Name: Stemgent 인간 TF의 Lentivirus와 인간의 섬유아 세포를 프로그래밍하여 유도 Pluripotent 줄기 세포의 생성 세트 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-12-08T19:45:00.000+00:00
Duration: 12 min 10 s
Description: 배우세요 인간 섬유아 세포를 렌티바이러스로 재프로그래밍하여 유도만능줄기세포를 생성하는 방법을. 이 기술은 재생의학 연구와 환자 맞춤형 치료에 활용됩니다.

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1. 프로그래밍 <ol><li> 6 잘 플레이트 잘 당 1 × 10 5 세포의 밀도에 시드 BJ 세포. 문화 성장 매체 2 ML (450 ML EMEM 50 ML ES 자격 FBS, 5 ML 10 MM이 아닌 필수 아미노산, 5 ML 페니실린 / 스트렙토 마이신, 5 ML 200 MM의 L - 글루타민과 0.9 ML 55 MM의 β와 보충의 세포 37 하루 - 메르 캅 토 에탄올) ° C와 5% CO 2. </li><li> 같은 날, 6 잘 접시에 물에 희석 젤라틴 0.1 %를 추가하고 37 ° C 야간 및 5% CO 2 잠복기하여 MEF 피더 플레이트를 준비하고 시작합니다. </li><li> 부화 후, BJ 세포에서 매체를 제거하고 각 잘하는 polybrene 6 μg / ML과 보완이 ML 성장 매체, 500 μl hOct4 - lentivirus, 50 μl hSox2 - lentivirus, 50 μl hNanog - lentivirus 50 μl hLin28 - lentivirus을 추가 . 부드럽게 매체도 코팅을 보장하기 위해 접시를 바위. 37 밤새 품어 ° C와 5% CO 2. </li><li> 같은 날, 액체 질소와 해동에서 CF - 1 MEF 세포 1 병을 제거합니다. 젤라틴 코팅 우물 (단계 1.2 참조)에서 액체를 제거하고 0.2 × 10 5 세포 / 음의 밀도에 MEF 피더 세포를 추가합니다. 물론 당 전체 볼륨은 MEF 성장 매체 (450 ML DMEM 50 ML FBS 및 5 ML 아닌 필수 아미노산과 보충)에서 세포의 2ml해야합니다. </li><li> 다음날 5 분 200 XG에서 0.05 % 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)과 원심 분리기와 BJ 세포를 분리합니다. 성장 매체 매체와 resuspend을 대기음. MEF 피더 플레이트 (단계 1.4 참조)에서 미디어를 제거하고 / 잘 BJ 세포 현탁액 2 ML를 추가합니다. 세포의 농도는 약 5 X 10 4 셀 / 잘해야합니다. 37 밤새 품어 ° C와 5% CO 2. </li><li> 인간의 ES / IPS 세포 배양 매체 (400 ML DMEM/F12 100 ML의 넉아웃 세럼 교체, 5 ML 10 MM이 아닌 필수 아미노산, 5 ML 200 MM L - 글루타민, 0.9 ML로 보충과 함께 중간 24시간 다시 시딩 이후를 교체 55 음 β - 메르 캅 토 에탄올 20 ML / NG 인간 재조합 bFGF). 7 일 동안 24 시간마다 중간 변경합니다. </li><li> 7 일 후에, (섹션 2 참조) MEF 시설 중간 중간 변경합니다. </li></ol> 2. MEF 에어컨 매체의 준비 <ol><li> 시드 CF - 1 2 × 10 5 세포에서 MEF 피더 세포 / 음 2 ML MEF 성장 매체에서 6 잘 접시에. 37 밤새 품어 ° C와 5% CO 2. </li><li> 인간의 ES / IPS 세포 배양 매체 매체를 변경합니다. 37 밤새 품어 ° C와 5% CO 2. </li><li> 나흘 동안 24 시간마다 뜨는 수집합니다. 0.22 μm의 필터를 통해 뜨는을 필터링합니다. </li><li> bFGF 50 NG / ML로 뜨는 보충. </li></ol> 3. IPS 콜로니 선택과 Passaging <ol><li> 세포 배양 접시 CF - 1 MEF의 피더 세포와 함께 미리 씨앗에 Stemolecule Y27632 10 μm의 보충과 함께 인간의 ES / IPS 문화 매체 ES 같은 식민지 다시 씨앗을 선택합니다. 37 밤새 품어 ° C와 5% CO 2. </li><li> 처음 7 일 (Stemolecule Y27632과 보완하지 않고)을 24 시간마다 중간 문화를 변경합니다. 7 일 후에 (준비 섹션 2 참조) MEF 시설 중간 중간 변경합니다. 그들은 일반적인 인간 ES의 형태를 보여주 때까지 우리는 세포를 passaging 계속했다. </li></ol> 4. Pluripotency 마커 Immunocytochemical 시험 <ol><li> 세포에게 PBS로 가볍게 세 번 씻으십시오. </li><li> 실온에서 20 분 정착액 500 μl와 세포를 수정. </li><li> 세포에게 PBS로 가볍게 세 번 씻으십시오. </li><li> 상온에 한 시간 동안 500 μl 차단 버퍼가 아닌 특정 바인딩을 차단합니다. </li><li> 4 하룻밤의 특정 기본 항체 250 μl와 세포를 품어 ° C (우리는 1:100에서 트라 - 1 - 81, 트라 - 1 - 60, SSEA - 4, SSEA - 3, Oct4, Sox2, Nanog와 Lin28을 사용 dilutions). </li><li> 세포에게 PBS로 가볍게 세 번 씻으십시오. </li><li> (우리가 안티 마우스 IgM Cy3 공액, 염소 안티 - 마우스 IgG Cy3 공액, 염소 방지 랫 IgM Cy3 공액 및 염소 안티 - 염소를 사용하여 빛으로부터 멀리 보관, 실온에서 1 시간 동안 이차 항체 250 μl와 세포를 품어 1:300 dilutions에서 래빗 ​​Cy3 공액). </li><li> 세포에게 PBS로 가볍게 세 번 씻으십시오. </li><li> 마지막으로 씻어 DAPI를 (최종 농도가 1 μg / ML) 추가하고 핵을 시각화하기 위해 5 분 알을 품다. </li><li> 확대에 따라 세포를 분석할 수 있습니다. </li></ol> 제 5 부 : 대표 결과 1. 형태 결과 : 인간 포피의 fibroblast (BJ) 세포는, Sox2, Nanog, Lin28과 Oct4와 함께 공동 transduced되었습니다. 형태학의 변경 사항은 4 일 후 전달 빠르면 관찰하고, 세포의 클러스터보다 밀접하게 일 17 일 (그림 1)에서 포장되었다되었습니다. 식민지는 수동 일 25 들어서 CF - 1 MEF의 피더 세포에 교양되었습니다. 프로그래밍 후 IPS 세포 콜로니 형성을 촉진하기 위해, 우리는 Stemolecule Y27632을 사용각 통과하는 동안 초기 밤새 시딩의 바위 억제제. 좋은 형태로 IPS 세포 식민지는 식민지 세 연속 라운드가 따기 passaging 후 관찰했다. 2. Pluripotency 마커 표현 : 더욱 고립 IPS 세포 식민지를 특성화하기 위해, 우리는 ES 세포에서 표현 일반 pluripotency 마커의 존재를 보았다. 식민지는 강한 알칼리성 인산 가수 분해 효소 (AP) 활동 (그림 2)을 전시. 또한, immunocytochemistry (ICC)는 표면 마커 트라 - 1 - 81, 트라 - 1 - 60, SSEA - 4 및 SSEA - 3뿐 아니라 핵 마커를 포함하여, pluripotency 마커 특정 항체의 패널과 IPS 세포 식민지에서 수행되었다 Oct4, Nanog Sox2 및. 절연 IPS의 식민지 모든 마커 (그림 3)에 대한 긍정했다. ICC의 결과는 IPS 세포가 이러한 IPS 세포가 밀접하게 undifferentiated 인간의 ES 세포를 닮은 것을 보여주는, 적절한 pluripotency 표시자 표현식 패턴을 전시 것을 보여줍니다. <img src="/files/ftp_upload/1553/1553fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1 :의 형태학의 변화 BJ 세포를 transduced. 일반적인 IPS 세포 콜로니의 명시야 이미지 (A) 4 일 (B) 17 일 후 전달에서 형성. <img src="/files/ftp_upload/1553/1553fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2 : 다시 프로그램 BJ 세포의 AP 활동. 세 가지 식민지는 Stemgent 알칼리성 인산 가수 분해 효소의 스테 이닝 키트 물들다. <img src="/files/ftp_upload/1553/1553fig3.jpg" alt="그림 3" /> 그림 3 : 표면 마커 트라 - 1 - 81, 트라 - 1 - 60, SSEA - 4 및 SSEA - 3, 핵 마커 10월 4일, Nanog와 Sox2 : 인간 IPS 세포는 다음과 ES 세포 특정 마커의 높은 수준을 표현.

<ol><li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126, 663-676 (2006).</li>
<li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li>
<li>Yu, J., Vodyanik, M. A., Smuga-Otto, K., Antosiewicz-Bourget, J., Frane, J. L., Tian, S., Nie, J., Jonsdottir, G. A., Ruotti, V., Stewart, R., Slukvin, I. I., Thompson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318, 1917-1920 (1917).</li>
<li>Watanabe, K., Ueno, M., Kamiya, D., Nishiyama, A., Matsumura, M., Wataya, T., Takahashi, J. B., Nishikawa, S., Muguruma, K., Sasai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 25, 681-686 (2007).</li>
<li>Koyanagi, M., Takahashi, J., Arakawa, Y., Doi, D., Fukuda, H., Hayashi, H., Narumiya, S., Hashimoto, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+the+Rho%2FROCK+pathway+reduces+apoptosis+during+transplantation+of+embryonic+stem+cell-derived+neural+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Inhibition of the Rho/ROCK pathway reduces apoptosis during transplantation of embryonic stem cell-derived neural precursors.</a> J. Neurosci. Res. 86, 270-280 (2008).</li>
</ol>

이 문서의 저자는이 문서에서 사용되는 시약 및 악기를 생산 Stemgent 고용하고 있습니다.

이러한 결과는 인간의 섬유아 세포에서 전사 요소를 transduced Stemgent 인간 TF의 Lentivirus 세트가 효율적으로의 이소성 표현을 유도하여 IPS의 식민지를 생성하는 데 사용할 수있는 것을 보여줍니다. 프로그래밍 실험을 설계할 때, 몇 가지 변수는 프로그래밍의 효율성을 최적화하는 것으로 간주되어야합니다. 첫째, 활성 바이러스에 대 목표 비율 (감염 뫄의 다중성)은 최적의 전달 효율을 달성하기 위해 기본 전달 단계에서 수정해야 할 수 있습니다. 둘째, 대상 세포의 성장 상태는 프로그래밍 영향을 줄 수 있습니다. 건강하고 proliferative 세포 프로그래밍을 더 의무가 있습니다. 셋째, 서로 다른 세포 숫자에 대한 프로토콜을 수정할 때, 그것은 대상 셀 번호가 문화 요리의 표면 영역에 비례 조정하는 것이 좋습니다. 마지막으로, 같은 Y27632으로 적용 록 저해제는 최근 연구에서 향상 hES 콜로니 생존에의 유틸리티를 보여준 것처럼 성공적인 프로그래밍을 보장하기 위해 고려되어야합니다. 4,5

<table><tbody><tr><td>Human TF 렌티바이러스 세트</td><td>Stemgent</td><td>00-0005</td><td></td></tr><tr><td>Stemolecule Y27632</td><td>Stemgent</td><td>04-0012</td><td></td></tr><tr><td>TRA-1-81 항체</td><td>Stemgent</td><td>09-0012</td><td></td></tr><tr><td>TRA-1-60 항체</td><td>Stemgent</td><td>09-0009</td><td></td></tr><tr><td>SSEA-4 항체</td><td>Stemgent</td><td>09-0003</td><td></td></tr><tr><td>SSEA-3 항체</td><td>Stemgent</td><td>09-0014</td><td></td></tr></tbody></table>

stemgent 인간 tf의 lentivirus와 인간의 섬유아 세포를 프로그래밍하여 유도 pluripotent 줄기 세포의 생성 세트

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells by Reprogramming Human Fibroblasts with the Stemgent Human TF Lentivirus Set

2006 년, 야마 나카와 동료 먼저 Oct4의 레트로 바이러스 - 중재 전달과 표현, Sox2, C - Myc와 Klf4는 마우스 섬유아 세포에서 pluripotent 상태를 유도 할 수 있다고 보여주었다. 1 같은 그룹은 또한 인간의 체세포의 성공적인 프로그래밍에보고 retroviral 벡터에 의해 전달 같은 전사 요소의 인간 버전을 사용하여 유도된 pluripotent 줄기 (IPS) 전지 2. 또한, 제임스 톰슨 외가. 보고한 요인의 다른 세트의 lentivirus - 중재 공동 표현 (Oct4, Sox2, Nanog와 Lin28 ) IPS 세포에 인간의 체세포를 프로그래밍 가능했습니다 3. IPS 세포는 형태, 증식 및 신체의 모든 조직 유형으로 차별화할 수있는 능력의 ES 세포와 비슷합니다. 그들은 배아 파괴의 윤리적 딜레마없이 ES 세포의 주요 특성을 전시 등 인간 IPS 세포는 ES 세포에 비해 뚜렷한 장점이 있습니다. 환자 특정 IPS 세포의 생성이 아닌 autologous 이식 세포의 면역 거부의 가능성을 제거하여 맞춤형 재생 의료의 치료에 중요한 장애물을 circumvents. 여기서 우리는 Stemgent 인간 TF의 Lentivirus 세트를 사용하여 인간 fibroblast 세포를 프로그래밍을위한 프로토콜을 보여줍니다. 우리는 또한이 세트로 다시 프로그램 세포 형태 사일 후 전달 IPS를 표시하기 시작 것을 보여줍니다. Stemolecule Y27632를 사용하여, 우리는 식민지 세 연속 라운드가 따기 passaging 후 IPS 세포와 관찰 올바른 형태를 위해 선택했습니다. 우리는 또한 입증되는 프로그래밍 세포 pluripotency 마커 AP, 표면 마커 트라 - 1 - 81, 트라 - 1 - 60, SSEA - 4, SSEA - 3와, 그리고 핵 마커 Oct4, Nanog Sox2 및 표시 후.

우리는 인간의 요인 Oct4, Sox2, Nanog, 그리고 Lin28의 lentivirus - 중재 전송을 사용하여 인간의 체세포에서 유도된 pluripotent 줄기 세포의 생성에 대한 프로토콜을 보여줍니다. Pluripotency는 형태학 및 배아 줄기 (ES) 세포 특정 마커의 존재에 의해 확인되었다.

Stemgent 인간 TF의 Lentivirus와 인간의 섬유아 세포를 프로그래밍하여 유도 Pluripotent 줄기 세포의 생성 세트

2006년, Yamanaka와 동료들은 레트로바이러스 매개 전달 및 Oct4, Sox2, c-Myc, Klf4의 발현이 ...을 유도할 수 있음을 처음으로 입증하였다.

안녕하세요, 제 이름은 Brad Hamilton입니다. 저는 STEM Gen의 연구 개발 부서에서 근무하고 있는 과학자입니다. 오늘은 렌티바이러스를 통해 전달된 리프로그래밍 인자를 사용하여 인간 섬유아세포를 리프로그래밍하는 절차를 보여드리겠습니다.이 절차는 IPS 세포를 생성하고 리프로그래밍 과정을 연구하는 데 모두 사용될 수 있습니다. IPS 세포는 형태, 증식, 그리고 신체의 모든 조직 유형으로 분화하는 능력 면에서 ES 세포와 유사합니다. 인간 IPS 세포는 세포를 얻기 위해 배아를 파괴해야 하는 윤리적 딜레마 없이 ES 세포의 핵심 특성을 나타내므로 ES 세포보다 뚜렷한 장점이 있습니다.환자 맞춤형 iPS 세포의 생성은 비자가 이식 세포의 면역 거부 반응 가능성을 제거함으로써 개인 맞춤형 재생 의학 치료의 중요한 장애물을 극복하게 해줍니다. 그럼 시작하겠습니다. 이 프로토콜의 여러 단계에서, 발달 중인 iPSC 또는 유도만능줄기세포의 배지를 meth 조건화 배지로 교체하게 됩니다.이 배지를 준비하는 데는 6일이 소요됩니다. 따라서 실험 시작 예정일로부터 최소 일주일 전에 준비를 시작하십시오. 먼저 6웰 플레이트의 각 웰에 시딩하십시오.2 mL의 meth 성장 배지가 담긴 웰 플레이트에 2 × 10⁵ CFU의 meth 피더 세포를 넣고 37 °C, 5% CO₂ 조건에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 배지를 human E-S-I-P-S 세포 배양 배지로 교체합니다.배지를 37 °C, 5% CO2 조건에서 하룻밤 동안 배양합니다. 4일 동안 24시간마다 상층액을 수집하고 새 배지로 교체합니다. 수집한 상층액을 0.22 µm 필터로 여과합니다.수집한 상청액에 15 ng/mL의 BFGF (basic fibroblast growth factor)를 보충합니다. 그러면 약 16 mL의 meth conditioned medium이 생성됩니다. 매일 수집한 상청액은 4 °C에서 각각 별도로 보관하십시오. Meth conditioned medium은 4 °C에서 1~2주 동안, 또는 -20 °C에서 수개월 동안 보관할 수 있습니다.이제 meth 조건 배지가 필요할 때 바로 사용할 수 있도록 준비되었으므로, 세포 준비에 대해 알아보겠습니다. iPSC 생성의 첫 번째 과제는 렌티바이러스를 사용하여 인간 포피 섬유아세포 또는 BJ 세포에 줄기세포의 특징인 4가지 전사 인자를 형질도입하는 것입니다. 형질도입을 준비하기 위해, 6웰 플레이트의 웰당 1×10⁵ cells 밀도로 BJ 세포를 분주하고 배양하십시오.세포를 2 mL의 성장 배지에서 37 °C, 5% CO2 조건으로 하룻밤 동안 배양합니다. 같은 날, 6-well 플레이트에 물로 희석한 0.1% gelatin 2 mL를 첨가하고 37 °C, 5% CO2 조건에서 하룻밤 동안 배양하여 meth feeder 플레이어 준비를 시작합니다. gelatin은 웰을 코팅하여 세포를 위한 매트릭스 역할을 합니다.이제 BJ 세포를 렌티바이러스 형질전환에 사용할 준비가 되었으며, 형질전환을 위한 바이러스를 준비합니다. 2 mL의 신선한 배지에 6 µg/mL의 polybrene과 인간 전사 인자인 T4, SO2, nanog, lin28을 각각 발현하는 4종의 렌티바이러스를 각각 동일한 감염 다중도(multiplicity of infection, MOI)가 되도록 첨가합니다.이 렌티바이러스들은 모두 인간 리프로그래밍 인자 렌티바이러스 세트에 포함되어 있습니다. 트랜스덕션을 수행하려면 BJ 세포 성장 배지를 바이러스가 포함된 배지로 교체하기만 하면 됩니다. 배지가 바닥면을 고르게 덮을 수 있도록 플레이트를 부드럽게 흔들어 줍니다.같은 날 37 °C, 5% CO2 조건에서 하룻밤 동안 배양합니다. 액체 질소에서 cf one meth feeder 세포가 담긴 바이알 하나를 꺼내 해동합니다. gelatin이 코팅된 meth feeder 플레이트에서 gelatin 용액을 제거합니다.BJ 세포 0.2 × 10⁵개를 2 mL의 meth 성장 배지에 첨가합니다. 해당 배양액을 37 °C, 5% CO₂ 조건에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 0.05% trypsin EDTA로 BJ 세포를 떼어낸 후 200 ×g에서 5분 동안 원심 분리합니다.원심분리 후, 상층액을 흡입하여 제거하고 세포를 성장 배지로 재부유시킵니다. meth 피더 플레이트에서 배지를 제거하고, 웰당 2 mL의 BJ 세포 현탁액을 추가합니다. BJ 세포의 농도는 웰당 약 5 × 10⁴ cells가 되어야 합니다.37 °C, 5% CO₂ 조건에서 하룻밤 동안 배양합니다. BJ 세포를 meth 피더 플레이트에 파종한 지 24시간 후에 배지를 배아줄기세포 또는 유도만능줄기세포 배양 배지인 human E-S-I-P-S로 교체합니다. 7일 동안 24시간마다 배지 교체를 계속합니다.7일 차에, ES 세포 배양액을 2 mL의 meth 조건 배지로 교체합니다. meth 피더 세포는 iPS 세포 성장에 필요한 수용성 인자들을 제공해 왔습니다. 하지만 이제 배양 상태를 건강하게 유지하기 위해 이러한 인자들을 더 추가해야 합니다.Meth 조건 배지는 37°C, 5% CO2 조건에서 하룻밤 동안 배양한 meth feeder cell에서 분비된 모든 수용성 인자를 포함하고 있습니다. 현미경을 통해 세포 콜로니를 선택합니다. 24시간 전에 ccf one meth feeder cell을 미리 도말한 새로운 24-well plate에서 작고 조밀한 돔 모양으로 구분되는 콜로니를 선택하여 human E-S-I-P-S 배양액으로 회수합니다.10 µM의 stem molecule Y 2 7 6 3 2가 첨가된 배지. 이는 dependent kinase 억제제입니다. 처음 7일 동안은 24시간마다 stem molecule Y 2 7 6 3 2를 첨가하지 않은 새 배지로 교체하십시오.7일 후, 배지를 meth. Condition 배지로 교체하십시오. 세포가 전형적인 인간 ES 세포 형태를 보일 때까지 계대 배양을 계속하십시오. 경계가 뚜렷하고 작고 조밀한 돔 형태의 콜로니가 형성되는지 확인하십시오.콜로니는 균일해야 하며 세포질 대비 핵의 비율이 높아야 합니다. 이 단계에서 ES 세포의 형태를 가진 콜로니를 배양했지만, ES 세포의 특성 유전자 또한 발현하고 있는지 확인해야 합니다. 이를 확인하기 위해 TRA 180, TRA 1 60, SSEA 4, SSEA 3, T 4, sox 2, nanog 및 SSEA 1과 같은 다능성 마커로 콜로니를 염색하십시오. 먼저 PBS로 세포를 부드럽게 3회 세척합니다.다음으로, 500 µL의 4% paraformaldehyde 또는 다른 고정액을 사용하여 상온에서 20분 동안 세포를 고정합니다. 20분 후, PBS로 세포를 3회 더 세척하여 과잉 고정액을 제거합니다. 이어서, 웰당 500 µL의 블로킹 버퍼(blocking buffer) 내에서 상온에서 1시간 동안 세포를 배양하여 비특이적 결합을 차단합니다. 블로킹 단계 후, 블로킹 버퍼에 1:100으로 희석한 1차 항체 250 µL를 각각 추가합니다.세포를 1차 항체와 함께 4°C에서 하룻밤 동안 배양한 후 다음 날, 결합하지 않은 1차 항체를 제거하기 위해 PBS로 세포를 세 번 세척합니다. 1:300으로 희석한 2차 항체 250 µL와 블로킹 버퍼를 사용하여 세포를 상온에서 1시간 동안 배양하며, 2차 항체 배양 후 광퇴색을 방지하기 위해 빛이 닿지 않도록 보관합니다.세 번째 세척 단계까지 PBS로 세포를 세 번 세척하십시오. 핵을 염색하기 위해 1 µg/mL 농도의 DPI를 첨가하십시오. 마지막으로, IPS 세포의 유전자 발현을 분석하십시오.현미경 하의 형태학적 결과에서, T4, SOX2, Nanog 및 Lin28이 공동 형질전환된 인간 피부 섬유아세포에서 형태학적 변화가 형질전환 후 이르면 4일 차에 관찰되었으며, 17일 차에는 세포 군집이 더 조밀하게 뭉쳤습니다. 분화능 마커의 발현을 확인하였습니다. 분리된 iPS 세포 콜로니의 특성을 추가로 규명하기 위해, ES 세포에서 발현되는 공통적인 분화능 마커의 존재 여부를 확인하였습니다. 콜로니는 강한 알칼리성 인산분해효소(alkaline phosphatase) 활성을 나타냈습니다.또한, 표면 마커인 TA 180, TRA-1-60, SSEA-4 및 SSEA-3와 핵 마커인 OCT4, SOX2 및 Nanog를 포함하는 다능성 마커 특이적 항체 패널을 사용하여 iPS 세포 콜로니에 대해 면역화학 염색 또는 ICC를 수행하였습니다. 분리된 iPS 콜로니는 모든 마커에 대해 양성 반응을 보였습니다. ICC 결과는 iPS 세포가 적절한 다능성 마커 발현 패턴을 나타냈음을 보여주며, 이는 이 iPS 세포들이 분화되지 않은 인간 ES 세포와 매우 유사함을 입증합니다.지금까지 stem gen을 사용하여 인간 섬유아세포를 리프로그래밍함으로써 IPS 세포를 생성하는 방법을 살펴보았습니다. 인간 리프로그래밍 인자 렌티바이러스 세트입니다. 이 절차를 수행할 때는 몇 가지 요소를 고려하는 것이 중요합니다.첫째, 최적의 형질전환 효율을 달성하기 위해 1차 형질전환 단계에서 활성 바이러스 대 타겟 세포의 비율을 수정해야 할 수 있습니다. 둘째, 타겟 세포의 성장 조건이 영향을 미칠 수 있습니다. 건강하고 증식 능력이 있는 세포를 재프로그래밍하는 것이 더 용이합니다.셋째, 서로 다른 세포 수에 맞춰 프로토콜을 수정할 때는 배양 접시의 표면적에 비례하여 목표 세포 수를 조정하는 것이 권장됩니다. 마지막으로, 최근 연구에서 Y 2 7 6 3 2와 같은 rock 억제제가 인간 iPS 세포 콜로니의 생존율을 높이는 데 유용함이 입증되었으므로, 성공적인 리프로그래밍을 위해 이를 적용하는 것을 고려해야 합니다. 이상입니다.시청해 주셔서 감사드리며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 동영상은 inducible의 lentivirus를 사용하여 유도된 pluripotent 줄기 세포를 생성하는 절차를 보여줍니다 표현 Oct4, Sox2, C - Myc와 Klf4.

삭스 - 2의 강제 표현을 통해 MEFS에서 IPS 세포를 생성, 10 - 4, C - Myc, 그리고 Klf4

Stemgent 독스의 Inducible 마우스 TF의 Lentivirus 세트 유도된 pluripotent 줄기 (IPS) 셀에 마우스 배아 섬유아 세포 (MEFs)를 재설 정할 수 있습니다. 다음은 마우스 프로그래밍 전사 요인 Oct4의 독스 - inducible 표현에 대한 프로토콜을 보여줍니다, Sox2, Klf4과 c - Myc은 표현하는 일반적인 MES pluripotency 마커 IPS의 식민지를 생성합니다.

4 전사 인자와 마우스 배아 섬유아 세포를 프로그래밍하여 유도 Pluripotent 줄기 세포의 생성, Doxycycline는 Lentiviral 전달 시스템 Inducible

우리는 함께 retroviral Oct3 / 4, Sox2, Klf4과 c-myc (OSKM)를 인코딩 벡터, 라이브 염색법에 의해 정확하게 다시 프로그램 hiPSC의 신분을 이용하여 인간의 유도된 pluripotent 줄기 세포 (hiPSC) Tra-로 인간의 체세포의 효율적인 언어학 재활을위한 프로토콜을 제시 1-81 항체.

인간 유도 Pluripotent 줄기 세포의 선택 및 분리 식민지는 성인 섬유아 세포에서 다시 프로그램

OCT4의 레트로 바이러스 - 매개 자궁외 표현을 통해 인간의 유도된 pluripotent 줄기 세포 (iPSCs) 생성하는 방법은, SOX2, KLF4 및 MYC가 설명되어 있습니다. GFP 발현을 바탕으로 인간 iPSC 식민지를 식별하기위한 실용적인 방법도 설명되어 있습니다.

GFP와 Retroviral 벡터를 사용하여 유도 Pluripotent 줄기 세포 (iPSCs)로 인간 체세포를 프로그래밍

여기 하나의 lentiviral 재활 벡터를 사용하여 말초 혈 3-4 ML에서 인간 iPSCs의 생성을위한 간단하고 효과적인 프로토콜을 보여줍니다. 즉시 사용할 수 혈액 세포의 재 프로그래밍하면 폭 넓은 연구 공동체에 액세스하여 iPSC 기술의 활용을 촉진 것을 약속드립니다.

STEMCCA Lentiviral 벡터를 사용하여 말초 혈에서 인간 유도 만능 줄기 세포의 생성

여기, 우리는 일관된 결과 및 향상된 효율성을 보여줍니다 센다이 바이러스와 유전자가없는 인간 유도 만능에 인간의 체세포를 재 프로그램하는 우리의 설립 방법을 제시한다.

센다이 바이러스와 인간의 체세포의 효율적인 생성 인간 유도 만능 줄기 세포

유도 만능 줄기 세포의 생성은자가 이식의 유도에 대한 매혹적인 전망을 제공합니다. 그러나, 만능 상태와 힘든 다시 차별화를 통해 진행은 여전히​​ 임상 번역을 방해한다. 여기에서 우리는 성인 인간 섬유 아세포의 유도와 유도 된 신경 전구 세포에 자신의 직접 변환과 신경 계통에 후속 차별화를 설명합니다.

성인 인간 섬유 아세포의 유도 및 확장 신경 전구 세포에 자신의 직접 변환

유도 만능 줄기 세포 (iPSCs)의 임상 응용 프로그램 및 기초 연구에 대한 환자의 특정 조직의 소스를 나타냅니다. 여기서는 비 - 에피 솜 통합 플라스미드를 사용하여 바이러스 프리 iPSCs에 냉동 버피 코트로부터 얻은 인간의 말초 혈 단핵 세포 (PBMNCs)를 재 프로그래밍 상세한 프로토콜을 제시한다.

비 통합 에피 솜 플라스미드를 사용하여 냉동 버피 코트에서 유도 만능 줄기 세포의 생성

이 프로토콜은 재프로그래밍 인자를 포함하는 마트리겔 및 센다이 바이러스 벡터의 조합을 사용하여 공급자가 없는 조건에서 인간 말초 T 세포에서 유도 만능 줄기 세포(iPSC)를 생성하는 방법을 설명합니다.

피더가없는 조건에 센다이 바이러스를 사용하여 인간 말초 T 세포로부터 유도 된 다 능성 줄기 세포의 생성

여기 우리 재활 요인 인코딩 수정된 mRNAs를 사용 하 여 유도 만능 줄기 세포로 인간의 기본 섬유 아 세포를 재 설 정할 임상 관련, 높은 효율, 피더 무료 메서드를 설명 하 고 성숙한 예측에 관한-367/302 모방. 또한는 재활 효율성을 평가 하는 방법 클론 iPSC 식민지 확장 및 pluripotency 마커 TRA-1-60의 식을 확인 있습니다.

인간의 기본 섬유 아 세포의 유도 만능 줄기 세포로 재프로그래밍 RNA 기반

이 프로토콜은 조혈 줄기 및 전구 세포를 생성하는 전사 인자 GATA2, GFI1B 및 FOS의 발현을 강제함으로써 인간 진피 섬유아세포에서 혈생 프로그램의 유도를 입증한다.

전사 요인의 강제 표현에 의한 인간 섬유아세포의 혈생 재프로그래밍

배우세요 인간 섬유아 세포를 렌티바이러스로 재프로그래밍하여 유도만능줄기세포를 생성하는 방법을. 이 기술은 재생의학 연구와 환자 맞춤형 치료에 활용됩니다.

Stemgent 인간 TF의 Lentivirus와 인간의 섬유아 세포를 프로그래밍하여 유도 Pluripotent 줄기 세포의 생성 세트

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