조직 공학을위한 3D Hydrogels에서 셀룰러 봉지

세포 캡슐화를 위한 단계별 과정은 하이드로젤 몰드 및 기타 재료의 준비와 멸균으로 시작하며, 이어서 세포를 각 젤 세트용 튜브에 개별 집단으로 분리합니다. 그 후 세포가 존재하는 상태에서 젤화(gelation)를 수행하고, 이어서 인비트로(in vitro) 또는 인비보(in vivo) 배양 기간을 거칩니다. 세포 거동에 대한 하위 분석에는 생존력, 형태, 증식 및 분화 테스트가 포함될 수 있습니다.

안녕하세요, 펜실베이니아 대학교 바이오엔지니어링 학과 Jason Burdick 교수님 연구실의 Amidio Kahan입니다. 오늘은 조직 공학을 위한 3D 하이드로젤 내 세포 캡슐화 절차를 보여드리겠습니다. 저희는 하이드로젤의 조성과 구조가 캡슐화된 세포의 거동에 미치는 영향을 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다.

이제 시작하겠습니다. 이 절차를 시작하려면 PBS에 광개시제 Irgacure 2959(또는 I2959) 0.5% 중량 용액을 준비하십시오. 이를 혼합한 후 37°C의 암실에서 2~3일 동안 배양하십시오.

준비가 되면 시린지 필터를 사용하여 용액을 멸균하고 상온에서 보관하십시오. 다음으로, Microsoft Excel과 같은 스프레드시트 프로그램을 사용하여 제시된 폴리머와 가교제의 필요량을 계산하십시오. 여기서는 아크릴레이트 반응성 그룹으로 기능화된 히알루론산이 사용되었습니다.

또한 아미노산 시스테인, 아르기닌, 글리신 및 아스파르트산으로 구성된 기능성 접착 도메인을 포함하는 펜타펩타이드의 양을 계산하십시오. 시스테인은 폴리머에 결합시키기 위한 것입니다. 필요한 폴리머 가교제와 펜타펩타이드의 양이 결정되었으므로, 이를 각각 정밀하게 측정하여 에펜도르프 튜브에 넣으십시오.

계산 스프레드시트를 그에 맞게 조정하십시오. 얻어진 폴리머의 실제 질량을 확인한 후, 겔 몰드 준비 단계로 진행하십시오. 면도날을 사용하여 개별 포장된 멸균 팁의 끝부분을 잘라내십시오.

1 mL 일회용 주사기. 겔에 포토 패턴을 형성하기 위한 몰드로 사용할 수 있도록 단면이 평평하게 절단되었는지 확인하십시오. 마지막으로, 주사기 몰드, 캡을 열어둔 EOR 튜브 및 기타 필요한 재료들을 생물안전작업대(BSC) 내장 살균등 아래에 30분 동안 두어 멸균하십시오.

멸균이 완료되면 실험 기구의 멸균 후 세포 준비 단계로 진행하십시오. 후드 내에서 작업하며, 마이컬(mical) 유형 가교에 사용되는 폴리머에는 멸균된 TEA를, 자유 라디칼 가교에 사용되는 폴리머에는 멸균된 PBS를 첨가하십시오. 펜던트 잔기(pendant moiety) 튜브에 일치하는 버퍼를 넣고 볼텍싱하십시오.

펜던트 부위(pendant moiety)를 폴리머에 부착하기 위해, 펩타이드의 INE 그룹 내 티올(thiol)을 통해 알킬화된 히알루론산에 결합시키려면, 이를 폴리머 용액에 첨가하고 파라필름으로 밀봉하십시오. 간단히, 볼텍싱 후 37 °C에서 혼합하며 배양합니다. 펜던트 부위가 부착되는 동안, 캡슐화할 세포인 hMSC(인간 중간엽 줄기세포)를 PBS로 세척하여 준비하십시오.

그런 다음 실온에서 트립신으로 1분 동안 배양한 후, 트립신을 제거하고 37°C에서 5분 더 배양합니다. 이어서 HMSC 성장 배지를 추가하여 트립신을 중화시키고 플레이트 표면에서 세포를 분리합니다. 혈구계수기를 사용하여 세포 수를 측정합니다.

계수된 세포를 각 겔 세트에 필요한 적절한 수의 분량으로 나눕니다. 밀도가 mL당 1,000만 세포인 50 µL 겔 3개 한 세트의 경우, 150만 개의 세포를 개별 원추형 튜브에 분리합니다. 고정 시간 때문에 개별 세트당 4개 이상의 겔을 준비하지 마십시오.

다음으로 세포를 500 RCF에서 6분 동안 원심분리하십시오. 세포가 가라앉는 동안 실온에서 mical edition 가교 결합을 위한 중합 혼합물을 준비하십시오. 가교제에 버퍼를 첨가하여 적절한 농도를 맞추십시오.

빛으로 유도되는 자유 라디칼 가교를 위해, 이전에 준비한 I 2 9 5 9 용액을 폴리머 용액에 첨가합니다. 최종 개시제 농도가 0.05% weight가 되도록 총 겔 설정 부피의 10%를 첨가합니다. 이제 세포와 중합 혼합물이 하이드로겔 내 캡슐화 준비가 되었습니다.

원심 분리된 세포에서 상층액을 흡입하는 것부터 시작하십시오. 초기 흡입 후 액체가 가라앉을 때까지 기다렸다가 다시 흡입하여 세포 펠릿을 손상시키지 않으면서 가능한 한 많은 배지를 제거하십시오. 공기 방울이 생기지 않도록 폴리머 용액으로 세포 펠릿을 재현탁하십시오.

세포가 고르게 분산되도록 솔루션을 피펫으로 천천히 약 10회 정도 상하로 섞어줍니다. 미칼(mical) 타입 첨가 반응의 경우, 오리피스가 넓은 피펫 팁을 사용하여 폴리머 셀에 적절한 부피의 가교제 솔루션을 첨가합니다. 혼합한 후, 피펫을 원하는 개별 겔 부피로 설정하십시오.

용액을 피펫팅하여 균질화한 후 시린지 팁 몰드에 분주합니다. 세포가 균일하게 분포되도록 이 단계를 빠르게 수행하고, 가교 결합을 위해 배양 후드 내에서 10~30분 동안 배양합니다. 광개시제 유도 자유 라디칼 가교 결합을 위해 수행합니다.

적절한 부피를 시린지 팁 몰드에 분주합니다. 라디칼 가교를 위해 시린지를 365 nanometer 파장의 UV 광선에 10분 동안 노출시킵니다. ACRL 기능화 폴리머의 경우 4 mW/cm²의 UV 광선을 일반적으로 사용합니다.

UV 광선 노출 전 세포 침강을 최소화하기 위해 이 단계를 신속하게 수행하십시오. 가교 결합 후, 겔을 배양이 포함된 조직 배양 플레이트의 웰에 넣어 배양 및 분석을 진행합니다. 하이드로겔의 가교 결합은 순차적으로 수행할 수도 있습니다.

먼저, 기능화된 염료인 metholated rumine을 겔 내 최종 농도가 20 nanomolar가 되도록 첨가합니다. 이 염료는 겔의 라디칼 가교 영역에 우선적으로 결합하므로 패턴을 시각화하는 데 도움이 됩니다. 그런 다음, 다음 단계의 이론적 가교 밀도 중 일부만을 형성하는 mic 유형의 중합 반응을 시작합니다.

자유 라디칼 가교 결합을 위해서는 Adobe Photoshop 또는 Illustrator와 같은 프로그램에서 설계하여 투명 마스크에 직접 인쇄한 마스크를 사용해야 합니다. 마스크의 크기는 원형 주사기 상단과 일치해야 합니다. 멸균된 핀셋을 사용하여 멸균 마스크를 겔 표면에 직접 부착하고, 빛에 노출시켜 겔을 가교 결합시킵니다.

캡슐화 1시간 후 HA 기반 하이드로겔 내의 HMC가 여기에 추가로 제시되어 있습니다. 합성된 하이드로겔은 일반적으로 투명하므로 광학 현미경을 사용하여 세포의 형태를 관찰할 수 있습니다. 동일한 세포를 대상으로 캡슐화 24시간 후 형광 생존/사멸 염색 키트를 사용하여 생존력을 관찰하였습니다.

생존 세포를 검출하기 위해 calcium M을, 사멸 세포를 검출하기 위해 atherium homodimer를 사용하였으며, 95% 이상의 생존율을 확인하였습니다. 또한, 세포가 분석 시약을 얼마나 잘 대사하여 색 변화를 일으키는지로 측정하는 alamar blue 분석을 통해 세포 증식 수준을 결정하였습니다. 세포 염색은 분해성 및 접착성 HA 기반 하이드로젤 내에 캡슐화한 지 7일 후 H HMCs를 대상으로 표준 고정 및 투과화 절차를 사용하여 수행하였습니다.

플루오레신으로 표지된 phalloidin을 사용하여 세포의 액틴을 시각화하고, dpi로 핵을 염색합니다. 하이드로젤 매트릭스 내의 초점 접착(focal adhesions)을 시각화하기 위해 cullin에 대한 면역염색을 수행합니다. 라디칼 중합된 HMSC 캡슐화 HA 하이드로젤의 탈수, 파라핀 임베딩 및 섹셔닝을 표준 프로토콜에 따라 수행한 후 조직학적 염색을 실시합니다.

배양 1주 후, 핵을 염색하는 hematoxiline과 결합 조직을 염색하는 ASIN 및 글리코사미노글리칸을 위한 청색 염색제를 사용하여 염색하였습니다. 캡슐화된 줄기세포의 분화 정도를 정량화하기 위해 Realtime PCR을 사용합니다. 배경값을 뺀 후, 상시 활성 상태인 housekeeping 유전자인 수동 참조 신호와 비교하여 임계 형광 값에 도달한 사이클 수를 통해 표적 유전자의 발현 수준을 결정합니다. 지금까지 3D 하이드로젤에 세포를 캡슐화하고 젤 내에서의 세포 행동을 연구하는 방법을 보여드렸습니다.

이 절차들을 사용할 때는 멸균 완충액과 시약을 장기간 보관하거나 살균 UV 램프를 사용하여 멸균함으로써 재료의 완전한 멸균 상태를 보장하는 것이 중요합니다. 이것으로 마치겠습니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.