프라이머 확장 캡처 : 경비 저하 DNA 소스에서 타겟 시퀀스 불러오기

본 영상에서는 극소량의 고도로 단편화된 DNA 소스로부터 특정 DNA 서열을 표적하여 회수할 수 있는 프라이머 연장 캡처(primer extension capture, PECA) 기술에 대해 설명합니다. 본 연구진은 이 기술을 사용하여 40,000년 이상 된 네안데르탈인 뼈에서 완전한 미토콘드리아 게놈을 시퀀싱했으며, 이 방법은 다수의 개체로부터 임의의 작은 표적 영역이나 단일 염기 다형성(single nucleotide polymorphisms)을 캡처하는 데 사용될 수 있습니다. 이 절차의 주요 단계는 일차 DNA 라이브러리의 PCR 증폭, 정량 PCR을 이용한 증폭 라이브러리의 정량화, 증폭된 라이브러리의 표적 일차 연장, 비표적 단편을 제거하기 위한 일차 연장 생성물의 비드 캡처, 그리고 캡처 및 세척된 표적의 용출 및 시퀀싱입니다.

안녕하세요, 라이프치히에 있는 막스 플랑크 진화 인류학 연구소 유전학과의 Shanti Payable 연구실 소속 Adrian Briggs입니다. 오늘은 고대 뼈와 같이 복잡하고 심하게 분해된 DNA 시료로부터 관심 있는 특정 DNA 서열을 분리하는 절차를 보여드리겠습니다. 저희는 이 절차를 이용하여 호모 네안데르탈렌시스(Homo neanderthalensis), 즉 네안데르탈인의 미토콘드리아 유전적 다양성을 연구했습니다.

이제 시작해 보겠습니다. 본 실험에 사용된 DNA는 네안데르탈인의 지리적 분포 범위 전역의 4개 유적지에서 발견된 40,000년에서 70,000년 된 네안데르탈인 뼈에서 추출한 것입니다. 먼저 뼈를 밤새 UV 광선에 노출시켜 표면의 외부 DNA를 제거합니다.

미세 드릴을 사용하여 100에서 500 mg의 골분말을 생성합니다. 골분말로부터의 DNA 추출은 Nadine Rockland와 Michael Hof가 작성한 2007년 논문 'comparison and optimization of ancient DNA extraction'에 기술된 절차를 사용하여 수행합니다. 그 후, 모든 DNA 단편의 끝에 유니버설 어댑터 프라이밍 사이트를 추가하여 DNA 추출물을 시퀀싱 라이브러리로 변환합니다. 이는 네안데르탈인 뼈에서 생성된 4 5 4 라이브러리가 때로는 단 몇 pg에 불과한 아주 적은 양의 DNA만을 포함하고 있기 때문입니다. 이 1차 DNA 라이브러리는 먼저 유니버설 라이브러리 프라이머에 대응하는 에멀젼 PCR 프라이머를 이용한 PCR로 증폭됩니다.

라이브러리 증폭을 위한 PCR 믹스를 준비하려면, PCR 튜브에 다음 시약들을 혼합하십시오. 10 X GAMP PCR 버퍼 10 µL, 염화마그네슘 10 µL, BSA 2 µL, dNTP 믹스 1 µL, 4 54 MPCR 정방향 및 역방향 프라이머 각각 3 µL, AmpliGold DNA polymerase 1 µL, 라이브러리 템플릿 25 µL를 넣습니다. 마지막으로, PCR 등급의 멸균수를 45 µL 추가하여 최종 부피를 100 µL로 맞춥니다. AmpliTech Gold DNA polymerase는 상온에서 안정적이므로 아이스 위에서 작업할 필요는 없습니다.

PCR 반응액을 준비한 후, PCR 튜브를 써모사이클러에 넣고 95 °C에서 12분간 변성 단계를 거친 다음, 95 °C에서 30초, 60 °C에서 1분, 72 °C에서 1분으로 구성된 사이클을 14회 반복합니다. 14회 사이클이 끝나면 72 °C에서 5분간 최종 단계를 수행하며, PCR 증폭이 완료된 후 사용 전까지 PCR 튜브를 10 °C에서 무기한 보관할 수 있습니다. 이어서 제조사의 지침에 따라 Kyogen MinLu 스핀 컬럼을 사용하여 PCR 생성물을 정제하고, 1차 신장 및 생성물 캡처 전에 MinLu 키트에 제공된 EB 버퍼 50 µL로 컬럼에서 DNA를 용출합니다.

증폭된 라이브러리 생성물의 양을 정량화하고 품질을 확인하기 위해, 증폭 전과 후의 라이브러리 분주액에 대해 정량 PCR을 수행해야 합니다. 14 사이클 동안 증폭된 라이브러리는 기본 라이브러리보다 수천 배 더 많은 DNA를 함유해야 합니다. 그렇지 않은 경우, 증폭 조건을 확인하고 다시 수행해야 합니다.

증폭된 라이브러리에서 관심 서열을 캡처하는 데 사용될 1차 신장 캡처 프라이머는 일반적인 PCR 프라이머와 동일하게 설계하여, 60 °C의 이상적인 융해 온도(melting temperature)로 각 표적 서열의 5' 말단에 있는 12bp 꼬리 서열의 표적 영역과 일치하도록 하며, 5' 말단에 biotin 잔기를 포함해야 합니다. 200 µM 스톡으로 제조된 단일 멀티플렉스 믹스에 최대 150개의 PEC 프라이머를 함께 사용할 수 있습니다. 1차 신장 반응을 위해, 적절한 PCR 튜브에 10 X GAMP PCR 버퍼 5 µL, magnesium chloride 2.5 µL, BSA 1 µL, DNTP 0.5 µL를 첨가하여 PCR 믹스를 준비합니다. 여기에 1차 신장 캡처 프라이머 믹스 5 µL, Taq gold DNA polymerase 0.5 µL, 14 사이클 증폭된 라이브러리 DNA 2 µL, 그리고 마지막으로 PCR grade water 31 µL를 섞어 최종 부피를 50 µL로 맞춥니다.

증폭된 라이브러리 템플릿의 농도가 microliter당 1 × 10¹² copies를 초과하는 경우, 반응 혼합물에 2 × 10¹² copies 이하가 첨가되도록 먼저 EB buffer로 템플릿을 희석해야 합니다. PCR 튜브를 준비한 후 서모사이클러(thermocycler)에 넣고 단일 반응 실행으로 설정합니다. 95 °C에서 12분간 변성(denaturation)시킨 후, 60 °C에서 1분, 이어서 1차 신장(primary extension)을 위해 72 °C에서 5분간 처리합니다.

단일 사이클이 완료되면, 다음 단계까지 PCR 산물을 유지하기 위해 72 °C로 설정합니다. 비특이적인 프라이머 결합을 방지하고 직접 캡처하기 위해, 반응 혼합물이 72 °C로 유지되고 있는 써모사이클러 내의 PCR 반응 튜브에 Kyogen DNA purification kit의 PBI 또는 PB 버퍼 150 µL를 분주합니다. 이렇게 하면 폴리머라아제가 불활성화되는 동시에 온도가 너무 높아 타겟 프라이머의 비특이적 신장이 일어나지 않게 됩니다. 튜브 뚜껑을 닫고 짧게 볼텍싱한 다음, 벤치탑 원심분리기로 액체를 가라앉힙니다.

Qiagen PM 버퍼와 같은 다른 결합 버퍼는 후속 캡처 과정에 간섭을 일으킬 수 있으므로, 이 단계에서는 PBI 또는 PB 버퍼만 사용하십시오. 다음으로, PCR 튜브에서 혼합물을 제거하고 제조사의 지침에 따라 Rogen MinLu 스핀 컬럼으로 옮겨 정제한 후, MinLu 키트에 제공된 30 µL의 EB 버퍼로 컬럼에서 DNA를 용출합니다. PEC 프라이머에 어닐링되지 않은 모든 단편을 제거하기 위해 비드 기반 캡처 단계를 수행합니다.

먼저, M 270 strip beads 스톡 용액을 볼텍싱하여 재현탁한 후, 샘플당 25 µL에 해당하는 양의 비즈를 취합니다. 2x BW 버퍼 500 µL로 비즈를 2회 세척하고, 처음 취한 비즈 부피와 동일한 부피의 2x BW 버퍼로 재현탁합니다. 이 현탁액 25 µL를 준비합니다.

각 샘플에 대해 정제되어 용출된 DNA 25 µL를 비드 현탁액 25 µL에 첨가하고, 나중에 정량 분석에 사용할 나머지 5 µL는 남겨둡니다. 피펫팅과 퍼펫 팁(perpet tip)을 이용한 교반으로 DNA와 비드 현탁액을 혼합한 다음, 벤치탑 로테이터(benchtop rotator)에서 실온으로 15분 동안 천천히 회전시킵니다. 혼합 후, 내용물을 새로운 1.5 mL PCR 튜브로 옮깁니다.

이전의 회전 배양 단계 동안 일부 비표적 DNA가 튜브 벽에 붙었을 수 있습니다. 따라서 비드 현탁액을 새 튜브로 옮기면 이러한 비표적 DNA가 최종 산물로 방출될 가능성을 방지할 수 있습니다. 열 용출 단계 중에 자성 입자 수집기를 사용하여 비드를 펠렛화하면, 10~20초 후에 모든 비드가 벽면으로 이동하여 투명한 상층액이 남게 되는데, 이를 제거하여 비드를 세척해야 합니다. 튜브에 1× BW buffer 500 µL를 첨가하고 낮은 속도로 약 3초 동안 볼텍싱합니다.

튜브를 똑바로 세웠을 때와 뒤집었을 때 모두 튜브 벽에 비드가 붙어 있지 않아야 합니다. 탁상 원심분리기를 사용하여 모든 액체가 튜브 벽에서 내려올 정도로만 1~3초 동안 현탁액을 원심분리합니다. 튜브를 MPC로 다시 옮기고 모든 비드가 튜브 측면에 모일 때까지 10~20초 동안 기다립니다.

그다음 SUP 상층액을 제거합니다. 이로써 1차 세척이 완료되었습니다. 마지막 1회 BW 세척 및 상층액 제거 단계에 이어, 이 과정을 4회 더 반복하십시오.

1배 농도의 hot wash buffer 500 µL를 추가합니다. 이전과 같이 짧게 vortexing하고 spinning down하여 현탁액을 혼합한 다음, thermal block shaker에서 1000 RPM으로 65 °C에서 2분 동안 튜브를 흔들어 줍니다. thermal block에서 꺼낸 후 1분 이내에 짧게 spin하여 상층액의 흔적을 제거합니다. 이 단계는 PEC 프라이머에 결합했을 수 있으나 프라이머 연장 단계에서 연장되지 않은 단편들을 제거하기 위한 것입니다. 펠렛을 30 µL의 EB buffer에 다시 현탁하고 혼합물을 새로운 1.5 mL PCR 튜브로 옮깁니다.

튜브를 서멀 사이클러에서 95 °C로 3분간 배양합니다. 자기 입자 수집기를 사용하여 비드를 펠렛화합니다. 상층액이 완전히 투명해질 때까지 10~20초 정도 소요되며, S 상층액을 제거하여 라벨이 부착된 새 튜브로 옮깁니다.

비즈가 옮겨지지 않도록 주의하십시오. 포집된 DNA 단편 생성물이 포함된 상층액만 보관하십시오. 비즈는 이 단계에서 폐기해도 됩니다.

포획된 산물을 증폭하려면, 파트 2에서와 같이 총 부피 100 µL의 PCR 믹스를 준비하고 동일한 PCR 사이클 조건을 수행합니다. 다시 한번, 포획된 산물의 PCR 증폭이 완료되면, 섹션 2에서 수행한 것과 같이 Qiagen Ute 스핀 컬럼을 사용하여 정제를 진행합니다. 50 µL의 Eeb Buffer로 컬럼에서 DNA를 용출하면, 해당 산물을 고처리량 시퀀싱에 사용할 준비가 완료됩니다. 당사는 네안데르탈인 미토콘드리아 게놈 전체를 타일링하기 위해 574개의 PEC 프라이머를 설계했습니다.

우리는 이를 4개의 멀티플렉스 믹스로 나누고, 유라시아 전역 4개 지역에서 발견된 40,000년에서 70,000년 전의 네안데르탈인 화석 5구의 라이브러리를 대상으로 1차 연장 캡처를 두 번의 연속 라운드로 수행하여, 개체당 170,000에서 500,000개의 서열을 생성한 후 그 결과를 미토콘드리아 참조 서열에 정렬했습니다. 분석 결과, PEC 절차를 통해 미토콘드리아 DNA가 대폭 농축되었으며, 각 개체의 미토콘드리아 DNA 전 영역에 대해 평균 18배에서 56.3배의 커버리지를 달성하여 완전한 커버리지를 확보했음을 확인했습니다. 이러한 결과를 바탕으로 각 개체에 대해 고품질의 완전한 미토콘드리아 게놈 서열을 생성할 수 있었습니다.

그런 다음 우리는 이 서열들을 현재 전 세계 인류의 샘플 및 우리의 가장 가까운 현존 친척인 침팬지와 보노보와 계통학적으로 비교하였습니다. 이를 통해 네안데르탈인의 미토콘드리아 DNA가 현대 인류의 것과 밀접하게 연관되어 있지만 분명히 구별된다는 이전의 연구 결과들이 확인되었습니다. 또한, 네안데르탈인 서열들 자체를 비교한 결과, 네안데르탈인의 유전적 다양성은 오늘날 전 세계 인류보다 낮으며 현대 유럽인들과 유사할 정도로 매우 낮다는 것이 밝혀졌습니다.

이러한 증거를 네안데르탈인 서열의 단백질 진화 분석과 결합하여 살펴보면, 네안데르탈인의 인구 규모가 장기간 소수로 유지되었음을 시사하며, 이는 네안데르탈인의 인구 밀도가 현대 인류가 달성한 수준에 결코 도달하지 못했다는 고고학적 증거와 일치합니다. 지금까지 고처리량 시퀀싱 준비를 위해 표적 서열을 증폭하고 포획하는 프라이메이트 확장 캡처(primate extension capture) 수행 방법을 살펴보았습니다. 이 절차를 수행할 때는 써모사이클러의 모든 온도 규격을 준수하는 것이 중요하지만, 프라이머마다 어닐링 온도가 다를 수 있으므로 사용하는 특정 프라이머에 맞게 어닐링 온도를 조정해야 할 수도 있으며, 모든 세척 단계에서 가능한 한 많은 액체를 제거하도록 주의하십시오.

시청해 주셔서 감사드리며, 여러분의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.