로, 림프구의 경우 70 µm 노즐을 선택합니다. 장비의 무균 분리 옵션을 사용하여 무균 세포 분리를 수행할 수 있습니다.이 옵션을 사용하여 제조업체의 지침에 따라 전체 시스 경로를 70% ethanol로 오염 제거합니다. 시스 필터를 교체하고 PBS를 멸균된 PBS로 교체하십시오. 사이토미터 준비가 완료되면, heaps FCS가 포함되어 미리 냉각된 수집 튜브를 적절한 수집 장치에 배치하십시오.사용 가능한 수집 장치는 최대 2개의 15 milliliter 원추형 튜브, 또는 4개의 12 by 75 millimeter 튜브나 4개의 마이크로 튜브를 수용할 수 있습니다. 1.5 × 10⁶개 미만의 세포를 수집할 때는 12 by 75 millimeter 튜브를 사용하고, 1.5 × 10⁶개에서 4.5 × 10⁶개의 세포를 수집할 때는 15 milliliter 원추형 튜브를 사용하십시오.적절한 수집 장치를 분리 수집 챔버에 넣으십시오. 다색 분리의 경우 사이드 스트림이 설치된 수집 장치로 향하게 하십시오. 검출기 간의 스펙트럼 중첩을 보정하기 위해 먼저 사이토미터를 교정해야 합니다.여기에 제시된 예시는 fit E와 pe의 방출 스펙트럼 사이의 중첩을 보여줍니다. 어둡게 음영 처리된 영역으로 표시된 이 중첩을 스필오버(spillover)라고 합니다. 이 경우 PE 스필오버는 fit E 채널에서 검출되고, fit e 스필오버는 PE 채널에서 검출될 것입니다.다른 채널에서 발생하는 형광의 잔류 형광을 제거하기 위해 이러한 스필오버(spillover)를 보정해야 합니다. 스필오버를 보정하는 이 과정을 보정(compensation)이라고 하며, 수동 보정을 수행합니다. 사이토메트리 소프트웨어를 사용하여 전방 산란광 FSC와 측방 산란광 SSC를 표시하는 이변량 도표와 사용할 각 형광체에 대한 히스토그램 하나씩을 포함하는 템플릿을 설정하십시오.이러한 플롯을 설정하는 방법은 소프트웨어에 따라 다릅니다. 음성 대조군 com 튜브를 사이토미터의 로딩 포트에 넣고 샘플이 실행되는 동안 데이터 획득을 시작하십시오. 관심 대상 집단이 스케일에 들어오도록 FSC와 SSC를 조정하십시오.그 다음, 음성 세포군 또는 자가형광이 히스토그램의 맨 왼쪽 부분에 위치하도록 형광 PMT 설정을 조정하십시오. 음성 대조군 튜브를 기록하십시오. 사이토미터 로딩 포트에서 음성 대조군 튜브를 제거하고 첫 번째 양성 대조군 com 튜브로 교체하십시오.이제 획득을 시작하십시오. 각 양성 대조군 튜브에 대해 이 과정을 반복하여 각 튜브의 데이터를 기록합니다. 각 양성 대조군에 대해 히스토그램에 기록된 이벤트 주변에 인터벌 게이트 또는 박스를 그리십시오.그 다음 히스토그램의 음성 영역에 또 다른 구간 게이트를 그립니다. 수동 보정을 수행할 때는 양성군의 중앙값이 음성군의 중앙값과 동일해질 때까지 조정하여 실험에 사용된 각 형광 표지자를 고려하십시오. 중앙값을 조정하려면 스펙트럼 중첩 값을 높이거나 낮추어 각 형광 파라미터의 중앙값이 최대한 일치하도록 조정하십시오.양성 및 음성 대조군 샘플로 설정한 조건을 사용하여, 실험 샘플의 게이트 설정을 결정함으로써 소팅 절차를 준비합니다. 소팅할 세포가 담긴 튜브를 사이토미터 로딩 포트에 넣고, 초당 9,000~10,000개 이벤트의 속도로 획득을 시작합니다. 전방 산란광(forward scatter) 대 측방 산란광(side scatter)을 표시하는 도트 플롯을 선택하십시오.전방 산란광(Forward scatter)은 세포 크기를 나타내는 일반적인 지표로 x축에 배치하며, 측방 산란광(side scatter)은 세포의 과립도를 나타내는 지표로 y축에 배치합니다. 이제 관심 있는 세포군을 게이팅(gate)하십시오. 게이트가 결정되면, 사이토미터 로딩 포트의 온도가 4 °C로 설정되어 있는지 확인하십시오.그 다음 실험 샘플 튜브를 로딩 포트에 넣습니다. 정렬 옵션을 누르고 획득을 시작하며, 수집 튜브는 채워지는 즉시 얼음 위에 두어야 합니다. 원하는 수의 세포가 수집될 때까지 또는 샘플 튜브가 비워질 때까지 정렬을 계속합니다.그런 다음 정렬 버튼을 다시 선택하여 정렬을 중단하고 로딩 포트에서 샘플을 제거합니다. 다음으로, 수집 튜브를 사이토미터의 로딩 포트에 직접 배치하고 500에서 1000개의 이벤트를 획득합니다. T 세포 정렬에 사용된 것과 동일한 설정을 사용했을 때, 정렬 과정을 통해 순도가 21%에서 99%로 증가했습니다. B 세포의 경우, 초기 B 세포 집단인 5%가 정렬 후 98%로 증가했습니다.지금까지 FACS를 이용하여 사이토카인에서 B 세포 및 T 세포 집단을 정제하는 방법을 살펴보았습니다. 단일 세포 현탁액을 생성할 수 있고 적절한 항체를 사용할 수 있다면, FACS를 통해 어떠한 세포 집단이라도 정제할 수 있다는 점을 기억하시기 바랍니다. 또한, 형광 마커가 유전적으로 표지된 세포는 항체를 사용하지 않고도 쉽게 정제할 수 있습니다.또한, 실험 시 항상 적절한 대조군을 사용하고, 유세포 분석기의 레이저 구성을 항상 확인하여 올바른 형광색소를 사용하고 있는지 확인하십시오. 그리고 각 세포군이 적절하게 포함되도록 적절한 게이트를 설정하시기 바랍니다. 이것으로 마치겠습니다. 시청해 주셔서 감사하며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

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