프라이머 확장 캡처 : 경비 저하 DNA 소스에서 타겟 시퀀스 불러오기

이 영상에서는 매우 낮은 복제수(copy number)의 고도로 단편화된 DNA 소스로부터 표적 DNA 서열을 회수할 수 있는 프라이머 연장 캡처(primer extension capture, PECA) 기술에 대해 설명합니다. 본 연구진은 이 기술을 사용하여 40,000년 이상 된 네안데르탈인 뼈에서 완전한 미토콘드리아 게놈을 시퀀싱했으며, 이 방법은 여러 개체로부터 임의의 작은 표적 영역이나 단일 염기 다형성(single nucleotide polymorphisms)을 캡처하는 데 사용될 수 있습니다. 이 절차의 주요 단계는 1차 DNA 라이브러리의 PCR 증폭, quantitative PCR을 통한 증폭 라이브러리의 정량 분석, 증폭 라이브러리에 대한 1차 연장(primary extension)의 표적화, 비표적 단편을 제거하기 위한 1차 연장 산물의 비드 캡처, 그리고 캡처 및 세척된 표적의 용출 및 시퀀싱입니다.

안녕하세요, 라이프치히 막스 플랑크 진화인류학 연구소 유전학과의 Shanti Payable 연구실 소속 Adrian Briggs입니다. 오늘은 고대 뼈와 같이 복잡하고 심하게 분해된 DNA 소스로부터 관심 있는 특정 DNA 서열을 분리하는 절차를 보여드리겠습니다. 저희는 이 절차를 통해 Homo neanderthalensis, 즉 네안데르탈인의 미토콘드리아 유전적 다양성을 연구해 왔습니다.

시작해 보겠습니다. 본 실험에 사용된 DNA는 네안데르탈인의 지리적 분포 전역의 여러 유적지에서 발견된 40,000년에서 70,000년 전의 네안데르탈인 뼈에서 추출한 것입니다. 먼저 뼈를 하룻밤 동안 UV 광선에 노출시켜 표면의 외부 DNA를 제거합니다.

미세 드릴을 사용하여 100에서 500 mg의 뼈 가루를 생성합니다. 뼈 가루로부터의 DNA 추출은 Nadine Rockland와 Michael Hof가 작성한 2007년 논문 'comparison and optimization of ancient DNA extraction'에 기술된 절차를 사용하여 수행합니다. 그 다음, 모든 DNA 단편의 끝에 유니버설 어댑터 프라이밍 사이트를 추가하여 DNA 추출물을 시퀀싱 라이브러리로 변환합니다. 이는 네안데르탈인 뼈에서 생성된 4 5 4 라이브러리가 때로는 단 몇 pg에 불과한 매우 적은 양의 DNA만을 포함하고 있기 때문입니다. 이 1차 DNA 라이브러리는 먼저 유니버설 라이브러리 프라이머에 대응하는 에멀전 PCR 프라이머를 이용한 PCR로 증폭됩니다.

라이브러리 증폭을 위한 PCR 믹스를 준비하려면, PCR 튜브에 다음 시약들을 혼합하십시오. 10 X GAMP PCR 버퍼 10 µL, 염화마그네슘(magnesium chloride) 10 µL 2개, BSA 2 µL, dNTP 믹스 1 µL, 4 54 MPCR 정방향 및 역방향 프라이머 각각 3 µL, amply gold DNA polymerase 1 µL, 라이브러리 템플릿 25 µL를 넣습니다. 마지막으로, PCR 등급의 증류수 45 µL를 추가하여 총 부피를 100 µL로 맞춥니다. amply Tech gold DNA polymerase는 상온에서 안정적이므로, 얼음 위에서 작업할 필요는 없습니다.

PCR 반응액을 준비한 후, PCR 튜브를 서모사이클러(thermocycler)에 넣고 95 °C에서 12분간의 변성 단계로 시작합니다. 이어서 95 °C에서 30초, 60 °C에서 1분, 72 °C에서 1분으로 구성된 사이클을 14회 반복합니다. 이 14회 사이클이 끝나면 72 °C에서 5분간 최종 단계를 설정하며, 이후 PCR 증폭이 완료되어 사용할 때까지 PCR 튜브를 10 °C에서 무기한 보관할 수 있습니다. 다음으로 제조업체의 지침에 따라 Kyogen MinLu 스핀 컬럼을 사용하여 PCR 생성물을 정제하고, 1차 확장 및 생성물 캡처 전에 MinLu 키트에 제공된 50 µL의 EB 버퍼로 컬럼에서 DNA를 용출합니다.

증폭된 라이브러리 산물의 양을 정량하고 품질을 확인하기 위해, 증폭 전후 라이브러리 분주액에 대해 정량 PCR(Quantitative PCR)을 수행해야 합니다. 14 사이클 동안 증폭된 라이브러리는 1차 라이브러리보다 DNA 양이 수천 배 더 많아야 합니다. 그렇지 않은 경우, 증폭 조건을 점검하고 다시 수행해야 합니다.

증폭된 라이브러리에서 관심 서열을 캡처하는 데 사용될 1차 연장 캡처 프라이머는 일반적인 PCR 프라이머와 같이 설계하여, 각 표적 서열의 5' 말단에 있는 12 base 꼬리 서열과 일치하도록 하며, 이상적인 어닐링 온도는 60 °C가 되도록 설정하고 5' 말단에 비오틴 잔기를 포함해야 합니다. 200 µM 스톡으로 제조된 단일 멀티플렉스 믹스에 최대 150개의 PEC 프라이머를 함께 사용할 수 있습니다. 1차 연장 반응을 위해, 적절한 PCR 튜브에 10 X GAMP PCR 버퍼 5 µL, 염화마그네슘 2.5 µL, BSA 1 µL, dNTP 0.5 µL를 넣어 PCR 믹스를 준비합니다. 여기에 1차 연장 캡처 프라이머 믹스 5 µL, Taq gold DNA 중합효소 0.5 µL, 14 사이클 증폭된 라이브러리 DNA 2 µL를 혼합하고, 마지막으로 PCR 등급의 증류수 31 µL를 추가하여 총 부피를 50 µL로 맞춥니다.

증폭된 라이브러리 템플릿의 농도가 µL당 1×10¹² copies를 초과하는 경우, 반응 혼합물에 2×10¹² copies 이하로 첨가되도록 EB buffer로 먼저 희석해야 합니다. PCR 튜브를 준비한 후 써모사이클러(thermocycler)에 넣고 단일 반응 실행으로 설정하십시오. 95 °C에서 12분간 변성(denaturation)시키는 것으로 시작하여, 60 °C에서 1분, 이어서 1차 신장(primary extension)을 위해 72 °C에서 5분간 유지합니다.

단일 사이클이 완료되면, 다음 단계까지 PCR 생성물을 유지하기 위해 72 °C로 유지합니다. 비특이적 프라이머 결합을 방지하고 직접 캡처하기 위해, 반응 혼합물이 72 °C로 유지되는 서모사이클러 내에 있는 동안 Kyogen Ute 정제 키트의 PBI 또는 PB 버퍼 150 µL를 PCR 반응 튜브에 분주합니다. 이렇게 하면 폴리머라제를 불활성화하는 동시에, 온도가 충분히 높아 표적 프라이머의 비특이적 신장이 일어나지 않게 됩니다. 튜브를 닫고 짧게 볼텍싱한 후, 벤치탑 원심분리기로 액체를 가라앉힙니다.

Qiagen PM Buffer와 같은 다른 결합 버퍼는 후속 캡처 과정에 영향을 줄 수 있으므로, 이 단계에서는 PBI 또는 PB 버퍼만 사용하십시오. 다음으로, PCR 튜브에서 혼합물을 꺼내어 제조사 지침에 따라 Rogen MinLu 스핀 컬럼으로 옮겨 정제한 후, MinLu 키트에 포함된 EB 버퍼 30 µL를 사용하여 컬럼에서 DNA를 용출합니다. PEC 프라이머에 결합되지 않은 모든 단편을 제거하기 위해, 비드 기반의 캡처 단계를 수행합니다.

먼저, M 270 스트립형 분할 비드(strip divide beads) 스톡 솔루션을 볼텍싱하여 재현탁하고, 샘플당 25 µL에 해당하는 양의 비드를 취합니다. 비드를 500 µL의 2배 BW 버퍼로 두 번 세척하고, 처음에 취한 비드 부피와 동일한 양의 2배 BW로 재현탁합니다. 이 현탁액을 25 µL 준비합니다.

각 샘플당 정제된 용출 DNA 25 µL를 비드 현탁액 25 µL에 추가하고, 나중에 정량을 위해 나머지 5 µL는 남겨둡니다. 파이펫팅과 perpet 팁을 이용한 교반으로 DNA와 비드 현탁액을 혼합한 후, 벤치탑 로테이터에서 실온으로 15분 동안 천천히 회전시킵니다. 혼합이 완료되면 내용물을 새 1.5 mL PCR 튜브로 옮깁니다.

이전의 회전 배양 단계 동안 일부 비표적 DNA가 튜브 벽에 부착되었을 수 있습니다. 따라서 비드 현탁액을 새 튜브로 옮기면 이러한 비표적 DNA가 최종 생성물로 방출될 가능성을 방지할 수 있습니다. 열 용출 단계에서는 자기 입자 수집기를 사용하여 비드를 펠렛화하며, 10~20초 후 모든 비드가 벽면으로 이동하여 투명한 상층액이 남게 됩니다. 비드를 세척하기 위해 이 상층액을 제거하고, 1× BW buffer 500 µL를 튜브에 넣은 후 낮은 속도로 약 3초간 볼텍싱합니다.

튜브를 세운 상태에서 한 번, 그리고 뒤집은 상태에서 다시 한 번 확인하여 튜브 벽에 붙어 있는 비드가 없어야 합니다. 탁상 원심분리기를 사용하여 현탁액을 1~3초 동안 원심 분리하여, 튜브 벽의 모든 액체가 아래로 내려올 정도로만 처리합니다. 튜브를 MPC로 되돌린 후, 모든 비드가 튜브 측면으로 모일 때까지 10~20초 동안 기다립니다.

그런 다음 상층액을 제거합니다. 이로써 1차 세척이 완료되었습니다. 마지막 1회 BW 세척 및 상층액 제거 과정에 이어, 이 절차를 4회 더 반복하십시오.

1배수 hot wash 버퍼 500 µL를 첨가합니다. 이전과 같이 짧게 볼텍싱하고 원심분리하여 현탁액을 혼합한 다음, 서멀 블록 셰이커에서 1000 RPM으로 65 °C에서 2분 동안 튜브를 흔들어 줍니다. 서멀 블록에서 꺼낸 후 1분 이내에 짧게 원심분리하여 상층액의 잔여물을 제거합니다. 이 단계는 PEC 프라이머에 결합되어 있을 수 있지만 프라이머 연장 단계에서 연장되지 않은 단편들을 제거하는 과정입니다. 펠렛을 30 µL의 EB 버퍼에 재현탁하고 혼합액을 새로운 1.5 mL PCR 튜브로 옮깁니다.

튜브를 써멀 사이클러(thermal cycler)에서 95 °C로 3분 동안 배양합니다. 자기 입자 수집기를 사용하여 비드를 펠렛화합니다. 상층액이 완전히 투명해질 때까지 10~20초 정도 소요되며, 이후 S 상층액을 라벨이 부착된 새 튜브로 옮깁니다.

비드가 옮겨지지 않도록 주의하십시오. 캡처된 DNA 단편 생성물이 포함된 상층액을 보관합니다. 비드는 이 단계에서 폐기할 수 있습니다.

포획된 산물을 증폭하기 위해, 파트 2에서 수행한 것과 같이 총 부피 100 µL의 PCR 믹스를 준비하고 동일한 PCR 사이클 조건을 수행합니다. 다시, 포획된 산물의 PCR 증폭이 완료되면, 섹션 2에서 수행한 대로 Qiagen Ute 스핀 컬럼을 사용하여 정제를 진행하고, 50 µL의 Eeb Buffer로 컬럼에서 DNA를 용출합니다. 이제 해당 산물을 고처리량 시퀀싱(high throughput sequencing)에 사용할 수 있습니다. 당사는 네안데르탈인 미토콘드리아 게놈 전체를 타일링하기 위해 574개의 PEC 프라이머를 설계했습니다.

우리는 이를 4개의 멀티플렉스 믹스로 나누고, 유라시아 전역 4개 지역에서 발견된 40,000년에서 70,000년 전의 네안데르탈인 화석 5구로부터 얻은 라이브러리에 대해 2회의 연속적인 1차 연장 캡처(primary extension capture)를 수행하여, 개체당 170,000에서 500,000개의 서열을 생성하고 그 결과를 미토콘드리아 참조 서열에 정렬하였습니다. 분석 결과, PEC 절차가 미토콘드리아 DNA를 매우 효율적으로 농축시켰으며, 각 개체의 미토콘드리아 DNA 전체에 대해 평균 18배에서 56.3배의 커버리지로 완전한 커버리지를 달성했음을 확인하였습니다. 이러한 결과를 바탕으로 우리는 각 개체에 대한 고품질의 완전한 미토콘드리아 게놈 서열을 생성할 수 있었습니다.

그 후 우리는 이 서열들을 현대 인류의 전 세계 샘플 및 가장 가까운 생존 친척인 침팬지와 보노보와 계통학적으로 비교하였습니다. 이를 통해 네안데르탈인의 미토콘드리아 DNA가 현대 인류와 밀접하게 연관되어 있지만 분명히 구별된다는 이전의 연구 결과들을 확인하였습니다. 또한, 네안데르탈인 서열 간의 비교를 통해 네안데르탈인의 유전적 다양성이 매우 낮으며, 이는 오늘날 전 세계 인류의 다양성보다 낮고 현대 유럽인과 유사하다는 점이 밝혀졌습니다.

이러한 증거를 네안데르탈인 서열의 단백질 진화 분석과 결합하면, 네안데르탈인의 인구 규모가 장기간 낮게 유지되었음을 시사하며, 이는 네안데르탈인의 인구 밀도가 현대 인류가 달성한 수준에 결코 도달하지 못했다는 고고학적 증거와 일치합니다. 지금까지 저희는 고처리량 시퀀싱 준비를 위해 표적 서열을 증폭하고 캡처하는 영장류 확장 캡처(primate extension capture) 수행 방법을 보여드렸습니다. 이 절차를 따를 때는 서모사이클러의 모든 온도 사양을 준수하는 것이 중요하지만, 프라이머마다 어닐링 온도가 다를 수 있으므로 사용 중인 특정 프라이머에 맞게 어닐링 온도를 조정해야 할 수도 있다는 점에 유의하십시오. 또한, 모든 세척 단계에서 가능한 한 많은 액체를 제거하도록 주의하시기 바랍니다.

시청해 주셔서 감사합니다. 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.