Name: 프라이머 확장 캡처 : 경비 저하 DNA 소스에서 타겟 시퀀스 불러오기 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-03T11:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 28 s
Description: 배우세요 프라이머 확장 캡처(PECA) 기법으로 고대 DNA에서 타겟 시퀀스를 분리하는 방법을. 네안데르탈 미토콘드리아 게놈 복원에 활용되며, 저복사수 파편화 DNA에서 효율적인 서열 회복이 가능합니다.

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과학 예술 아카데미 크로아티아와 물류 및 과학 지원을 위해 과학 베를린 - 브란 덴 부르크 아카데미, 및 ​​재정적 지원에 대한 최대 플랑크 협회의 대통령 혁신 기금 우리는 조언 M. 마이어 감사합니다. JMG는 NSF 국제 박사 교제 (우아즈 - 0754461)에 의해 지원되었다. Neandertal 1 (Feldhofer 1) FM865407, Neandertal 2 (Feldhofer 2) FM865408, Sidron 1253 FM865409, Vindija 33.25 FM865410, Mezmaiskaya 1 FM865411 : 시퀀스는 가입 번호와 에비 뉴클레오 티드 데이터베이스에 쌓인 거죠

이 방법에 보고된 연구에 사용된 <a href="http://www.sciencemag.org/cgi/content/full/325/5938/318">브릭스 외., 과학 325 (5938)가. 318-321 (2009)</a> . 시약이 필요합니다 : <ul><li> AmpliTaq 골드의 DNA 중합 효소 </li><li> 10X GeneAmp PCR 버퍼 II </li><li> MgCl 2 25mM </li><li> dNTP 혼합물, 25 MM 각 </li><li> 물에 BSA, 10 MG ML - 1 </li><li> 분자 생물학 수준의 물 </li><li> EB 버퍼 (MinElute PCR의 정제 키트와 함께 제공된), 10 MM 트리스 HCL, pH를 8.5 </li><li> MinElute PCR의 정제 키트 </li><li> M - 270 streptavidin Dynabeads </li><li> 2X 바인딩 및 씻으 (BW) 버퍼 (2 M NaCl, 10 MM 트리스 - CL, 1 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 산도 8.0, 0.2 % 트윈 20) </li><li> 1X 바인딩 및 씻으 (BW) 버퍼 (2X BindWash 버퍼 물에 배 희석) </li><li> 핫 와시 (HW) 버퍼 (2.5mM MgCl, 1X DNA 형성 촉매 골드 버퍼, 0.1 % 트윈 20) </li></ul> 비표준 시약 및 장비에 대한 제조 업체 정보는 나중에 테이블을 참조하십시오. 1) 도서관 증폭 <ol><li> 여기서 DNA 템플릿은 낮은 사본 번호의 DNA로 설명 소스 (Rohland 및 Hofreiter, 2007a, 2007b)와 (Maricic 및 Pääbo 2009)에서 준비 454 라이브러리이다. 전체 라이브러리를 증폭하려면 다음 PCR 믹스를 준비 : <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> 시약 </td><td> 반응 당 μl </td></tr><tr><td> 물 </td><td> 45 </td></tr><tr><td> 10X 진 앰프 PCR 버퍼 II </td><td> 10 </td></tr><tr><td> MgCl 2 (25mM) </td><td> 10 </td></tr><tr><td> BSA (10 MG / ML) </td><td> 2 </td></tr><tr><td> dNTPs (25 MM 각) </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 454 emPCR fwd primer/10uM </td><td> 3 </td></tr><tr><td> 454 emPCR의 RVS의 primer/10uM </td><td> 3 </td></tr><tr><td> AmpliTaq 골드의 DNA 중합 효소 (5 U / μl) </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 454 DNA 라이브러리 템플릿 </td><td> 25 </td></tr><tr><td> 합계 </td><td> 100 </td></tr></tbody></table></li><li> 14주기의 증폭을위한 써모 자전거 타는 사람에 다음과 PCR 프로그램을 사용하여 <ol><li> 95 ° C 12min </li><li> 95 ° C 30 </li><li> 60 ° C (또는 원하는 어닐링 온도) 1 분 </li><li> 72 ° C 1 분 </li><li> 2 (X 13)로 이동 </li><li> 72 ° C 5 분 </li><li> 10 ° C ∞ </li></ol></li><li> 제조 업체의 지시에 따라 Qiagen MinElute의 스핀 컬럼을 통해 반응을 정화. 50 μl 버퍼 EB에 Elute. </li><li> 정화 증폭 제품뿐만 아니라 qPCR (메이어 외., 2007)와 unamplified 라이브러리의 나누어지는을 수량. 증폭 제품이 UL 당 이상의 1 X 10 12 사본이있는 경우가 아니라 2 개 이상 X 10 12 복사본 뇌관 확장 반응에 추가되는 것을 보장하기 위해 다음과 같은 프리머 확장 단계에서 템플릿의 양을 줄일 수 있습니다. </li></ol> 2) 프리머 확장 <ol><li> 반응의 필요한 번호에 대한 마스터 믹스를 준비합니다. <table border="0" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> 시약 </td><td> 반응 당 μl </td></tr><tr><td> 물 </td><td> 45 </td></tr><tr><td> 10X 진 앰프 PCR 버퍼 II </td><td> 10 </td></tr><tr><td> MgCl 2 (25mM) </td><td> 10 </td></tr><tr><td> BSA (10 MG / ML) </td><td> 2 </td></tr><tr><td> dNTPs (25 MM 각) </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 454 emPCR fwd primer/10uM </td><td> 3 </td></tr><tr><td> 454 emPCR의 RVS의 primer/10uM </td><td> 3 </td></tr><tr><td> AmpliTaq 골드의 DNA 중합 효소 (5 U / μl) </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 454 DNA 라이브러리 템플릿 </td><td> 25 </td></tr><tr><td> 합계 </td><td> 100 </td></tr></tbody></table></li><li> 단일 뇌관 확장 반응에 대한 Thermocycler에서 다음 프로그램을 실행 : <ol><li> 95 ° C 12min </li><li> 60 ° C (또는 다른 경우 PEC의 프라이머는 온도 어닐링) 1 분 </li><li> 72 ° C 5 분 </li><li> 72 ° C 영원히! 임계 단계 72에서 연장 후 반응을 유지 ° C. 열 블록 제거하기 전에 튜브에 QIAGEN MinElute 정화를위한 다음 직접 피펫 150ul PBI 또는 PB 버퍼. 이것은 어닐링이 아닌 구체적인 프라이머를 방지하고 혼합물은 냉각으로 캡처하는 것이 중요합니다. </li></ol></li><li> 제조 업체의 지시에 따라, Qiagen MinElute의 스핀 컬럼을 통해 반응을 정화. 50 μl EB에 Elute. </li></ol> 3) 확장 제품 캡처 <ol><li> vortexing하여 M - 270 구슬 Resuspend 주식 솔루션입니다. 샘플 당 25 μl 비드 정지를 가져가라. 샘플 당 25 μl 2xBW 버퍼에 500ul 배 BW 버퍼와 resuspend로 두 번 구슬을 씻으십시오. </li><li> 단계 3.1 25 μl 구슬 중지 단계 2.3 25 μl eluate를 추가합니다. 1 회전 후 믹스상온에서 5 분. 추천 : qPCR의 부량을위한 단계를 2.3에서 eluate 5 UL을 나머지 계속. </li><li> 신선한 1.5ml 튜브에 전체 혼합물을 전송합니다 (이 아닌 대상 라이브러리 조각 carryover을 줄이기 위해 도움). 펠렛 마그네틱 입자 수집기 (MPC)를 사용 뜨는 및 뜨는 폐기하십시오. </li><li> 500 μl 1xBW 버퍼 (많은 세척은 가능한 한 많은 배경으로 제거하는 데 도움이) 5 번 씻으십시오. 마지막 세척 단계 후, 잠시 스핀 다운 및 뜨는의 마지막 흔적을 제거합니다. </li><li> 500μl 1X 핫 와시 (HW) 버퍼를 추가합니다. 65 2 분 흔들 ° C (또는 PEC 뇌관 TM 위 5C) 열 블록에. 아래로 냉각 최소화하기 위해,이 후 신속하게 뜨는을 제거합니다. (이 단계는 아직 PEC primers 아니라 실제로 확장 단계 동안에 확장과 관련된 배경 조각을 제거하는 것입니다.) 뜨는의 마지막 흔적을 제거합니다. </li><li> 30 μl EB 버퍼에 비드 펠렛을 Resuspend. 신선한 1.5ml 튜브에 전체 혼합물을 전송합니다 (이 아닌 대상 라이브러리 조각 carryover을 줄이기 위해 도움). 용출을위한 열 자전거 타는 사람 3 분 95 ° C에서 알을 품다. MPC에서 개최하고 뒤에 구슬을 떠나 아끼 뜨는을 제거합니다. </li></ol> 4) 제품 증폭 캡처 <ol><li> 샘플 필요한 번호에 대한 PCR 마스터 믹스를 준비합니다. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> 시약 </td><td> 반응 당 μl </td></tr><tr><td> 물 </td><td> 45 </td></tr><tr><td> 10X 진 앰프 PCR 버퍼 II </td><td> 10 </td></tr><tr><td> MgCl 2 (25mM) </td><td> 10 </td></tr><tr><td> BSA (10 MG / ML) </td><td> 2 </td></tr><tr><td> dNTPs (25 MM 각) </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 454 emPCR fwd primer/10uM </td><td> 3 </td></tr><tr><td> 454 emPCR의 RVS의 primer/10uM </td><td> 3 </td></tr><tr><td> AmpliTaq 골드의 DNA 중합 효소 (5 U / μl) </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Eluted 캡처 제품 </td><td> 25 </td></tr><tr><td> 합계 </td><td> 100 </td></tr></tbody></table></li><li> 14주기의 증폭을위한 써모 자전거 타는 사람에 다음과 PCR 프로그램을 사용 : <ol><li> 95 ° C 12min </li><li> 95 ° C 30 </li><li> 60 ° C (또는 원하는 어닐링 온도) 1 분 </li><li> 72 ° C 1 분 </li><li> 2 (X 13)로 이동 </li><li> 72 ° C 5 분 </li><li> 10 ° C ∞ </li></ol></li><li> 제조 업체의 지시에 따라 Qiagen MinElute 실리카 스핀 컬럼을 통해 반응을 정화. 50 μl EB 버퍼에 Elute. 이 제품은 현재 2.1 단계에서 시작, 또는 시퀀싱을위한 454 유제 PCR 프로토콜에 직접 입력, 캡쳐의 두 번째 라운드 모두에 대해 사용할 수 있습니다. </li></ol> 대표 결과 : 권장 정상으로 혼합입니다 - &#39;긍정적인 제어 대상 시퀀스&#39;(1 picogram 쉽게 충분 예 ~ 100bp PCR 제품)의 소량 처음 캡처 반응을 수행할 수있는 PEC 프로토콜로 밖으로 시작할 때 그것은 강력하게 권장합니다 의 금액은 (단계 2.1 참조) 454 라이브러리 템플릿을 증폭하고, 캡처가 긍정적인 제어 제품을 캡처하기위한 하나의 PEC의 입문서로 수행됩니다. 모두 제어 특정 긍정적이고 454 어댑터 특정 프라이머 쌍이 제어 반응이 수행되는 경우, qPCR은 정화 뇌관 확장 반응 (1.3), 뇌관 확장 제품 (2.3의 배경 비해 &#39;관리 대상&#39;의 양을 계량하는 데 사용할 수 있습니다 )와 eluted 비드 캡처 제품 (3.6). 이러한 방법으로 귀하의 실험 조건에서 배경 제거 ( &quot;특이성&quot;) 및 대상 복구 ( &quot;감도&quot;)의 효율성의 두 효과를 직접 측정할 수 있습니다. 성공 PEC 프로토콜은 일반적으로 다음과 같은 속성을 가지고 - 감도 (프로토콜에 의해 유지 관리 대상의 금액으로 측정) : eluted 비드 캡처 제품 제어 대상의 총 금액 (3.6) = ~ 뇌관 확장 반응 (2.3) 정화 총 금액의 10~20%. 배경 (454 emPCR의 프라이머 쌍에 의해 측정) : eluted 비드 캡처 제품 (3.6)에서 배경 총 금액 &lt;정화 뇌관 확장 반응 (2.3)에서 총 금액의 0.01 %. 최종 제품에 남아있는 대상의 1 % 미만이있다면, 뇌관 확장 단계가 실패되었을 수 있으며, 조사해야합니다. 최종 제품에 남아있는 배경의 0.01 %보다 훨씬 더있다면, 세탁 단계는 잘못 수행되었을 수 있으며, 조사해야합니다.

<ol><li>Briggs, A. W., Good, J. M., Green, R. E., Krause, J., Maricic, T., Stenzel, U., Lalueza-Fox, C., Rudan, P., Brajkovic, D., Kucan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+retrieval+and+analysis+of+five+Neandertal+mtDNA+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Targeted retrieval and analysis of five Neandertal mtDNA genomes.</a> Science. 325 (5938), 318-321 (2009).</li>
<li>Rohland, N., Hofreiter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+and+optimization+of+ancient+DNA+extraction%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Comparison and optimization of ancient DNA extraction.</a> Biotechniques. 42 (3), 343-352 (2007).</li>
<li>Rohland, N., Hofreiter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ancient+DNA+extraction+from+bones+and+teeth%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Ancient DNA extraction from bones and teeth.</a> Nat Protoc. 2 (7), 1756-1762 (2007).</li>
<li>Maricic, T., Pääbo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+454+sequencing+library+preparation+from+small+amounts+of+DNA+permits+sequence+determination+of+both+DNA+strands%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Optimization of 454 sequencing library preparation from small amounts of DNA permits sequence determination of both DNA strands.</a> Biotechniques. 46 (1), 51-57 (2009).</li>
<li>Meyer, M., AW, B. riggs, Maricic, T., Hober, B., Hoffner, B., Krause, J., Weihmann, A., Paabo, S., Hofreiter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+micrograms+to+picograms%3A+quantitative+PCR+reduces+the+material+demands+of+high-throughput+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">From micrograms to picograms: quantitative PCR reduces the material demands of high-throughput sequencing.</a> Nucleic Acids Res. 36 (1), e5-e5 (2007).</li>
</ol>

저자들은 공개할 이해관계가 없습니다.

PEC 방법은 간단하고 빠르고, 민감하고 구체적인 것입니다. 따라서 이러한 RNA 라이브러리의 작은 RNA 조각의 캡쳐, 풀링 샘플 또는 metagenomic 샘플에서 16 (또는 다른 loci) 다양성을 캡처에 구조적 변화의 심문으로 고대 DNA 이외 우리는 저자의 관찰하다 여러 응용 프로그램. 언급 한 지점은 캡처의 감도가 다중 캡처 반응 증가 PEC primers의 번호로 낮은 될 것입니다. PEC 따라서 이상 (예 : megabase 이상) 매우 큰 캡쳐 영역의 포착에 적합 아니지만 아주 잘 신속한 방식으로 많은 사람의 작은 대상 지역 또는 SNP 위치의 포착에 적합합니다.

<table><tbody><tr><td>GeneAmp PCR buffer II 및 MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;를 포함한 AmpliTaq Gold polymerase</td><td>Applied Biosystems</td><td>N8080241</td><td></td></tr><tr><td>QIAGEN MinElute PCR purification kit</td><td>Qiagen</td><td>28004</td><td></td></tr><tr><td>M-270 streptavidin beads</td><td>Invitrogen</td><td>653.05</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2287</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-2 magnetic particle separator</td><td>Invitrogen</td><td>120.02D</td><td></td></tr></tbody></table>

프라이머 확장 캡처 : 경비 저하 dna 소스에서 타겟 시퀀스 불러오기

Primer Extension Capture: Targeted Sequence Retrieval from Heavily Degraded DNA Sources

고대 유골의 전형이므로 우리는 크게 저하 및 미생물의 DNA로 오염되어 DNA 소스로부터 타겟 DNA 시퀀스 검색하는 방법을 제시. 방법은 크게 샘플 파괴 및 PCR이나 샷건 배열 접근 방식을 직접 상대 시퀀싱 요구 사항을 줄일 수 있습니다. 우리가 그들의 지리적인 범위에 걸쳐을 다섯 Neandertals의 전체 mitochondrial DNA (mtDNA) genomes를 재구성하기 위해이 메서드를 사용합니다. 후반 Neandertals의 mtDNA 유전 다양성은 현대 현대 인간의 그것보다 약 세 배 낮은되었다. 함께 mtDNA 단백질 진화의 분석과 함께, 이러한 데이터는 Neandertals의 장기적 효과적인 인구의 크기는 현대 인간과 무언가 큰 원숭이의보다 작은 것을 권장합니다.

우리는 우리가 5 Neandertal 개인의 전체 mitochondrial genomes을 재구성하는 데 사용되는 타겟으로 고대 DNA 시퀀스 검색의 방법을 제시한다. 현재 일 인간과 함께 이러한 시퀀스 비교 Neandertals가 장기 낮은 효과적인 인구의 크기 있다고 제안합니다.

프라이머 확장 캡처 : 경비 저하 DNA 소스에서 타겟 시퀀스 불러오기

우리는 ...에서 전형적으로 나타나는 것과 같이, 심하게 분해되고 미생물 DNA로 오염된 DNA 시료로부터 표적 DNA 서열을 회수하는 방법을 제시합니다.

이 영상에서는 매우 낮은 복제수(copy number)의 고도로 단편화된 DNA 소스로부터 표적 DNA 서열을 회수할 수 있는 프라이머 연장 캡처(primer extension capture, PECA) 기술에 대해 설명합니다. 본 연구진은 이 기술을 사용하여 40,000년 이상 된 네안데르탈인 뼈에서 완전한 미토콘드리아 게놈을 시퀀싱했으며, 이 방법은 여러 개체로부터 임의의 작은 표적 영역이나 단일 염기 다형성(single nucleotide polymorphisms)을 캡처하는 데 사용될 수 있습니다. 이 절차의 주요 단계는 1차 DNA 라이브러리의 PCR 증폭, quantitative PCR을 통한 증폭 라이브러리의 정량 분석, 증폭 라이브러리에 대한 1차 연장(primary extension)의 표적화, 비표적 단편을 제거하기 위한 1차 연장 산물의 비드 캡처, 그리고 캡처 및 세척된 표적의 용출 및 시퀀싱입니다.안녕하세요, 라이프치히 막스 플랑크 진화인류학 연구소 유전학과의 Shanti Payable 연구실 소속 Adrian Briggs입니다. 오늘은 고대 뼈와 같이 복잡하고 심하게 분해된 DNA 소스로부터 관심 있는 특정 DNA 서열을 분리하는 절차를 보여드리겠습니다. 저희는 이 절차를 통해 Homo neanderthalensis, 즉 네안데르탈인의 미토콘드리아 유전적 다양성을 연구해 왔습니다.시작해 보겠습니다. 본 실험에 사용된 DNA는 네안데르탈인의 지리적 분포 전역의 여러 유적지에서 발견된 40,000년에서 70,000년 전의 네안데르탈인 뼈에서 추출한 것입니다. 먼저 뼈를 하룻밤 동안 UV 광선에 노출시켜 표면의 외부 DNA를 제거합니다.미세 드릴을 사용하여 100에서 500 mg의 뼈 가루를 생성합니다. 뼈 가루로부터의 DNA 추출은 Nadine Rockland와 Michael Hof가 작성한 2007년 논문 'comparison and optimization of ancient DNA extraction'에 기술된 절차를 사용하여 수행합니다. 그 다음, 모든 DNA 단편의 끝에 유니버설 어댑터 프라이밍 사이트를 추가하여 DNA 추출물을 시퀀싱 라이브러리로 변환합니다. 이는 네안데르탈인 뼈에서 생성된 4 5 4 라이브러리가 때로는 단 몇 pg에 불과한 매우 적은 양의 DNA만을 포함하고 있기 때문입니다. 이 1차 DNA 라이브러리는 먼저 유니버설 라이브러리 프라이머에 대응하는 에멀전 PCR 프라이머를 이용한 PCR로 증폭됩니다.라이브러리 증폭을 위한 PCR 믹스를 준비하려면, PCR 튜브에 다음 시약들을 혼합하십시오. 10 X GAMP PCR 버퍼 10 µL, 염화마그네슘(magnesium chloride) 10 µL 2개, BSA 2 µL, dNTP 믹스 1 µL, 4 54 MPCR 정방향 및 역방향 프라이머 각각 3 µL, amply gold DNA polymerase 1 µL, 라이브러리 템플릿 25 µL를 넣습니다. 마지막으로, PCR 등급의 증류수 45 µL를 추가하여 총 부피를 100 µL로 맞춥니다. amply Tech gold DNA polymerase는 상온에서 안정적이므로, 얼음 위에서 작업할 필요는 없습니다.PCR 반응액을 준비한 후, PCR 튜브를 서모사이클러(thermocycler)에 넣고 95 °C에서 12분간의 변성 단계로 시작합니다. 이어서 95 °C에서 30초, 60 °C에서 1분, 72 °C에서 1분으로 구성된 사이클을 14회 반복합니다. 이 14회 사이클이 끝나면 72 °C에서 5분간 최종 단계를 설정하며, 이후 PCR 증폭이 완료되어 사용할 때까지 PCR 튜브를 10 °C에서 무기한 보관할 수 있습니다. 다음으로 제조업체의 지침에 따라 Kyogen MinLu 스핀 컬럼을 사용하여 PCR 생성물을 정제하고, 1차 확장 및 생성물 캡처 전에 MinLu 키트에 제공된 50 µL의 EB 버퍼로 컬럼에서 DNA를 용출합니다.증폭된 라이브러리 산물의 양을 정량하고 품질을 확인하기 위해, 증폭 전후 라이브러리 분주액에 대해 정량 PCR(Quantitative PCR)을 수행해야 합니다. 14 사이클 동안 증폭된 라이브러리는 1차 라이브러리보다 DNA 양이 수천 배 더 많아야 합니다. 그렇지 않은 경우, 증폭 조건을 점검하고 다시 수행해야 합니다.증폭된 라이브러리에서 관심 서열을 캡처하는 데 사용될 1차 연장 캡처 프라이머는 일반적인 PCR 프라이머와 같이 설계하여, 각 표적 서열의 5' 말단에 있는 12 base 꼬리 서열과 일치하도록 하며, 이상적인 어닐링 온도는 60 °C가 되도록 설정하고 5' 말단에 비오틴 잔기를 포함해야 합니다. 200 µM 스톡으로 제조된 단일 멀티플렉스 믹스에 최대 150개의 PEC 프라이머를 함께 사용할 수 있습니다. 1차 연장 반응을 위해, 적절한 PCR 튜브에 10 X GAMP PCR 버퍼 5 µL, 염화마그네슘 2.5 µL, BSA 1 µL, dNTP 0.5 µL를 넣어 PCR 믹스를 준비합니다. 여기에 1차 연장 캡처 프라이머 믹스 5 µL, Taq gold DNA 중합효소 0.5 µL, 14 사이클 증폭된 라이브러리 DNA 2 µL를 혼합하고, 마지막으로 PCR 등급의 증류수 31 µL를 추가하여 총 부피를 50 µL로 맞춥니다.증폭된 라이브러리 템플릿의 농도가 µL당 1×10¹² copies를 초과하는 경우, 반응 혼합물에 2×10¹² copies 이하로 첨가되도록 EB buffer로 먼저 희석해야 합니다. PCR 튜브를 준비한 후 써모사이클러(thermocycler)에 넣고 단일 반응 실행으로 설정하십시오. 95 °C에서 12분간 변성(denaturation)시키는 것으로 시작하여, 60 °C에서 1분, 이어서 1차 신장(primary extension)을 위해 72 °C에서 5분간 유지합니다.단일 사이클이 완료되면, 다음 단계까지 PCR 생성물을 유지하기 위해 72 °C로 유지합니다. 비특이적 프라이머 결합을 방지하고 직접 캡처하기 위해, 반응 혼합물이 72 °C로 유지되는 서모사이클러 내에 있는 동안 Kyogen Ute 정제 키트의 PBI 또는 PB 버퍼 150 µL를 PCR 반응 튜브에 분주합니다. 이렇게 하면 폴리머라제를 불활성화하는 동시에, 온도가 충분히 높아 표적 프라이머의 비특이적 신장이 일어나지 않게 됩니다. 튜브를 닫고 짧게 볼텍싱한 후, 벤치탑 원심분리기로 액체를 가라앉힙니다.Qiagen PM Buffer와 같은 다른 결합 버퍼는 후속 캡처 과정에 영향을 줄 수 있으므로, 이 단계에서는 PBI 또는 PB 버퍼만 사용하십시오. 다음으로, PCR 튜브에서 혼합물을 꺼내어 제조사 지침에 따라 Rogen MinLu 스핀 컬럼으로 옮겨 정제한 후, MinLu 키트에 포함된 EB 버퍼 30 µL를 사용하여 컬럼에서 DNA를 용출합니다. PEC 프라이머에 결합되지 않은 모든 단편을 제거하기 위해, 비드 기반의 캡처 단계를 수행합니다.먼저, M 270 스트립형 분할 비드(strip divide beads) 스톡 솔루션을 볼텍싱하여 재현탁하고, 샘플당 25 µL에 해당하는 양의 비드를 취합니다. 비드를 500 µL의 2배 BW 버퍼로 두 번 세척하고, 처음에 취한 비드 부피와 동일한 양의 2배 BW로 재현탁합니다. 이 현탁액을 25 µL 준비합니다.각 샘플당 정제된 용출 DNA 25 µL를 비드 현탁액 25 µL에 추가하고, 나중에 정량을 위해 나머지 5 µL는 남겨둡니다. 파이펫팅과 perpet 팁을 이용한 교반으로 DNA와 비드 현탁액을 혼합한 후, 벤치탑 로테이터에서 실온으로 15분 동안 천천히 회전시킵니다. 혼합이 완료되면 내용물을 새 1.5 mL PCR 튜브로 옮깁니다.이전의 회전 배양 단계 동안 일부 비표적 DNA가 튜브 벽에 부착되었을 수 있습니다. 따라서 비드 현탁액을 새 튜브로 옮기면 이러한 비표적 DNA가 최종 생성물로 방출될 가능성을 방지할 수 있습니다. 열 용출 단계에서는 자기 입자 수집기를 사용하여 비드를 펠렛화하며, 10~20초 후 모든 비드가 벽면으로 이동하여 투명한 상층액이 남게 됩니다. 비드를 세척하기 위해 이 상층액을 제거하고, 1× BW buffer 500 µL를 튜브에 넣은 후 낮은 속도로 약 3초간 볼텍싱합니다.튜브를 세운 상태에서 한 번, 그리고 뒤집은 상태에서 다시 한 번 확인하여 튜브 벽에 붙어 있는 비드가 없어야 합니다. 탁상 원심분리기를 사용하여 현탁액을 1~3초 동안 원심 분리하여, 튜브 벽의 모든 액체가 아래로 내려올 정도로만 처리합니다. 튜브를 MPC로 되돌린 후, 모든 비드가 튜브 측면으로 모일 때까지 10~20초 동안 기다립니다.그런 다음 상층액을 제거합니다. 이로써 1차 세척이 완료되었습니다. 마지막 1회 BW 세척 및 상층액 제거 과정에 이어, 이 절차를 4회 더 반복하십시오.1배수 hot wash 버퍼 500 µL를 첨가합니다. 이전과 같이 짧게 볼텍싱하고 원심분리하여 현탁액을 혼합한 다음, 서멀 블록 셰이커에서 1000 RPM으로 65 °C에서 2분 동안 튜브를 흔들어 줍니다. 서멀 블록에서 꺼낸 후 1분 이내에 짧게 원심분리하여 상층액의 잔여물을 제거합니다. 이 단계는 PEC 프라이머에 결합되어 있을 수 있지만 프라이머 연장 단계에서 연장되지 않은 단편들을 제거하는 과정입니다. 펠렛을 30 µL의 EB 버퍼에 재현탁하고 혼합액을 새로운 1.5 mL PCR 튜브로 옮깁니다.튜브를 써멀 사이클러(thermal cycler)에서 95 °C로 3분 동안 배양합니다. 자기 입자 수집기를 사용하여 비드를 펠렛화합니다. 상층액이 완전히 투명해질 때까지 10~20초 정도 소요되며, 이후 S 상층액을 라벨이 부착된 새 튜브로 옮깁니다.비드가 옮겨지지 않도록 주의하십시오. 캡처된 DNA 단편 생성물이 포함된 상층액을 보관합니다. 비드는 이 단계에서 폐기할 수 있습니다.포획된 산물을 증폭하기 위해, 파트 2에서 수행한 것과 같이 총 부피 100 µL의 PCR 믹스를 준비하고 동일한 PCR 사이클 조건을 수행합니다. 다시, 포획된 산물의 PCR 증폭이 완료되면, 섹션 2에서 수행한 대로 Qiagen Ute 스핀 컬럼을 사용하여 정제를 진행하고, 50 µL의 Eeb Buffer로 컬럼에서 DNA를 용출합니다. 이제 해당 산물을 고처리량 시퀀싱(high throughput sequencing)에 사용할 수 있습니다. 당사는 네안데르탈인 미토콘드리아 게놈 전체를 타일링하기 위해 574개의 PEC 프라이머를 설계했습니다.우리는 이를 4개의 멀티플렉스 믹스로 나누고, 유라시아 전역 4개 지역에서 발견된 40,000년에서 70,000년 전의 네안데르탈인 화석 5구로부터 얻은 라이브러리에 대해 2회의 연속적인 1차 연장 캡처(primary extension capture)를 수행하여, 개체당 170,000에서 500,000개의 서열을 생성하고 그 결과를 미토콘드리아 참조 서열에 정렬하였습니다. 분석 결과, PEC 절차가 미토콘드리아 DNA를 매우 효율적으로 농축시켰으며, 각 개체의 미토콘드리아 DNA 전체에 대해 평균 18배에서 56.3배의 커버리지로 완전한 커버리지를 달성했음을 확인하였습니다. 이러한 결과를 바탕으로 우리는 각 개체에 대한 고품질의 완전한 미토콘드리아 게놈 서열을 생성할 수 있었습니다.그 후 우리는 이 서열들을 현대 인류의 전 세계 샘플 및 가장 가까운 생존 친척인 침팬지와 보노보와 계통학적으로 비교하였습니다. 이를 통해 네안데르탈인의 미토콘드리아 DNA가 현대 인류와 밀접하게 연관되어 있지만 분명히 구별된다는 이전의 연구 결과들을 확인하였습니다. 또한, 네안데르탈인 서열 간의 비교를 통해 네안데르탈인의 유전적 다양성이 매우 낮으며, 이는 오늘날 전 세계 인류의 다양성보다 낮고 현대 유럽인과 유사하다는 점이 밝혀졌습니다.이러한 증거를 네안데르탈인 서열의 단백질 진화 분석과 결합하면, 네안데르탈인의 인구 규모가 장기간 낮게 유지되었음을 시사하며, 이는 네안데르탈인의 인구 밀도가 현대 인류가 달성한 수준에 결코 도달하지 못했다는 고고학적 증거와 일치합니다. 지금까지 저희는 고처리량 시퀀싱 준비를 위해 표적 서열을 증폭하고 캡처하는 영장류 확장 캡처(primate extension capture) 수행 방법을 보여드렸습니다. 이 절차를 따를 때는 서모사이클러의 모든 온도 사양을 준수하는 것이 중요하지만, 프라이머마다 어닐링 온도가 다를 수 있으므로 사용 중인 특정 프라이머에 맞게 어닐링 온도를 조정해야 할 수도 있다는 점에 유의하십시오. 또한, 모든 세척 단계에서 가능한 한 많은 액체를 제거하도록 주의하시기 바랍니다.시청해 주셔서 감사합니다. 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

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