루시페라제 Immunoprecipitation 시스템 (입술)에 의해 항체 프로파일

이 영상에서는 LiP-MS를 수행하는 단계를 보여줍니다. 분석 항원은 재조합 Renilla luciferase 또는 rook 항원 융합 단백질 형태로 CO one 세포에서 발현됩니다. 정제 과정 없이 조추출물을 얻어 사용합니다.

lips 분석은 조 rook 항원 추출물을 환자의 SRA와 함께 배양함으로써 시작됩니다. 마이크로타이터 웰에서 항체-항원 혼합물을 Protein A/G 비드가 포함된 96웰 필터 플레이트로 옮겨 IgG 분자를 캡처하며, Protein AG 비드가 포함된 필터 플레이트를 세척합니다. 항체와 결합된 rook 항원은 루미닌 기질을 첨가하여 측정하며, 발광 단위는 루미노미터로 측정합니다.

안녕하세요, 국립 치과 및 두개안면 연구소 감각생물학 실험실의 Catherine Chang 박사입니다. 오늘은 LIPS 루시퍼레이즈 면역침강 시스템의 절차를 보여드리겠습니다. 저희 실험실에서는 질병 또는 감염을 진단하기 위해 항체 역가를 측정하는 데 LIPS를 사용합니다.

항체 프로필 생성과 관련된 질병 상태의 층화, 백신 접종 모니터링 및 기타 응용 분야에 활용됩니다. 이제 시작해 보겠습니다. 형질전환을 시작하기 전, BMC Biotechnology 논문에 설명된 대로 vanilla luciferase 융합 플라스미드를 미리 준비합니다.

BYO etal 2005 플라스미드 DNA는 MIDI prep 키트를 사용하여 1~3 mg의 수율로 준비하며, 1 mg/mL의 스톡 용액 상태로 -20 °C에서 보관합니다. 형질전환에 사용되는 Cost one 세포는 표준 조직 배양 프로토콜에 따라 10% FCS가 포함된 DMEM에서 배양합니다. 형질전환 하루 전, Cost one 세포를 새로운 100 x 20 mm 디쉬에 플레이트당 약 2 × 10⁶ cells로 분할하여 접종하고, 다음 날까지 37 °C에서 배양합니다.

세포의 밀도는 80~95% Confluent여야 합니다. 4°C에서 보관된 FUgene 6 transfection 시약이 상온으로 가온되는 동안, transfection할 각 plasmid DNA용 1.5 mL 폴리프로필렌 microfuge 튜브에 라벨을 부착하되 튜브의 옆벽을 만지지 않도록 주의하십시오. 이미 94 µL의 optimum media가 들어있는 튜브에 FUgene 6 6 µL를 첨가하고 상온에서 5분 동안 배양하십시오. 1~2 µg의 plasmid-encoded Luciferase antigen fusion construct를 첨가한 후 튜브를 여러 번 뒤집어 섞어주고, 짧게 원심분리한 뒤 상온에서 15분 동안 배양하십시오.

DNA 융합 여섯 번째 최적 솔루션 전체를 cos. One 세포의 배지에 고르게 떨어뜨려 전달합니다. 형질전환된 cos one 세포를 2일 동안 배양한 후 수확합니다. 융합 단백질 수확을 시작하려면, 배지를 제거하고 6 mL의 PBS로 세포를 세척합니다.

조직 배양 접시에서 잔류 PBS를 피펫으로 제거하고, 차가운 lysis buffer 1.4 milliliters를 첨가한 후 셀 스크레이퍼로 세포를 수집합니다. 수집한 용해물의 절반을 얼음 위에 놓인 두 개의 1.5 milliliter 마이크로 원심분리 튜브에 각각 빠르게 옮깁니다. 세포를 파쇄하기 위해 Branson SOLIDIFIER 150을 사용합니다. 세포 용해물이 들어 있는 마이크로 원심분리 튜브를 얼음 위에 두고 5초 동안 펄스 처리합니다.

5초와 5초 동안 진행합니다. 초음파 처리 설정은 각각 2, 2 및 4로 설정합니다. 세포 용해물을 12,500 RPM에서 4분 동안 원심 분리합니다.

4 °C에서 원심분리합니다. 원심분리 사이에 튜브를 부드럽게 뒤집어 튜브 벽면에 느슨하게 붙어 있는 잔해물을 제거합니다. 그런 다음 두 튜브의 펠렛이 흐트러지지 않도록 주의하며 상층액을 얼음 위에 놓인 새 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.

용해물의 광단위(lu)를 측정하려면, 새로운 마이크로 원심분리 튜브에 용해물 1 µL와 PBS 8 µL를 넣어 희석하십시오. 희석된 혼합물에 one celent ine 기질 100 µL를 직접 첨가하고, 튜브 루미노미터를 사용하여 즉시 튜브 내의 발광도를 5초 동안 측정하십시오. 인간 및 동물 샘플을 다룰 때는 안전 주의 사항을 준수하십시오. 항원 프로파일링을 위한 환자 항체 공급원인 혈청 마스터 플레이트를 제작하려면, 먼저 96개 딥웰 폴리프로필렌 마이크로타이터 플레이트의 각 웰에 버퍼 A 450 µL를 첨가하십시오.

이 단계에서, 향후 SRA 샘플 추가 및 립스 분석(lips assay)의 다른 단계들을 모니터링하기 위한 추적자로 작용하도록 페놀 레드(phenol red) 염료를 버퍼 A에 포함할 수 있습니다. 다음으로, 450 µL의 버퍼가 들어 있는 각 웰에 각 샘플의 혈청 50 µL를 추가합니다. 참고로, 이는 버퍼 내에서 SRA를 1:10으로 희석하는 과정입니다.

일반적으로 마스터 플레이트의 마지막 두 웰에는 SRA를 첨가하지 않는데, 이는 마스터 플레이트를 추후 사용을 위해 보관하기 전 버퍼 블랭크(buffer blanks)용으로 예약해 두기 때문입니다. 회전 플랫폼(rotator platform) 위에서 1~2시간 동안 충분히 흔들어 섞어줍니다. 650 RPM에서 혈청은 4 °C에서 최소 한 달 또는 그 이상 안정적으로 유지되며, 립스 분석(lips assay)을 수행하기 전 보관할 경우 증발을 막기 위해 파라필름(parfum)으로 플레이트를 밀봉할 수 있습니다. 샘플 식별 번호와 마스터 플레이트의 해당 웰 정보가 포함된 스프레드시트를 작성하십시오. 혈청 테스트용 워킹 플레이트로는 폴리프로필렌 96-웰 얕은 웰 마이크로타이터 플레이트(polypropylene 96 shallow well microtiter plates)를 사용합니다.

첫 번째 단계로, 8채널 마이크로 파이펫을 사용하여 96웰 플레이트의 각 웰에 buffer A 40 µL를 분주합니다. 다음으로, 마스터 플레이트에서 희석된 혈청 10 µL를 취해 8채널 마이크로 파이펫으로 워킹 플레이트의 각 웰에 직접 분주합니다. 사용 후에는 마스터 플레이트를 파라필름으로 밀봉하고 덮개를 닫은 뒤, 새런랩으로 감싸 4 °C에서 보관합니다.

다음으로 rook 항원 추출물을 포함하는 마스터 믹스를 조제하여, 각 웰에 버퍼 A 50 µL당 1x10⁷ LU가 첨가되도록 합니다. 이 마스터 믹스를 제조한 후, 각 웰에 rook 항원 혼합물 50 µL를 피펫으로 분주합니다. 플레이트를 폴리스티렌 플레이트 커버로 덮고 로터리 셰이커에서 100 RPM으로 1시간 동안 배양합니다.

배양하는 동안 실온에서 냉장고로부터 PBS에 현탁된 30% ultra link protein ag bead 현탁액 1.5 mL 분취액을 꺼냅니다. 새로운 96-well filter HTS 플레이트의 각 웰 바닥에 5 µL씩 첨가합니다. 플레이트를 1시간 동안 배양한 후, A 채널 마이크로 파이펫을 사용하여 rook 항원 항체 반응 혼합물 100 µL를 protein ag bead가 들어 있는 96-well filter HTS 플레이트로 옮깁니다. 96-well filter 플레이트를 회전 쉐이커 위에 올려놓고 실온에서 100 RPM으로 1시간 더 배양합니다.

다음으로, 진공 매니폴드가 장착된 Biome FX 자동화 워크스테이션을 사용하여 필터 플레이트를 세척합니다. 각 웰을 100 µL의 buffer A로 8회 세척한 후, 100 µL의 PBS로 2회 세척하며, 마지막 세척 후 진공을 끕니다. 필터 플레이트를 꺼내어 종이 타월이나 여과지를 여러 겹 쌓아 닦아내어 플레이트의 상단과 하단의 수분을 모두 제거합니다. 플레이트 각 웰의 발광 강도를 측정하기 위해 Burt hold LB nine 60 Centro Microplate luminometer를 사용합니다.

기기를 켜고 인젝터를 증류수로 헹굽니다. 인젝터 세척 사이클을 사용합니다. INE 기질은 기기 프라이밍 및 작동에 사용되며, 제조사의 지침에 따라 Promega ranil 기질 키트를 사용하여 준비합니다. 일반적으로 플레이트 하나당 6 mL의 1x 기질 혼합액이 필요합니다. 기질 혼합액을 루미노미터에 로드하고, 기질 주입 및 플레이트 판독 설정이 포함된 프로그램 파일을 엽니다.

이러한 측정을 위해, 50 µL의 소인 기질을 주입합니다. 플레이트를 2초 동안 흔든 후, 5초 동안 발광을 측정합니다.

측정 완료 후 플레이트 판독을 시작하는 프로그램을 실행하고, 루미노미터(luminometer) 내의 액체 유출을 방지하기 위해 마이크로타이터 필터 플레이트를 즉시 제거하십시오. 데이터는 추가 분석을 위해 microwind 프로그램에서 Excel 형식으로 자동 내보내기 됩니다. 동일한 혈청을 사용한 두 번의 서로 다른 실험 결과에 대해 평균값을 산출합니다.

각 샘플에 대해 lu 타이터 값을 생성하는 것이 권장됩니다. 중복 샘플은 두 번의 실험 실행 간에 타이터 값에서 높은 일치도를 보여야 합니다. 데이터 플롯팅을 위해, 여기에서 보여주는 것과 같이 버퍼 공시료(blank) 값을 빼서 lu 타이터 값을 추가로 조정할 수 있습니다.

이 분석법의 민감도와 특이도는 대조군 샘플의 평균값에 표준편차의 3배 또는 5배를 더해 도출한 컷오프 값을 활용하여 계산할 수 있습니다. 지금까지 LIPS를 이용하여 항체 역가를 측정하는 방법을 살펴보았습니다. LIPS는 분석 최적화 과정이 최소한으로 필요하며, 그 간편함 덕분에 어떤 항원이든 2주 이내에 고품질의 데이터를 생성하는 데 사용할 수 있습니다. 인간 혈청을 다룰 때는 적절한 안전 예방 조치를 취하는 것이 중요하다는 점을 유념하십시오.

또한 LIFTS는 확장성이 매우 뛰어나기 때문에, 수동 세척을 통한 소량의 샘플 측정부터 로봇 워크스테이션을 이용한 전체 플레이트 측정까지 가능합니다. 이러한 다재다능함 덕분에 LIFTS가 혈청 항원 분석에 매우 유용하게 쓰일 것이며, 질병 분석 및 일반적인 공중 보건 분야에 광범위한 영향을 미칠 것으로 생각합니다. 이것으로 마치겠습니다. 시청해 주셔서 감사하며, 항체 프로파일링 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.