Name: 루시페라제 Immunoprecipitation 시스템 (입술)에 의해 항체 프로파일 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-07T17:25:00.000+00:00
Duration: 12 min 19 s
Description: 학습하세요 루시페라제 Immunoprecipitation 시스템(LIPS)을 이용한 항체 정량 분석 방법입니다. COS-1 세포에서 발현한 항원-루시페라제 융합 단백질을 사용하며, 정제 없이 원액 추출물로 면역침전을 수행합니다.

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이 연구는 NIDCR의 교내 연구 프로그램에 의해 지원되었다.

1. 도식 개요 : 이 동영상은 입술 분석을 수행에 관련된 단계를 설명합니다. 항원은 재조합 Renilla의 루시페라제 (Ruc) 항원 fusions, 그리고 원유 추출물로 Cos1 세포에 표현 취득하고 정화없이 사용. 입술 분석은 microtiter 우물에서 환자 세라와 크루드 전자 Ruc - 항원 추출물을 잠복기로 시작됩니다. 항체 - 항원 혼합물은 다음 IgG 분자를 캡처하는 단백질 A / G 비즈를 포함하는 96 - 웰 플레이트 필터로 전송됩니다. 단백질을 포함하고있는 필터 플레이트 세척 후 Ruc - 항원이 coelenterazine 기판 및 조명 장치의 추가에 의해 측정된다 바운드 A / G 구슬, 항체는 luminometer로 측정됩니다. 1 부 : Renilla - 항원 융합 단백질의 생산을위한 Plasmids의 Transfection 설정 : Cos1 세포가 표준 조직 문화 프로토콜을 사용하여 DMEM - 10% FCS에서 양식입니다. Renilla 루시페라제 fusions에 대한 Plasmids는 이전에 다음 ID로 한 설명했습니다. 이러한 plasmids에 대한 DNA는 Qiagen에서 Midiprep 키트를 사용하여 준비가되어 있습니다. 수율은 약 1 -3 MG해야합니다. -20 ° C.에서 1,000 μg / ML 주식 솔루션으로 DNA 농도 및 저장을 측정 절차 : <ol><li> 하루 전에 transfection, 분할 있으니까요 - 1 개의 새 항목 100 37 판과 부화 당 약 2 X 10 6 X 20mm 요리 ° C.에 세포 </li><li> 다음날, 왜냐하면 - 1 세포가 80~95% 합류한다. 각각의 플라스미드 DNA에 대한 레이블 1.5 ML의 폴리 프로필렌의 microfuge 튜브는 transfected 수 있습니다. 4 저장되어있는 FuGENE - 6 transfection 시약, ° C는, 적당한 온도로 워밍업 수 있습니다. </li><li> 각 microfuge 튜브에 Opti - 멤 미디어의 94 μl를 추가합니다. 다음 측면 벽을 건드리지 않고도 Opti - 멤 미디어 FuGENE 6 개 중 6 μl를 추가합니다. </li><li> 상온에서 5 분 혼합물을 품어. </li><li> 1-2 Renilla 루시페라제 항원 융합에 대한 플라스미드의 μg (1mg/ml의 DNA 재고에서) 구조를 추가합니다. 혼합 후 실온에서 15 분 동안 혼합물을 품어. </li><li> Cos1 세포의 미디어에 고르게 드리핑하여 세포에 DNA - FuGENE 6 Opti - 멤 솔루션을 전송합니다. </li></ol> 2 부 : 착취 Renilla - 항원 Fusions <ol><li> 이틀 transfection 후, 왜냐하면 - 1 세포가 수확됩니다. 이것은 미디어를 제거하고 PBS 6 ML과 세포 rinsing에 의해 시작됩니다. PBS를 decanting 후, 조직 문화 요리에서 잔여 PBS 멀리 피펫. </li><li> 50 MM 트리스, 산도 7.5, 100 MM NaCl, 5 MM MgCl 2, 1 % 트리톤 X - 100, 50 % 글리세롤과 테아제 억제제 (50 ML 당 전체 miniprotease 억제제 칵테일 2 정제 구성된 차가운 용해 버퍼의 1.4 ML 추가 용해 버퍼). 휴대 scrapper로 수확 세포가 빠르게 얼음에 두 개의 1.5 ML의 microfuge 튜브 각 lysate의 절반을 전송할 수 있습니다. </li><li> 브렌스 Sonifier 150 세포가 열려 휴식하는 데 사용됩니다. 각각, 2, 2, 4 sonication 설정으로 5 초, 5 초 5 초위한 얼음과 펄스에있는 세포 lysate를 포함하는 microcentrifuge 튜브를 놓습니다. </li><li> 첫 번째 스핀 후, 부드럽게 튜브의 측벽에서 느슨하게 연결된 파편을 제거하기 위해 튜브를 반전 네 두 사분 돌지 ° C. 위해 12,500 RPM의 세포 lysate를 원심 분리기. 두 번째 스핀 후, 얼음에 새로운 microfuge 튜브에 두 튜브에서 펠렛을 방해하지 않고, 표면에 뜨는를 주의깊게 전송합니다. </li><li> lysate의 μl 당 빛의 단위 (LU)를 계산합니다. LU를 측정하기 위해, 새로운 microfuge 튜브에 PBS 8 μl와 lysate 1 μl를 희석. 직접 희석 혼합에 1X coelenterazine 기판 100 μl를 추가하고 즉시 오초 읽을 수있는 튜브 luminometer을 (20분의 20 N 터너 과학)를 사용하여 튜브의 발광을 측정합니다. </li><li> -80에서 aliquots의 시대의 긴 기간 1-2 일 또는 저장소에 대해 -20 ° C에서 Ruc - 항원 lysate를 저장 ° C. </li></ol> 3 부 : 세라 마스터 플레이트를 준비 <ol><li> 첫번째 (50 MM 트리스, 산도 7.5, 100 MM NaCl, 5 MM MgCl 2, 1 % 트리톤 X - 100) 96 깊은 잘 폴리 프로필렌의 microtiter 플레이트의 각 잘하는 버퍼의 450 μl를 추가하여 세라 마스터 플레이트 만들기 . 이 단계에서, 염료, 페놀 레드는 또한 미래 세라 샘플 추가 및 입술 분석의 다른 단계를 모니터링을위한 추적 역할을 (최종 농도가 버퍼에서 0.2 μg / ML)을 버퍼에 포함될 수 있습니다. </li><li> 다음 버퍼 A.의 450 μl를 포함하는 다른 우물 각 샘플에서 세라의 50 μl를 추가할 이것이 일반적으로 세라가 마스터 판의 마지막 두 우물에 추가되지 않습니다 버퍼 A.에서 세라의 1시 10분 희석 참고하기 때문에 이것은 버퍼 공백에 사용됩니다. </li><li> 마스터 플레이트를 사용하기 전에, 그것은 광범위한 회전 플랫폼 (1~2시간) 흥분 상태입니다. 마스터 플레이트에 혈청 역입니다증발을 방지하기 위해 올바르게 저장 ° C의 경우 4 최소한 1 개월 (또는 이상)의 경. </li><li> 아래에 설명한 바와 같이,이 마스터 플레이트 반복 여러 항원에 대항하는 세라의 프로파일 링을 위해 제거하는 희석 세라 10 μl를 제공합니다. 크고 작은 마스터 플레이트도 고용 수 있습니다. 그것이 사용되지 않는 Parafilm 잘 접시를 밀봉합니다. </li></ol> 4 부 : 입술 분석 <ol><li> 폴리 프로필렌 96 - 얕은 잘 microtiter 접시는 세라를 테스트하는 데 사용됩니다. 첫 번째 단계에서, 8 채널 micropipette를 사용하여 96 - 웰 플레이트의 각 잘하기 위해 버퍼의 40 μl를 추가합니다. </li><li> 다음 마스터 플레이트에서 희석 세라 (1 μl 세라 이에 상응하는 금액)의 10 μl를 타고 8 채널 micropipette를 사용하여 작업 판의 각 물론 직접 그것을 추가합니다. </li><li> Ruc - 항원 추출물을 포함하는 마스터 믹스는 앞으로 1 X 10 7 빛의 단위 (LU)이 각각 잘하기 위해 버퍼의 50 μl에 추가됩니다 그러한 책정됩니다. 낮은 입력은 (같은 작은 X 10 6 1 등)도 사용하지만, 낮은 동적 범위의 결과하실 수 있습니다. 각 물론이 마스터 혼합 및 Ruc - 항원 혼합물의 피펫 50 μl를 확인합니다. </li><li> 실온에서 1 시간 로터리 쉐이크에 번호판을 품어. </li><li> 부화하는 동안, 새로운 96 잘 필터 HTS 접시 (Millipore, 베드 포드, MA) 각 우물의 바닥에 Ultralink 단백질 PBS에서 A / G 구슬 (피어스 생명 공학, 록퍼드, IL)의 30 % 정지 5 μl를 추가 . </li><li> 1 시간 부화 후, 단백질 8 채널 micropipette를 사용하여 A / G 비즈를 포함한 96 웰 플레이트 필터 HTS에 100 μl Ruc - 항원 항체 반응 혼합물을 전송할 수 있습니다. </li><li> 실온에서 1 시간 동안 추가 로터리 쉐이크에서 96 - 웰 플레이트 필터를 품어. </li><li> 다음 진공 매니폴드에 필터 번호판을 씻으십시오. 각 잘는 PBS의 100 μl로 두 번 다음에, 버퍼 100 μl 8 번 씻어입니다. 이것은 수동으로 또는 로봇 pipetting 워크 스테이션과 함께 수행할 수 있습니다. </li><li> 마지막 세척 후, 진공이 해제됩니다. 필터 플레이트를 제거하고 종이 타올이나 접시의 위쪽과 아래쪽에있는 수분을 제거해야하는 필터 종이 스택을 사용하여 건조 얼룩. </li></ol> 5 부 : 측정 및 데이터 분석 발광 설정 : 베르톨드의 LB 960 센트 microplate의 luminometer는 각 잘 단일 주입기를 사용하여 발광을 결정하는 데 사용됩니다. 기계가되면, 인젝터 세척주기를 사용하여 증류수 H 2 O와 주입기를 씻어. Coelenterazine 기판은 같은 제조 업체에서 설명한 Promega의 Renilla 기판 키트를 사용하여 준비가되어 있습니다. 1X coelenterazine 기판 믹스 일반적으로 6 ML (예 : 60 μl coelenterazine 주식 플러스 1X 버퍼 6 ML) 마중물 기계에 대비 한 전체 96 - 웰 플레이트를 실행합니다. 접시를 분석하기 전에 베르톨드의 LB 960 센트 microplate의 luminometer는 1X coelenterazine 기판과 함께 준비하는 것입니다. 기판을 주입하고 번호판을 읽기위한 설정을 포함하는 프로그램 파일을 엽니다. 이러한 측정, coelenterazine 기판의 50 μl를 주입, 접시는 발광의 읽기 5 초 뒤에 2 초에 대한 흥분 상태입니다. <ol><li> 플레이트 luminometer가 전체 번호판을 읽을 수있는 능력을 가지고 있지만, 접시의 일부 읽어도 (읽기 메뉴에서) 선택할 수 있습니다. 접시의 읽기 시작 프로그램을 시작합니다. </li><li> 실행 후, luminometer에 spillage을 방지하기 위해 즉시 microtiter 필터 플레이트를 제거합니다. 분석을위한 Excel 형식으로 MikroWin 프로그램 생성된 데이터를 내보낼 수 있습니다. </li><li> 우리는 두 개의 독립적인 실행에서 세라를 평가하는 것이 좋습니다. 데이터는 다음 각 샘플에 대한 LU의 titer 값을 생성하기 위해 평균입니다. 이러한 값은 더욱 버퍼 공백을 뺄 조정할 수 있습니다. </li><li> 같은 컷오프이 말은 플러스의 컨트롤 값을 3 또는 5 표준 편차를 취하여 계산 수있는 결정과 같은 추가 데이터 분석. </li></ol>

<ol><li>Burbelo, P. D., Goldman, R., Mattson, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified+immunoprecipitation+method+for+quantitatively+measuring+antibody+responses+in+clinical+sera+samples+by+using+mammalian-produced+Renilla+luciferase-antigen+fusion+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A simplified immunoprecipitation method for quantitatively measuring antibody responses in clinical sera samples by using mammalian-produced Renilla luciferase-antigen fusion proteins.</a> BMC Biotechnol. 5, 22-22 (2005).</li>
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<li>Ramanathan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+luciferase+immunoprecipitation+systems+assay+enhances+the+sensitivity+and+specificity+of+diagnosis+of+Strongyloides+stercoralis+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">A luciferase immunoprecipitation systems assay enhances the sensitivity and specificity of diagnosis of Strongyloides stercoralis infection.</a> J Infect Dis. 198, 444-451 (2008).</li>
</ol>

입술은 최소한의 분석 최적화 및 그 단순 때문에, 고품질의 데이터는 일반적으로 특정 항원에 대한 이주 아래의 입술을 사용하여 생성할 수 있어야합니다. 가장 시간이 많이 걸리는 단계는 복제되고 Ruc - 항원 융합을 포함하는 적절한 플라스미드 발현 벡터를 생성. 이러한 plasmids가 생성되면 위에서 설명한 바와 같이, 하나 또는 여러 개의 항원이 빠르게 입술로 테스트할 수 있습니다. 그것은 입술은 세라도 튜브 형식이나 또는 BIOMEK 로봇 스테이션 2 또는 진공 여과와 함께 접시 세척기의 도움 microtiter 접시에 필터를 테스트 할 수있는 등 매우 다양한 것을 주목하여야한다. 이것은 확장성이 높은 시스템은 인간 autoantigens 3 또는 바이러스 4 전체 프로테옴의 패널의 프로 파일링 병렬 입술 있습니다. 그것은 입술로 생성된 다양한 항체 프로필 치료 10, 백신 모니터링 과정 다음, 진단 3-9, 항원 발견 9 유용하게 사용될 가능성이 높습니다 및 특정 질병 상태와 일반적으로 공중 보건에 대한 광범위한 의미가 있습니다.

<table><tbody><tr><td>HiSpeed Plasmid Midi Kit</td><td>Qiagen</td><td>12643</td><td></td></tr><tr><td>100 x 20 mm 조직 배양 접시</td><td>Fisher Scientific</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Invitrogen</td><td>31985</td><td></td></tr><tr><td>FuGENE 6</td><td>Roche Group</td><td>1814443</td><td></td></tr><tr><td>Complete, Mini 프로테아제 억제제 칵테일</td><td>Roche Group</td><td>11836153001</td><td></td></tr><tr><td>폴리프로필렌 96 딥웰 1 ml 플레이트</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-566-120</td><td>뚜껑이 있고 Parafilm으로 밀봉된 딥웰 플레이트</td></tr><tr><td>폴리프로필렌 마이크로타이터 플레이트</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-566-120</td><td></td></tr><tr><td>HTS 필터 플레이트</td><td>EMD Millipore</td><td>MSBVN1B50</td><td></td></tr><tr><td>Ultralink 고정화 Protein A/G</td><td>Pierce, Thermo Scientific</td><td>53133 (10ml)</td><td></td></tr><tr><td>Renilla Luciferase 분석 시스템</td><td>Promega Corp.</td><td>E2820</td><td>2000회 분석용</td></tr><tr><td>Centro 마이크로플레이트 루미노미터</td><td>Berthold Technologies</td><td>LB 960</td><td></td></tr></tbody></table>

루시페라제 immunoprecipitation 시스템 (입술)에 의해 항체 프로파일

Antibody Profiling by Luciferase Immunoprecipitation Systems (LIPS)

종합적 autoantigens 및 전염성 요원 항체 프로필을 이해하고 quantifying에 대한 기술은 질병 메커니즘에 새로운 통찰력을 얻을 수 있으며 다른 임상 특징과 질환 substratify 더 나은 pathogenesis을 이해하는 새로운 마커를 명료하게하다 수 있습니다. 우리는 매우 양적 방법 감염과 관련된 autoantigens 및 병원체 항원을 환자 세라의 항체 반응을 프로 파일링에 대한 루시페라제 Immunoprecipitation 시스템 (입술)라는 개발했습니다. ELISAs 달리, 매우 민감한 입술은 쉽게 보편적인 형식으로 다른 항원에 체액 serological 응답 프로파일을 조사하기 위해 구현 및 동적 항체 titer 6 로그온하는 최대 범위 생산합니다<sub&gt; 10</sub&gt; 몇 가지 항원에 대한. 이러한 연구에서는 항원의 패널 또는 일부 병원균 (즉, HIV)의 전체 프로테옴에 대한 환자의 체액 반응의 입술로 양적 프로파일은 일반적으로 엘리사에 의해 하나의 항원 테스트를보다 유익한 것입니다. 또한, 입술은 또한 시간과 높은 정화 항원뿐만 아니라 표준 ELISAs에 필요한 노동 집약적인 분석 최적화 단계를 생산하는 데 필요한 노력을 제거합니다. 우리가 쉽게 하나 또는 여러 항원에 항체 반응을 프로 파일링을위한 입술 assays를 수행의 기술적 측면을 설명하는 자세한 절차를 제공합니다.

입술 (루시페라제 Immunoprecipitation 시스템)를 수행하는 기술적인 측면이 설명되어 있습니다. 전체 접근 방식은 포유 동물 세포에서 Renilla 루시페라제 (Ruc)에 융합 항원을 인코딩 키메라 유전자 표현이 포함됩니다. 원유 Ruc - 항원 추출물 다음 준비하고, 정화없이 항체를 정할 immunoprecipitation의 assays에 근무하고 있습니다.

루시페라제 Immunoprecipitation 시스템 (입술)에 의해 항체 프로파일

자가항원 및 감염원에 대한 항체 프로파일을 종합적으로 이해하고 정량화하는 기술은 질병에 대한 새로운 통찰력을 제공할 수 있습니다...

이 영상에서는 LiP-MS를 수행하는 단계를 보여줍니다. 분석 항원은 재조합 Renilla luciferase 또는 rook 항원 융합 단백질 형태로 CO one 세포에서 발현됩니다. 정제 과정 없이 조추출물을 얻어 사용합니다.lips 분석은 조 rook 항원 추출물을 환자의 SRA와 함께 배양함으로써 시작됩니다. 마이크로타이터 웰에서 항체-항원 혼합물을 Protein A/G 비드가 포함된 96웰 필터 플레이트로 옮겨 IgG 분자를 캡처하며, Protein AG 비드가 포함된 필터 플레이트를 세척합니다. 항체와 결합된 rook 항원은 루미닌 기질을 첨가하여 측정하며, 발광 단위는 루미노미터로 측정합니다.안녕하세요, 국립 치과 및 두개안면 연구소 감각생물학 실험실의 Catherine Chang 박사입니다. 오늘은 LIPS 루시퍼레이즈 면역침강 시스템의 절차를 보여드리겠습니다. 저희 실험실에서는 질병 또는 감염을 진단하기 위해 항체 역가를 측정하는 데 LIPS를 사용합니다.항체 프로필 생성과 관련된 질병 상태의 층화, 백신 접종 모니터링 및 기타 응용 분야에 활용됩니다. 이제 시작해 보겠습니다. 형질전환을 시작하기 전, BMC Biotechnology 논문에 설명된 대로 vanilla luciferase 융합 플라스미드를 미리 준비합니다.BYO etal 2005 플라스미드 DNA는 MIDI prep 키트를 사용하여 1~3 mg의 수율로 준비하며, 1 mg/mL의 스톡 용액 상태로 -20 °C에서 보관합니다. 형질전환에 사용되는 Cost one 세포는 표준 조직 배양 프로토콜에 따라 10% FCS가 포함된 DMEM에서 배양합니다. 형질전환 하루 전, Cost one 세포를 새로운 100 x 20 mm 디쉬에 플레이트당 약 2 × 10⁶ cells로 분할하여 접종하고, 다음 날까지 37 °C에서 배양합니다.세포의 밀도는 80~95% Confluent여야 합니다. 4°C에서 보관된 FUgene 6 transfection 시약이 상온으로 가온되는 동안, transfection할 각 plasmid DNA용 1.5 mL 폴리프로필렌 microfuge 튜브에 라벨을 부착하되 튜브의 옆벽을 만지지 않도록 주의하십시오. 이미 94 µL의 optimum media가 들어있는 튜브에 FUgene 6 6 µL를 첨가하고 상온에서 5분 동안 배양하십시오. 1~2 µg의 plasmid-encoded Luciferase antigen fusion construct를 첨가한 후 튜브를 여러 번 뒤집어 섞어주고, 짧게 원심분리한 뒤 상온에서 15분 동안 배양하십시오.DNA 융합 여섯 번째 최적 솔루션 전체를 cos. One 세포의 배지에 고르게 떨어뜨려 전달합니다. 형질전환된 cos one 세포를 2일 동안 배양한 후 수확합니다. 융합 단백질 수확을 시작하려면, 배지를 제거하고 6 mL의 PBS로 세포를 세척합니다.조직 배양 접시에서 잔류 PBS를 피펫으로 제거하고, 차가운 lysis buffer 1.4 milliliters를 첨가한 후 셀 스크레이퍼로 세포를 수집합니다. 수집한 용해물의 절반을 얼음 위에 놓인 두 개의 1.5 milliliter 마이크로 원심분리 튜브에 각각 빠르게 옮깁니다. 세포를 파쇄하기 위해 Branson SOLIDIFIER 150을 사용합니다. 세포 용해물이 들어 있는 마이크로 원심분리 튜브를 얼음 위에 두고 5초 동안 펄스 처리합니다.5초와 5초 동안 진행합니다. 초음파 처리 설정은 각각 2, 2 및 4로 설정합니다. 세포 용해물을 12,500 RPM에서 4분 동안 원심 분리합니다.4 °C에서 원심분리합니다. 원심분리 사이에 튜브를 부드럽게 뒤집어 튜브 벽면에 느슨하게 붙어 있는 잔해물을 제거합니다. 그런 다음 두 튜브의 펠렛이 흐트러지지 않도록 주의하며 상층액을 얼음 위에 놓인 새 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.용해물의 광단위(lu)를 측정하려면, 새로운 마이크로 원심분리 튜브에 용해물 1 µL와 PBS 8 µL를 넣어 희석하십시오. 희석된 혼합물에 one celent ine 기질 100 µL를 직접 첨가하고, 튜브 루미노미터를 사용하여 즉시 튜브 내의 발광도를 5초 동안 측정하십시오. 인간 및 동물 샘플을 다룰 때는 안전 주의 사항을 준수하십시오. 항원 프로파일링을 위한 환자 항체 공급원인 혈청 마스터 플레이트를 제작하려면, 먼저 96개 딥웰 폴리프로필렌 마이크로타이터 플레이트의 각 웰에 버퍼 A 450 µL를 첨가하십시오.이 단계에서, 향후 SRA 샘플 추가 및 립스 분석(lips assay)의 다른 단계들을 모니터링하기 위한 추적자로 작용하도록 페놀 레드(phenol red) 염료를 버퍼 A에 포함할 수 있습니다. 다음으로, 450 µL의 버퍼가 들어 있는 각 웰에 각 샘플의 혈청 50 µL를 추가합니다. 참고로, 이는 버퍼 내에서 SRA를 1:10으로 희석하는 과정입니다.일반적으로 마스터 플레이트의 마지막 두 웰에는 SRA를 첨가하지 않는데, 이는 마스터 플레이트를 추후 사용을 위해 보관하기 전 버퍼 블랭크(buffer blanks)용으로 예약해 두기 때문입니다. 회전 플랫폼(rotator platform) 위에서 1~2시간 동안 충분히 흔들어 섞어줍니다. 650 RPM에서 혈청은 4 °C에서 최소 한 달 또는 그 이상 안정적으로 유지되며, 립스 분석(lips assay)을 수행하기 전 보관할 경우 증발을 막기 위해 파라필름(parfum)으로 플레이트를 밀봉할 수 있습니다. 샘플 식별 번호와 마스터 플레이트의 해당 웰 정보가 포함된 스프레드시트를 작성하십시오. 혈청 테스트용 워킹 플레이트로는 폴리프로필렌 96-웰 얕은 웰 마이크로타이터 플레이트(polypropylene 96 shallow well microtiter plates)를 사용합니다.첫 번째 단계로, 8채널 마이크로 파이펫을 사용하여 96웰 플레이트의 각 웰에 buffer A 40 µL를 분주합니다. 다음으로, 마스터 플레이트에서 희석된 혈청 10 µL를 취해 8채널 마이크로 파이펫으로 워킹 플레이트의 각 웰에 직접 분주합니다. 사용 후에는 마스터 플레이트를 파라필름으로 밀봉하고 덮개를 닫은 뒤, 새런랩으로 감싸 4 °C에서 보관합니다.다음으로 rook 항원 추출물을 포함하는 마스터 믹스를 조제하여, 각 웰에 버퍼 A 50 µL당 1x10⁷ LU가 첨가되도록 합니다. 이 마스터 믹스를 제조한 후, 각 웰에 rook 항원 혼합물 50 µL를 피펫으로 분주합니다. 플레이트를 폴리스티렌 플레이트 커버로 덮고 로터리 셰이커에서 100 RPM으로 1시간 동안 배양합니다.배양하는 동안 실온에서 냉장고로부터 PBS에 현탁된 30% ultra link protein ag bead 현탁액 1.5 mL 분취액을 꺼냅니다. 새로운 96-well filter HTS 플레이트의 각 웰 바닥에 5 µL씩 첨가합니다. 플레이트를 1시간 동안 배양한 후, A 채널 마이크로 파이펫을 사용하여 rook 항원 항체 반응 혼합물 100 µL를 protein ag bead가 들어 있는 96-well filter HTS 플레이트로 옮깁니다. 96-well filter 플레이트를 회전 쉐이커 위에 올려놓고 실온에서 100 RPM으로 1시간 더 배양합니다.다음으로, 진공 매니폴드가 장착된 Biome FX 자동화 워크스테이션을 사용하여 필터 플레이트를 세척합니다. 각 웰을 100 µL의 buffer A로 8회 세척한 후, 100 µL의 PBS로 2회 세척하며, 마지막 세척 후 진공을 끕니다. 필터 플레이트를 꺼내어 종이 타월이나 여과지를 여러 겹 쌓아 닦아내어 플레이트의 상단과 하단의 수분을 모두 제거합니다. 플레이트 각 웰의 발광 강도를 측정하기 위해 Burt hold LB nine 60 Centro Microplate luminometer를 사용합니다.기기를 켜고 인젝터를 증류수로 헹굽니다. 인젝터 세척 사이클을 사용합니다. INE 기질은 기기 프라이밍 및 작동에 사용되며, 제조사의 지침에 따라 Promega ranil 기질 키트를 사용하여 준비합니다. 일반적으로 플레이트 하나당 6 mL의 1x 기질 혼합액이 필요합니다. 기질 혼합액을 루미노미터에 로드하고, 기질 주입 및 플레이트 판독 설정이 포함된 프로그램 파일을 엽니다.이러한 측정을 위해, 50 µL의 소인 기질을 주입합니다. 플레이트를 2초 동안 흔든 후, 5초 동안 발광을 측정합니다.측정 완료 후 플레이트 판독을 시작하는 프로그램을 실행하고, 루미노미터(luminometer) 내의 액체 유출을 방지하기 위해 마이크로타이터 필터 플레이트를 즉시 제거하십시오. 데이터는 추가 분석을 위해 microwind 프로그램에서 Excel 형식으로 자동 내보내기 됩니다. 동일한 혈청을 사용한 두 번의 서로 다른 실험 결과에 대해 평균값을 산출합니다.각 샘플에 대해 lu 타이터 값을 생성하는 것이 권장됩니다. 중복 샘플은 두 번의 실험 실행 간에 타이터 값에서 높은 일치도를 보여야 합니다. 데이터 플롯팅을 위해, 여기에서 보여주는 것과 같이 버퍼 공시료(blank) 값을 빼서 lu 타이터 값을 추가로 조정할 수 있습니다.이 분석법의 민감도와 특이도는 대조군 샘플의 평균값에 표준편차의 3배 또는 5배를 더해 도출한 컷오프 값을 활용하여 계산할 수 있습니다. 지금까지 LIPS를 이용하여 항체 역가를 측정하는 방법을 살펴보았습니다. LIPS는 분석 최적화 과정이 최소한으로 필요하며, 그 간편함 덕분에 어떤 항원이든 2주 이내에 고품질의 데이터를 생성하는 데 사용할 수 있습니다. 인간 혈청을 다룰 때는 적절한 안전 예방 조치를 취하는 것이 중요하다는 점을 유념하십시오.또한 LIFTS는 확장성이 매우 뛰어나기 때문에, 수동 세척을 통한 소량의 샘플 측정부터 로봇 워크스테이션을 이용한 전체 플레이트 측정까지 가능합니다. 이러한 다재다능함 덕분에 LIFTS가 혈청 항원 분석에 매우 유용하게 쓰일 것이며, 질병 분석 및 일반적인 공중 보건 분야에 광범위한 영향을 미칠 것으로 생각합니다. 이것으로 마치겠습니다. 시청해 주셔서 감사하며, 항체 프로파일링 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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멀티 플렉스 항체 검사 방법을 사용하여 Luminex xMAP 분석에 캡처 엘리사의 전환

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루시페라제 Immunoprecipitation 시스템 (입술)에 의해 항체 프로파일

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