형광 활성 세포 정렬 (외과)에 의해 특정 세포 인구의 정제

안녕하세요, 저는 위스콘신 혈액 센터 혈액 연구소의 유세포 분석 전문가인 호프 캠벨입니다. 안녕하세요, 저는 Bonnie Dieter 박사 연구실의 대학원생인 STR Baso입니다. 저는 또한 위스콘신 혈액 센터의 혈액 연구소(Blood Research Institute of Blood Center)에서 일하고 있습니다.

오늘 우리는 형광 활성화 세포 분류를 사용하여 세포를 분리하는 절차를 수행할 것입니다. 우리는 실험실에서 이 절차를 사용하여 림프구와 골수성 세포 집단의 기능을 연구합니다. 시작하자.

이 절차에서는 B 및 CD 4개의 T 세포가 마우스 cyte에서 정제됩니다. 대상 셀의 시작 수는 이 방법을 사용하여 필요한 셀의 수와 기계의 회수율을 기준으로 계산해야 합니다. B 및 CD 4 개의 T 세포의 일반적인 회복률은 85-90 %이며, 시작 SP 세포 집단은 약 60-70 % B 세포와 20-30 % T 세포입니다.

그러므로, 6개의 세포에 대해 100 곱하기 10으로 시작한다면, 사실을 알기 전에 5천만에서 6천만 개의 B 세포와 2천에서 3천만 개의 T 세포를 회수할 수 있을 것이다. 프로토콜에 필요한 용액과 시약은 얼음 위에 놓아야 합니다. 여기에는 3% 태아 송아지 혈청 A 25 밀리몰 Hep로 구성된 인산염 완충액, 3% 태아 송아지 혈청 A 25 밀리몰 Hep B 용액으로 구성된 인산염 완충액으로 구성된 염색 완충액, 태아 송아지 혈청 염색 항체 및 보상 비드가 포함됩니다.

이 프로토콜에는 다음과 같은 공급품 및 시약도 필요합니다. 15 밀리리터 원뿔형 튜브, 12 x 75 밀리미터 폴리스티렌 또는 폴리프로필렌 플로우 튜브. 이를 위해 나일론 세포 여과기 trien blue와 혈구 분석기 분류 수집 튜브도 미리 준비해야 합니다.

300마이크로리터의 he's FCS 솔루션을 유동 튜브에 연결하거나 1ml의 HEPs FFC S 솔루션을 15밀리리터 원추형 튜브에 연결합니다. 수거 과정이 시작될 때까지 얼음 위에 올려 놓아야 합니다. 원하는 세포 집단의 단일 세포 현탁액을 생성하는 것으로 시작합니다.

세포가 분리 된 경우이 절차를 사용하여 배양합니다. 전체 세포 준비는 조직 배양 후드에서 수행해야 합니다. 멸균 기술을 사용하여 얼음, 차가운 염색 완충액을 추가한 후 세포를 세척하고 튜브를 여러 번 뒤집어 세포를 현탁시킵니다.

그런 다음 섭씨 4도의 약 250GS에서 7-8분 동안 세포를 원심분리합니다. 세척 조건은 세포 유형 및 농도에 따라 다를 수 있습니다. cyte의 경우 10ml의 염색 완충액으로 6개의 세포에 최대 200회 10회까지 세척합니다.

세포 펠릿이 손상되지 않도록 흡인에 의해 상층액을 조심스럽게 제거합니다. 그런 다음 세포를 얼음 저온 염색 완충액에 최대 50배, 100마이크로리터당 6배의 농도로 재현탁합니다. 튜브를 튕기거나 부드럽게 소용돌이쳐 세포 펠릿을 다시 현탁시킵니다.

그런 다음 6개의 셀 중 0.25에서 10을 얼음 위의 새로운 12 x 75mm 폴리스티렌 또는 폴리프로필렌 흐름 튜브로 옮깁니다. 그리고 나중에 첫 번째 튜브에 염색되지 않은 대조군 샘플로 사용하기 위해 이것을 따로 보관하고, 원하는 최종 농도를 달성하기 위해 세포 현탁액에 1차 항체를 추가합니다. 여기서 PE Texas의 red conjugated anti B two 20 항체는 B 세포를 염색하는 데 사용되며, ZI conjugated anti TCR R beta andor 700 conjugated anti CD four 항체는 튜브 바닥을 튕기거나 빛으로 혼합된 T 세포를 염색하는 데 사용됩니다.

그런 다음 소용돌이가 일어나 세포를 얼음 위에 놓고 20-30분 동안 어둠 속에서 배양합니다. 배양 후, Resus로 라벨링된 세포를 세척하고 상등액을 조심스럽게 제거한 후 이전과 같이 10ml의 얼음처럼 차가운 현탁액, 완충액 및 원심 주입에 현탁시킵니다. 이 단계를 반복하여 세포를 두 번 세척합니다.

마지막으로, 얼음처럼 차가운 현탁액 버퍼에 세포를 재현탁합니다. 1차 항체가 fluoro four에 직접 접합되지 않은 경우, 세포 현탁액에 접합체로 표지된 2차 항체 또는 연쇄상구균 AVID를 추가하고 다시 배양 후 20-30분 동안 어두운 곳에서 얼음 위에서 세포를 배양합니다. 얼음처럼 차가운 서스펜션 버퍼로 세포를 두 번 씻습니다.

얼음 차가운 현탁액 완충액에 있는 세포를 중단하는 resus 후에. trian blue 및 hemo cytometer와 같은 필수 염료를 사용하여 세포 농도와 생존율을 측정합니다. 격리 중에 죽었을 수 있는 세포 클러스터로 팩스 기계가 막히는 것을 방지하기 위해 현탁 버퍼를 추가하여 셀 농도를 10-20 곱하기 10에서 밀리리터당 6번째 셀로 조정합니다.

절차 및 염색. 분류 프로토콜을 시작하기 직전에 드립 스트레이너를 통해 세포를 필터링합니다. 세포의 종류에 따라 스트레이너의 기공 크기를 선택해야 하며, cyte의 경우 40μm 기공 크기의 스트레이너를 사용합니다.

부피에 따라 15리터 원뿔형 튜브 또는 12 x 75mm 유동 튜브에 여과된 세포를 수집합니다. 그리고 선별 절차를 위해 세포 분석기가 설정되는 동안 세포를 얼음 위에 놓습니다. BD comp beads를 단색 positive control로 사용하는 경우, assay에 사용된 각 색상에 대해 하나의 control tube와 염색되지 않은 negative control tube를 준비합니다.

비드 현탁액을 철저히 와류로 처리한 후 하나를 추가하고 음극 및 양극 비드 현탁액을 각각 사용된 각 색상과 음극 대조군에 대해 100마이크로리터 현탁액 버퍼에 떨어뜨립니다. 다음으로, 표지된 항체 1마이크로리터를 각 positive control tube에 추가합니다. 이 실험에서는 PE Texas의 Red B 2 개의 20 항체를 사용하여 하나의 튜브를 준비합니다.

하나는 fit ETCR 베타 항체를 사용하는 것이고, 다른 하나는 lor 700 CD를 사용하는 것인데, 4개의 항체를 튜브의 바닥을 튕겨 혼합하여 실온의 어두운 곳에서 15-30분 동안 배양합니다. 2ml의 염색제, 완충액 및 원심분리기로 비드를 200Gs에서 10분 동안 한 번 세척합니다. 흡인에 의해 상층액을 제거하고 비드 펠릿을 200-500 마이크로 리터의 염색에 재현탁시킵니다.

유세포 분석기의 버퍼 설정은 제조업체에 따라 다르며 적절하게 교육을 받은 직원만 수행해야 합니다. 여기서의 세포 분류 절차는 BD 결함 aria를 사용하여 수행됩니다. 분류하기 전에 분류할 셀 유형에 따라 적절한 노즐을 선택하십시오.

facts aria에 사용할 수 있는 크기는 70마이크로미터, 100마이크로미터 및 130마이크로미터입니다. 노즐 크기는 림프구에 대해 분류할 세포 크기의 3배 이상이어야 하며 70마이크로미터 노즐이 선택됩니다. 무균 세포 분류는 기기의 무균 분류 옵션을 사용하여 수행할 수 있습니다.

이 옵션을 사용하면 제조업체의 지침에 따라 전체 피복 경로가 70% 에탄올로 오염 제거됩니다. 피복 필터를 교체하고 PBS를 멸균 PBS로 교체하십시오. 유세포 분석기를 사용할 준비가 되면 힙 FCS가 들어 있는 사전 냉각 수집 튜브를 적절한 수집 장치에 넣습니다.

사용 가능한 수집 장치는 최대 2개의 15ml 원추형 튜브를 수용할 수 있습니다. 12 x 75mm 튜브 4개 또는 마이크로 튜브 4개. 12 x 75 밀리미터 튜브를 사용하여 1.5 곱하기 10 미만에서 여섯 번째 셀을 수집하고, 1.5 곱하기 10 곱하기 6 - 4.5 곱하기 10 에서 여섯 번째 셀을 수집하려면 15 밀리리터 원뿔형 튜브를 사용합니다.

적절한 수집 장치를 분류 수집 챔버에 놓습니다. 여러 가지 색상 분류를 위해 측면 스트림을 설치된 수집 장치로 보냅니다. 먼저 검출기 간의 스펙트럼 중복을 설명하기 위해 세포분석기를 보정합니다.

여기에 표시된 예는 피팅 E와 pe의 방출 스펙트럼 간의 중첩을 보여줍니다. 어두운 음영 영역에 표시되는 이러한 겹침을 스필오버(spillover)라고 합니다. 여기서 PE 스필오버는 fit E 채널에서 감지되고 fit e 스필오버는 PE 채널에서 감지됩니다.

이 파급은 다른 채널에서 한 층 4의 잔류 형광을 제거하기 위해 수정되어야 합니다. 스필오버를 보정하는 프로세스를 보상이라고 하여 수동 보상을 수행합니다. 세포 분석 소프트웨어를 사용하여 전방 산란 FSC 및 측면 산란 SSC를 표시하는 이변량 플롯과 사용할 각 플루로에 대해 하나의 히스토그램을 포함하는 템플릿을 설정합니다.

이러한 플롯을 설정하는 방법은 소프트웨어에 따라 다릅니다. negative control com 튜브를 세포 분석기의 로딩 포트에 놓고 샘플이 실행되는 동안 데이터 수집을 시작합니다. FSC 및 SSC를 조정하여 관심 모집단을 규모에 배치합니다.

그런 다음 형광 PMT 설정을 조정하여 음수 모집단 또는 자가형광을 히스토그램의 맨 왼쪽 부분에 배치합니다. 네거티브 컨트롤 튜브를 기록합니다. 세포분석기 로딩 포트에서 negative control tube를 제거하고 첫 번째 positive control com tube로 교체합니다.

이제 인수를 시작하십시오. 각 positive control tube에 대해 이 프로세스를 반복하여 각 tube에 대한 데이터를 기록합니다. 각 양수 대조군에 대해 히스토그램에 기록된 이벤트 주위에 간격 게이트 또는 상자를 그립니다.

그런 다음 히스토그램의 음수 부분에 다른 간격 게이트를 그립니다. 수동 보정을 수행할 때 네거티브의 중앙값과 같아질 때까지 긍정의 중앙값을 조정하여 실험에 사용된 각 플루로를 고려하십시오. 중앙값을 조정하려면 각 형광 매개변수의 중앙값이 가능한 한 가깝게 일치할 때까지 스펙트럼 중첩 값을 더 높거나 더 낮게 조정하십시오.

양성 및 음성 대조군 샘플에 설정된 설정을 사용하여 실험 샘플의 보행 설정을 결정하여 분류 절차를 준비합니다. 세포분석기 로딩 포트로 분류할 세포 튜브를 놓고 초당 9-10, 000 이벤트의 속도를 사용하여 획득을 시작합니다. 점도표를 선택하여 전방 산점도 대 측면 산점도를 표시합니다.

전방 산란(forward scatter)은 셀 크기의 일반적인 지표이며 x축에 배치되는 반면, 측면 산란(side scatter)은 셀 입도의 지표이며 Y축에 배치됩니다. 이제 관심 있는 모집단을 게이트합니다. 게이트가 결정되면 세포분석기의 로딩 포트 온도가 섭씨 4도로 설정되어 있는지 확인합니다.

그런 다음 실험용 샘플 튜브를 로딩 포트에 넣습니다. sort option을 누르고 수집 시작 수집 튜브는 채워질 때 얼음 위에 놓아야 합니다. 원하는 수의 세포가 수집되거나 샘플 튜브가 비워질 때까지 분류를 계속합니다.

그런 다음 정렬 버튼을 다시 선택하여 정렬을 중지하고 로딩 포트에서 샘플을 제거합니다. 다음으로, 수집 튜브를 세포 분석기의 로딩 포트에 직접 놓고 500-1000개의 이벤트를 획득합니다. T 세포에 대한 분류에 사용된 것과 동일한 설정을 사용하여 분류 절차는 순도를 21%에서 99%로 증가시켰습니다.B 세포의 경우, 분류 후 5%의 시작 B 세포 집단을 98%로 증가시켰습니다.

그래서 우리는 방금 팩스로 cytes에서 b 및 t 세포 집단을 정제하는 방법을 보여드렸습니다. 단일 세포 현탁액이 생성될 수 있고 적절한 항체를 사용할 수 있는 경우 모든 세포 집단을 정제하는 데 사실이 사용될 수 있음을 기억하십시오. 또한 형광 마커가 있는 유전적으로 쌓인 세포는 항체를 사용하지 않고도 쉽게 정제할 수 있습니다.

또한 항상 실험에 적절한 대조군을 사용하는 것을 잊지 말고, 항상 유세포 분석 레이저 구성을 확인하여 올바른 형광 색소를 사용하고 있는지 확인하고, 적절한 게이트를 사용하여 집단 주변에 적절하게 배치되도록 하십시오. 그게 다야. 시청해 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.