Stemgent 인간 TF의 Lentivirus와 인간의 섬유아 세포를 프로그래밍하여 유도 Pluripotent 줄기 세포의 생성 세트

안녕하세요, 제 이름은 브래드 해밀턴입니다. 저는 STEM Gen의 연구 개발 부서에서 근무하는 과학자입니다. 오늘은 렌티바이러스 전달 재프로그래밍 인자를 사용하여 인간 섬유아세포를 재프로그래밍하는 절차를 보여드리겠습니다.

이 절차는 IPS 셀을 생성하고 재프로그래밍 프로세스를 연구하는 데 사용할 수 있습니다. IPS 세포는 형태, 증식 및 분화 능력, 신체의 모든 조직 유형에서 ES 세포와 유사합니다. Human IPS cell은 세포를 얻기 위해 배아를 파괴해야 하는 윤리적 딜레마 없이 ES 세포의 주요 특성을 나타내기 때문에 ES 세포에 비해 뚜렷한 이점이 있습니다.

환자 특이적 IPS 세포의 생성은 비자가 이식 세포의 면역 거부 반응 가능성을 제거함으로써 맞춤형 재생 의학 치료에 대한 중요한 장애물을 우회합니다. 시작하겠습니다. 이 프로토콜의 여러 지점에서 발달 중인 IPSC 또는 유도 만능 줄기 세포의 배지를 메타 조절 배지로 교체합니다.

이 배지를 준비하는 데는 6일이 걸립니다. 따라서 실험을 시작하기 최소 일주일 전에 시작하십시오. 시작하려면 6의 각 우물을 씨를 뿌립니다.

2 밀리리터의 메스암페타민 성장에서 1 개의 필로폰 공급세포에서 2 배 10 내지 5 번째 CF를 가진 웰 플레이트. 배지는 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 배지를 human E-S-I-P-S 세포 배양으로 변경합니다.

배지는 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 하룻밤 동안 배양합니다. 상층액을 모아 4일 동안 24시간마다 새 배지로 교체하십시오. 0.22마이크로미터 필터를 통해 상등액을 필터링합니다.

수집된 상등액에 BFGF 염기성 섬유아세포 성장 인자 15나노그램을 보충합니다. 약 16 밀리리터의 필로폰 컨디셔닝 배지를 매일 수집 한 상등액을 4도 SIU에서 별도로 저장하게됩니다. 필로폰에 오염된 배지는 섭씨 4도에서 1-2주 동안 또는 영하 20도에서 몇 달 동안 보관할 수 있습니다.

이제 필로폰 조절 매체가 필요할 때 준비될 것이라고 확신했으므로 세포 준비에 대해 이야기해 보겠습니다. IPSC를 생성하는 첫 번째 작업은 렌티바이러스를 사용하여 인간 포피 섬유아세포 또는 줄기세포의 4가지 전사 특성을 가진 BJ 세포를 형질도입하는 것입니다. 형질도입을 위해 준비하기 위해 BJ 세포를 6웰 플레이트의 웰당 10 내지 5번째 세포의 밀도로 하고 배양한다.

세포는 2 밀리리터의 성장, 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 매체, 같은 날 5 % 이산화탄소. 6개의 웰 플레이트에 물에 희석한 0.1% 젤라틴 2ml를 넣고 섭씨 37도와 5% 이산화탄소에서 밤새 배양하여 필로폰 피더 플레이트를 준비하기 시작합니다. 젤라틴은 우물을 코팅하고 우물을 위한 매트릭스 역할을 합니다.

이제 BJ 세포는 바이러스의 형질주입을 준비하기 위해 렌티바이러스 형질주입을 할 준비가 되었습니다. 2밀리리터의 신선한 배지에 1밀리리터당 6마이크로그램의 폴리 브레인과 각각 인간 전사 인자 중 하나를 발현하는 4개의 렌티바이러스를 보충합니다. T 4, SO 2 nanog 및 lin 28, 각각은 동일한 감염 다중도 또는 MOI에 있습니다.

이러한 렌티바이러스는 모두 인간 재프로그래밍 인자 렌티바이러스 세트에 포함되어 있습니다. transduction을 수행하려면 BJ 세포 성장 배지를 바이러스 함유 배지로 교체하기만 하면 됩니다. 매체가 바닥을 고르게 코팅하도록 접시를 부드럽게 흔듭니다.

같은 날 섭씨 37도와 5%의 이산화탄소에서 하룻밤 동안 배양합니다. 액체 질소에서 cf one meth feeder cell의 한 바이알을 제거하고 해동합니다. 필로폰 피더 플레이트에서 젤라틴 용액을 제거하고, 이제 각각에 젤라틴 코팅이 되어 있습니다.

글쎄요, 2밀리리터의 필로폰 성장에서 다섯 번째 세포에 0.2 곱하기 10을 추가합니다. 보통. MES를 섭씨 37도에서 5%의 이산화탄소에서 밤새 배양합니다. 다음날, 0.05%트립신 EDTA로 BJ 세포를 분리하고 200Gs에서 5분 동안 원심분리기

원심분리 후 상층액을 흡인하고 성장 배지에서 세포를 재현탁합니다. 필로폰 피더 플레이트에서 매체를 제거하고 BJ 세포 현탁액의 웰당 2밀리리터를 추가합니다. BJ 세포 농도는 웰당 네 번째 세포에 대해 약 5배 10이어야 합니다.

섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 하룻밤 동안 배양합니다.필로폰 피더 플레이트의 BJ 세포가 물러난 후 24시간이 지나면 배지를 배아 줄기 또는 유도 만능 줄기 세포 배양인 인간 E-S-I-P-S로 교체합니다. 보통. 7일 동안 24시간마다 매체를 계속 변경합니다.

7일째에 ES 세포 배양 배지를 2ml의 필로폰 조절 배지로 교체합니다. 필로폰 공급세포는 IPS 세포를 성장시키는 데 필요한 용해성 인자를 제공하고 있습니다. 그러나 이제 우리는 문화를 건강하게 유지하기 위해 이러한 요소를 더 추가해야 합니다.

필로폰 조절 배지에는 필로폰 공급세포가 분비하는 모든 수용성 인자를 함유하고 있으며, 하룻밤 동안 섭씨 37도에서 배양하고 5%의 이산화탄소를 배양합니다. 범위를 살펴보면서 세포 식민지를 선택합니다. 24시간 전에 ccf 1개의 필로폰 공급기 세포가 인간 E-S-I-P-S 배양에서 선택한 콜로니를 후퇴시킨 신선한 24웰 플레이트의 모양과 같은 작은 소형 돔 모양으로 구별됩니다.

10 마이크로몰 줄기 분자 Y2 7 6 3 2가 보충된 배지. 의존성 키나아제 억제제. 처음 7일 동안 24시간마다 줄기 분자 Y2, 7, 6, 3, 2를 보충하지 않고 배양 배지를 변경합니다.

7일 후 매체를 필로폰으로 바꿉니다. 배지에 대한 조건은 전형적인 인간 ES 세포 형태를 보일 때까지 세포를 계속 계대시킵니다. 날카로운 모서리를 가진 식민지와 같은 작고 조밀한 돔을 찾으십시오.

군체는 균일해야 하며 세포질에 대한 핵의 비율이 높아야 합니다. 이 시점에서 ES 세포의 형태를 가진 콜로니가 개발되었지만, ES 세포의 특징적인 유전자도 발현합니까? TRA 180, 1, TRA 1, 60 SSEA, 4 s, SE, a 3 T, 4 sox, 2 nanog 및 SSEA 1과 같은 다능성의 마커에 대한 콜로니를 염색하기 위해 PBS로 세포를 3 번 부드럽게 세척하기 시작합니다.

다음으로, 500 마이크로 리터의 4 % 파라 폼, 알데히드 또는 기타 고정제로 실온에서 20 분 동안 세포를 고정합니다. 20분 후 PB S3로 세포를 더 세척하여 과도한 고정액을 제거합니다. 다음으로, 실온에서 1시간 동안 웰당 500마이크로리터의 차단 완충액에 세포를 배양하여 비특이적 결합을 차단하고, 차단 단계 후 차단 완충액에 1개에서 100개로 희석된 1차 항체 250마이크로리터를 각각 첨가합니다.

1차 항체의 세포를 다음날 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 배양합니다. PBS로 세포를 3회 세척하여 결합되지 않은 1차 항체를 제거합니다. 250마이크로리터의 2차 항체를 1-300으로 희석하고 버퍼를 차단하여 실온에서 1시간 동안 세포를 배양하고 2차 항체로 배양한 후 광표백을 피하기 위해 빛을 멀리합니다.

PBS로 세포를 세 번 세척하고 세 번째 세척합니다. 밀리리터당 1마이크로그램으로 DPI를 추가하여 핵을 염색합니다. 마지막으로, IPS 세포의 유전자 발현을 분석하십시오.

현미경 형태 결과, T, 4, SOX, 2개의 nanog 및 lin 28로 형질주입된 인간 4개의 피부 섬유아세포 세포는 형질도입 후 4일째부터 관찰되었으며, 세포 클러스터는 17일째에 더 밀집되어 plurry potency marker의 발현을 관찰했습니다. 분리된 IPS 세포 콜로니를 추가로 특성화하기 위해 ES 세포에서 발현되는 공통 다능성 마커의 존재를 찾았습니다. 군체는 강한 알칼리성 인산가수분해효소 활성을 나타냈습니다.

또한, 면역화학 또는 ICC는 표면 마커 TA 180 1 TRA 1 60 SSEA 4 및 SS EEA 3 및 핵 마커 T 4, SOX 2 및 Nanog를 포함한 다능성 마커 특이적 항체 패널을 사용하여 IPS 세포 콜로니에서 수행되었습니다. 고립된 IPS 군체는 모든 마커에 대해 양성이었습니다. ICC 결과는 IPS 세포가 적절한 다능성 마커 발현 패턴을 나타냈음을 보여주며, 이러한 IPS 세포가 미분화된 인간 E es 세포와 매우 유사하다는 것을 보여줍니다.

줄기 유전자로 인간 섬유아세포를 재프로그래밍하여 IPS 세포를 생성하는 방법을 보여드렸습니다. 인간 재프로그래밍 인자 렌티바이러스 세트. 이 절차를 수행할 때 몇 가지 요소를 고려하는 것이 중요합니다.

먼저, 최적의 형질도입 효율을 달성하기 위해 1차 형질도입 단계 중에 활성 바이러스 대 표적 비율을 수정해야 할 수 있습니다. 둘째, 표적 세포의 성장 조건이 영향을 미칠 수 있습니다. 건강한 세포와 증식성 세포를 재프로그래밍하는 것은 재프로그래밍에 더 적합합니다.

셋째, 서로 다른 세포 수에 대한 프로토콜을 수정할 때 표적 세포 수를 배양 접시의 표면적에 비례하여 조정하는 것이 좋습니다. 마지막으로, Y 2 7 6 3 2와 같은 암석 억제제를 적용하는 것은 최근 연구에서 인간의 예스 콜로니 생존을 향상시키는 데 유용성이 입증됨에 따라 성공적인 재프로그래밍을 보장하기 위해 고려해야 합니다. 그게 다야.

시청해 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.