형광 활성 세포 정렬 (외과)에 의해 특정 세포 인구의 정제

안녕하세요, 저는 Blood Center of Wisconsin의 Blood Research Institute에서 유세포 분석 전문가로 근무하고 있는 Hope Campbell입니다. 안녕하세요, 저는 Bonnie Dieter 박사님 연구실의 대학원생 STR Baso입니다. 저 또한 Blood Center of Wisconsin의 Blood Research Institute에 소속되어 있습니다.

오늘은 형광 활성 세포 분류법(fluorescent activated cell sorting)을 사용하여 세포를 분리하는 절차를 진행하겠습니다. 이 절차는 실험실에서 림프구 및 골수성 세포 집단의 기능을 연구하는 데 사용됩니다. 이제 시작하겠습니다.

본 절차에서는 마우스 세포로부터 B 세포와 CD4 T 세포를 정제합니다. 표적 세포의 시작 수는 필요한 세포 수와 이 방법을 사용하는 장비의 회수율을 기반으로 계산해야 합니다. B 세포와 CD4 T 세포의 일반적인 회수율은 85~90%입니다. 시작 SP 세포 집단은 대략 60~70%의 B 세포와 20~30%의 T 세포로 구성됩니다.

따라서 $100 \times 10^6$개의 세포로 시작하면, FACS 분석을 시작하기 전에 5,000만에서 6,000만 개의 B 세포와 2,000만에서 3,000만 개의 T 세포를 회수할 수 있습니다. 프로토콜에 필요한 용액과 시약은 얼음 위에 두어야 합니다. 여기에는 3% fetal calf serum이 포함된 phosphate buffered saline으로 구성된 염색 버퍼, 3% fetal calf serum을 함유한 Hank's balanced salt solution(HBSS)에 조제된 25 mM HEPES로 구성된 현탁 버퍼, fetal calf serum으로 조제된 25 mM HEPES 용액, 염색 항체 및 보정 비즈(compensation beads)가 포함됩니다.

본 프로토콜에는 다음과 같은 소모품 및 시약이 추가로 필요합니다. 15 milliliter 원추형 튜브, 12 by 75 millimeter 폴리스티렌 또는 폴리프로필렌 유속 튜브, 나일론 세포 스트레이너, trien blue 및 혈구 계수기입니다. 또한, 이를 수행하기 위해 소팅 수집 튜브를 미리 준비해야 합니다.

300 µL의 HEPES FCS 용액을 플로우 튜브에, 또는 1 mL의 HEPES FCS 용액을 15 mL 원추형 튜브에 분주합니다. 이 튜브들은 수집 과정이 시작될 때까지 얼음에 보관해야 합니다. 원하는 세포군을 단일 세포 현탁액으로 만드는 것부터 시작하십시오.

이 절차를 사용하여 분리한 세포를 배양하는 경우, 모든 세포 준비 과정은 조직 배양 후드 내에서 수행해야 합니다. 멸균 기술을 사용하여 얼음처럼 차가운 염색 버퍼를 추가해 세포를 한 번 세척하고, 튜브를 여러 번 뒤집어 세포를 재현탁합니다.

그런 다음 4 °C에서 약 250 ×g로 7~8분 동안 세포를 원심분리합니다. 세척 조건은 세포 유형 및 농도에 따라 다를 수 있습니다. cytes의 경우, 10 mL의 염색 버퍼로 200 × 10⁶개의 세포까지 세척하십시오.

세포 펠렛이 손상되지 않도록 흡입법으로 상층액을 조심스럽게 제거합니다. 그 다음, 세포를 100 µL당 최대 50 × 10⁶개의 농도로 얼음처럼 차가운 염색 버퍼에 재부유시킵니다. 튜브를 톡톡 치거나 부드럽게 볼텍싱하여 세포 펠렛을 재부유시킵니다.

그런 다음, 6개의 셀 중 0.25 ~ 1 × 10개의 셀을 얼음 위에 놓인 새로운 12 × 75 mm 폴리스티렌 또는 폴리프로필렌 유동 튜브로 옮깁니다. 이를 나중에 미염색 대조군 샘플로 사용하기 위해 따로 보관합니다. 첫 번째 튜브의 세포 현탁액에 1차 항체를 추가하여 원하는 최종 농도를 맞춥니다. 여기서는 B 세포를 염색하기 위해 PE-Texas Red 접합 anti-B220 항체를 사용하며, T 세포를 염색하기 위해 ZE 접합 anti-TCR $\beta$ 및/또는 700 접합 anti-CD4 항체를 사용합니다. 튜브 바닥을 톡톡 치거나 가볍게 흔들어 혼합합니다.

볼텍싱한 후 세포를 얼음 위에 놓고 어두운 곳에서 20~30분 동안 배양합니다. 배양 후, 상층액을 조심스럽게 제거한 다음, 10 mL의 차가운 현탁 완충액에 세포를 부유시키고 이전과 동일하게 원심분리하여 라벨링된 세포를 세척합니다. 이 단계를 반복하여 세포를 두 번째로 세척합니다.

마지막으로, 얼음처럼 차가운 현탁 완충액(suspension Buffer)에 세포를 재현탁합니다. 1차 항체가 형광체에 직접 결합되어 있지 않은 경우, 표지된 2차 항체 또는 strep AVID 결합체를 세포 현탁액에 첨가하고, 배양 후 다시 세포를 얼음 위 암소에서 20분에서 30분 동안 배양합니다. 얼음처럼 차가운 현탁 완충액으로 세포를 두 번 세척합니다.

얼음처럼 차가운 현탁 완충액에 세포를 재현탁한 후, 트라이판 블루(trypan blue)와 같은 생존 염색약과 혈구계수기(hemocytometer)를 사용하여 세포 농도와 생존율을 측정하십시오. 분리 과정 중 사멸했을 수 있는 세포 뭉침으로 인해 FACS 기기가 막히는 것을 방지하기 위해, 현탁 완충액을 추가하여 세포 농도를 10~20 × 10⁶ cells/mL로 조정하십시오.

절차 및 염색. 분리 프로토콜을 시작하기 직전에 세포를 드립 스트레이너(drip strainer)로 여과합니다. 스트레이너의 공극 크기는 세포 유형에 따라 선택해야 하며, 세포의 경우 40 micrometer 공극 크기의 스트레이너를 사용합니다.

부피에 따라 15 mL 원추형 튜브 또는 12 by 75 mm 유세포 분석용 튜브에 여과된 세포를 수집합니다. 그리고 사이토미터가 분리 절차를 위해 설정되는 동안 세포를 얼음 위에 둡니다. 단일 색상 양성 대조군으로 BD comp beads를 사용하는 경우, 분석에 사용된 각 색상당 하나의 대조군 튜브와 염색하지 않은 음성 대조군 튜브 하나를 준비합니다.

비드 현탁액을 충분히 볼텍싱한 후, 사용된 각 색상과 음성 대조군에 대해 100 µL의 현탁 버퍼가 담긴 튜브에 음성 및 양성 비드 현탁액을 각각 한 방울씩 첨가합니다. 다음으로, 각 양성 대조군 튜브에 라벨링된 항체 1 µL를 첨가합니다. 본 실험에서는 PE Texas'Red B 20 항체를 사용하여 하나의 튜브를 준비합니다.

fit ETCR beta 항체와 lor 700 CD four 항체를 각각 사용한 것을 튜브 바닥을 튕겨 섞어준 뒤, 실온의 암소에서 15~30분 동안 배양합니다. 염색 버퍼 2 mL로 비드를 한 번 세척하고 200 Gs에서 10분 동안 원심분리합니다. 흡입법으로 상층액을 제거하고 비드 펠릿을 200~500 µL의 염색액에 다시 현탁합니다.

유세포 분석기의 버퍼 설정은 제조사에 따라 다르며, 적절한 교육을 받은 인원만 수행해야 합니다. 본 세포 분리 절차는 BD FACSAria를 사용하여 수행됩니다. 분리 전, 분리할 세포 유형에 따라 적절한 노즐을 선택하십시오.

사용 가능한 노즐 크기는 70 µm, 100 µm 및 130 µm입니다. 노즐 크기는 분리하려는 세포 크기의 최소 3배여야 하므로, 림프구의 경우 70 µm 노즐을 선택합니다. 장비의 무균 분리 옵션을 사용하여 무균 세포 분리를 수행할 수 있습니다.

이 옵션을 사용하여 제조업체의 지침에 따라 전체 시스 경로를 70% ethanol로 오염 제거합니다. 시스 필터를 교체하고 PBS를 멸균된 PBS로 교체하십시오. 사이토미터 준비가 완료되면, heaps FCS가 포함되어 미리 냉각된 수집 튜브를 적절한 수집 장치에 배치하십시오.

사용 가능한 수집 장치는 최대 2개의 15 milliliter 원추형 튜브, 또는 4개의 12 by 75 millimeter 튜브나 4개의 마이크로 튜브를 수용할 수 있습니다. 1.5 × 10⁶개 미만의 세포를 수집할 때는 12 by 75 millimeter 튜브를 사용하고, 1.5 × 10⁶개에서 4.5 × 10⁶개의 세포를 수집할 때는 15 milliliter 원추형 튜브를 사용하십시오.

적절한 수집 장치를 분리 수집 챔버에 넣으십시오. 다색 분리의 경우 사이드 스트림이 설치된 수집 장치로 향하게 하십시오. 검출기 간의 스펙트럼 중첩을 보정하기 위해 먼저 사이토미터를 교정해야 합니다.

여기에 제시된 예시는 fit E와 pe의 방출 스펙트럼 사이의 중첩을 보여줍니다. 어둡게 음영 처리된 영역으로 표시된 이 중첩을 스필오버(spillover)라고 합니다. 이 경우 PE 스필오버는 fit E 채널에서 검출되고, fit e 스필오버는 PE 채널에서 검출될 것입니다.

다른 채널에서 발생하는 형광의 잔류 형광을 제거하기 위해 이러한 스필오버(spillover)를 보정해야 합니다. 스필오버를 보정하는 이 과정을 보정(compensation)이라고 하며, 수동 보정을 수행합니다. 사이토메트리 소프트웨어를 사용하여 전방 산란광 FSC와 측방 산란광 SSC를 표시하는 이변량 도표와 사용할 각 형광체에 대한 히스토그램 하나씩을 포함하는 템플릿을 설정하십시오.

이러한 플롯을 설정하는 방법은 소프트웨어에 따라 다릅니다. 음성 대조군 com 튜브를 사이토미터의 로딩 포트에 넣고 샘플이 실행되는 동안 데이터 획득을 시작하십시오. 관심 대상 집단이 스케일에 들어오도록 FSC와 SSC를 조정하십시오.

그 다음, 음성 세포군 또는 자가형광이 히스토그램의 맨 왼쪽 부분에 위치하도록 형광 PMT 설정을 조정하십시오. 음성 대조군 튜브를 기록하십시오. 사이토미터 로딩 포트에서 음성 대조군 튜브를 제거하고 첫 번째 양성 대조군 com 튜브로 교체하십시오.

이제 획득을 시작하십시오. 각 양성 대조군 튜브에 대해 이 과정을 반복하여 각 튜브의 데이터를 기록합니다. 각 양성 대조군에 대해 히스토그램에 기록된 이벤트 주변에 인터벌 게이트 또는 박스를 그리십시오.

그 다음 히스토그램의 음성 영역에 또 다른 구간 게이트를 그립니다. 수동 보정을 수행할 때는 양성군의 중앙값이 음성군의 중앙값과 동일해질 때까지 조정하여 실험에 사용된 각 형광 표지자를 고려하십시오. 중앙값을 조정하려면 스펙트럼 중첩 값을 높이거나 낮추어 각 형광 파라미터의 중앙값이 최대한 일치하도록 조정하십시오.

양성 및 음성 대조군 샘플로 설정한 조건을 사용하여, 실험 샘플의 게이트 설정을 결정함으로써 소팅 절차를 준비합니다. 소팅할 세포가 담긴 튜브를 사이토미터 로딩 포트에 넣고, 초당 9,000~10,000개 이벤트의 속도로 획득을 시작합니다. 전방 산란광(forward scatter) 대 측방 산란광(side scatter)을 표시하는 도트 플롯을 선택하십시오.

전방 산란광(Forward scatter)은 세포 크기를 나타내는 일반적인 지표로 x축에 배치하며, 측방 산란광(side scatter)은 세포의 과립도를 나타내는 지표로 y축에 배치합니다. 이제 관심 있는 세포군을 게이팅(gate)하십시오. 게이트가 결정되면, 사이토미터 로딩 포트의 온도가 4 °C로 설정되어 있는지 확인하십시오.

그 다음 실험 샘플 튜브를 로딩 포트에 넣습니다. 정렬 옵션을 누르고 획득을 시작하며, 수집 튜브는 채워지는 즉시 얼음 위에 두어야 합니다. 원하는 수의 세포가 수집될 때까지 또는 샘플 튜브가 비워질 때까지 정렬을 계속합니다.

그런 다음 정렬 버튼을 다시 선택하여 정렬을 중단하고 로딩 포트에서 샘플을 제거합니다. 다음으로, 수집 튜브를 사이토미터의 로딩 포트에 직접 배치하고 500에서 1000개의 이벤트를 획득합니다. T 세포 정렬에 사용된 것과 동일한 설정을 사용했을 때, 정렬 과정을 통해 순도가 21%에서 99%로 증가했습니다. B 세포의 경우, 초기 B 세포 집단인 5%가 정렬 후 98%로 증가했습니다.

지금까지 FACS를 이용하여 사이토카인에서 B 세포 및 T 세포 집단을 정제하는 방법을 살펴보았습니다. 단일 세포 현탁액을 생성할 수 있고 적절한 항체를 사용할 수 있다면, FACS를 통해 어떠한 세포 집단이라도 정제할 수 있다는 점을 기억하시기 바랍니다. 또한, 형광 마커가 유전적으로 표지된 세포는 항체를 사용하지 않고도 쉽게 정제할 수 있습니다.

또한, 실험 시 항상 적절한 대조군을 사용하고, 유세포 분석기의 레이저 구성을 항상 확인하여 올바른 형광색소를 사용하고 있는지 확인하십시오. 그리고 각 세포군이 적절하게 포함되도록 적절한 게이트를 설정하시기 바랍니다. 이것으로 마치겠습니다. 시청해 주셔서 감사하며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.