Name: 조직 공학을위한 3D Hydrogels에서 셀룰러 봉지 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-26T07:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: 학습하세요 조직 공학을 위한 3D 하이드로겔에서 세포 캡슐화 방법을. 교차결합 기법과 세포 생존율, 형태, 증식, 분화 분석을 포함한 프로토콜을 통해 캡슐화된 세포의 거동을 평가합니다.

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이 작품은 SK와 히스 부여 R01EB008722 국립 연구소에 대한 국립 과학 재단 (National Science Foundation) 대학원의 연구 활동에 의해 지원되었다.

A. 재료 준비 및 살균 <ol><li> 사전 준비 캡슐화 재료에 혼합하고 37 ° C. 며칠에 대한 잠복기에 의해, (PBS) 호수 버퍼 인산의 photoinitiator Irgacure 2959 (I2959)의 0.5 % WT의 솔루션을 준비 이 솔루션은 다음 주사기 살균에 대한 필터링 및 장기 사용을 위해 상온에서 저장할 수 있습니다. </li><li> 합성 수 젤의 원하는 구성에 따라, 폴리머 및 crosslinker의 무게가 필요 (예 : Microsoft Excel과 같은 스프레드 시트 프로그램을 사용하여) 계산합니다. 폴리머 주어진 무게가 hydrogels, crosslinker 및 전체 젤 볼륨의 폴리머 솔루션 부분에서 원하는 농도를 달성하기위한 정의된 총 볼륨에서 용해해야하기 때문에 또한 스프레드 시트를 사용하여 결정되어야합니다. 모든 펜던트 moieties (예, 접착제 RGD 또는 oligopeptide를 포함 YGSR) 이전 crosslinking에 통합하는 경우에는 비슷한 계산을하여야한다. </li><li> Eppendorf 튜브에 필요한 폴리머와 crosslinker의 금액과 장소의 무게를. 얻은 고분자의 실제 중량에 대해 적절하게 계산 스프레드 시트를 조정합니다. (참고 : 볼륨 얻은 폴리머와 crosslinker의 실제 대량 보상을 변경할 수 있습니다.) </li><li> 개별적으로 포장 무균 1 ML 일회용 주사기의 정상을 차단하기 위해 면도날을 사용하여 겔 금형을 준비합니다. 확인 평면 절단은 photopatterned의 젤을 위해 사용되는 금형에 대해 이루어집니다. </li><li> 주사기 금형, Eppendorf 튜브 (뚜껑 열고) 및 살균 광원 (일반적으로 생물 안전 캐비닛에 내장) 아래에 다른 필요한 자료를 놓고 30 분 소독. </li></ol> B. 셀 준비 <ol><li> 살균에 따라 적절한 멸균 버퍼 볼륨을 추가합니다 (스프레드 시트 계산 당, 버퍼의 선택은 달라질 수 PBS와 같은 triethanolamine 같은 약한베이스 버퍼는 일반적으로 자유 라디칼과 마이클 타입 crosslinking, 각각을 위해 사용되는 수있는 동안) 폴리머 Eppendorf 및 (옵션) 펜던트 잔기 포함하는 (예를 들어, 접착제 펩타이드)와 디졸브로 와동 (멸균 후드 랩 외부 parafilm으로 Eppendorf을 vortexing 경우). </li><li> 폴리머 솔루션에 펜던트 잔기 솔루션의 적절한 볼륨을 추가하고 parafilm과 인감을 바꿈. 셀 준비 중에 ° C가 반응 37 간략 와동과 부화 (가능한 경우, 로타리 저어 접시 위에). 펩타이드가 최종 히드로겔의 펜던트 그룹으로 포함되도록 이것은 아크릴 레이트 또는 메타 크릴 레이트에 대한 펩타이드에 thiol의 반응 (시스테인 그룹을 통해)이 포함됩니다. </li><li> Trypsinize 및 세포 및 젤류의 각 집합에 해당하는 숫자를 포함하는 부분에 별도의 계산. 예를 들어, 10000000 세포 / 개인 원뿔 관에 ML, 별도 1500000 세포의 밀도가 세 50 μL 젤의 집합에 대한. 그것은 더 이상 4보다 젤가 겔화의 타이밍 (젤 여러 세트를 합성하는 경우, 모든 집합에 대한 폴리머 솔루션의 적절한 볼륨을 포함하는 단일 Eppendorf 준비를 사용할 수 있습니다)으로 인해 개별 세트로 준비하는 것이 좋습니다. </li><li> 세포를 원심 분리기. </li><li> 세포가 다운 방적 있지만 <ol class="lalpha"><li> 라이트는 자유 라디칼 crosslinking를 시작 : 전체 젤 세트 볼륨의 10 % (0.05 WT %의 최종 개시제 농도)로 동등한 폴리머 솔루션에 0.5 WT % I2959 솔루션을 추가합니다. </li><li> 마이클 타입 (덧셈) crosslinking : 적절한 농도 솔루션을 달성하기 crosslinker에 버퍼를 추가합니다. </li><li> 연속 crosslinking 들면 :이 젤은 crosslinking 두 종류를 통합하고 이전 단계를 모두 필요로합니다. </li></ol></li></ol> C.의 히드로겔 형성 <ol><li> centrifuged 셀 부분에서 뜨는을 대기음. 세포 펠렛을 방해하지 않고 가능한 한 많은 매체를 제거하는 초기 열망하고 다시 대기음 후 정착에 액체 기다립니다. </li><li> 세포가 균일하게 분포돼 때까지 폴리머 솔루션 세포 펠렛을 Resuspend. 천천히 솔루션을 pipetting하여 기포 형성을 최소화하고 아래로 (약 10 사이클 세포를 배포하기에 충분해야합니다.) </li><li> Crosslinking의 Hydrogels <ol><li> 나누어지는 주사기 팁 금형에 적절한 볼륨 : 라이트는 자유 라디칼 crosslinking을 시작. 근본 crosslinking에 대한 자외선에 주사기를 노출 (예 : 365 NM에 10 분 노출, 4 mW/cm2 UV 라이트는 아크릴 레이트 기능화 폴리머에 대한 일반적입니다.) 이 단계는 세포 자외선 노출 전에 정착 최소화하기 위해 신속하게 수행하여야한다. </li><li> 마이클 타입 (덧셈) crosslinking : 다양한 오리피스 피펫 팁을 사용하면, 고분자 / 세포 솔루션 crosslinker 솔루션의 적절한 볼륨을 추가 원하는 개별 겔 볼륨에 피펫을 설정, 솔루션을 피펫 아래로균질 및 주사기 팁 금형으로 나누어지는. 이 단계는 세포의 균등을 보장하기 위해 신속하게 수행하여야한다. crosslinking에 대한 문화 모자 10~30분이 (개별 시스템에 따라) 인큐베이션 수 있습니다. </li><li> 연속 crosslinking : 이것은 다음 마이클 타입 이외의 첫번째 반응은 두 번째 crosslinking에 대한 조명에 노출을 포함한다. 이론 crosslinks의 일부 분일 뿐인 걸까은 첫 번째 crosslinking 동안 반응해야하고 살균 마스크 전에 소독 핀셋을 사용하여 빛을 노출로 겔 표면에 직접 적용해야합니다. 그것이 젤 크게 가교 지역에서 우선적으로 통합할 수 있기 때문에 기능화 염색 (20 NM의 겔에서 최종 농도에서 예, methacrylated rhodamine (MeRho)가)도 (그림 2, patterning을 시각화하는 초기 솔루션에 추가할 수 있습니다 ). </li></ol></li></ol> D. 셀 문화 및 분석 <ol><li> 다음 crosslinking, 부화 및 분석을위한 매체를 포함하는 조직 문화 판의 우물 (다음 단계 참조)에 플런지 젤. </li><li> 형광 죽은 / 라이브 얼룩 키트를 (그림 3, 4)를 사용하고 생존 능력, 세포는 형태로 가벼운 현미경 (일반적으로, 합성 hydrogels은 투명 그림 3)를 사용하는 시각 수 있습니다. (예, 4&#39; - 6 - Diamidino - 2 - phenylindole (DAPI)) 세포 굴지 (예 : rhodamine 또는 플루오레신가 phalloidin로 표시)과 핵에 대한 얼룩 것은 다음과 같은 절차를 표준으로 고정하고 permeabilization 절차를 (그림 4)를 사용하여 수행할 수 있습니다. <ol class="laplha"><li> PBS로 5 분 배 구조를 씻어. </li><li> 실온에서 30 분 1 ML 4 % 포름 알데히드에 부화하여 젤을 수정. </li><li> 3퍼센트 (W / V) BSA와 0.5 % (W / V) PBS에서 트윈을 포함 차단 솔루션 배 구조를 씻어. </li><li> 0.25 % (W / V) 20 분 솔루션을 차단에서 트리톤 X와 함께 막을 Permeabilize. </li><li> 솔루션을 차단과 배 구조를 씻어. </li><li> 0.66 μg / 상온에서 두 시간 동안 솔루션을 차단에 ML FITC 또는 rhodamine phalloidin과 함께 F - 굴지에 대한 얼룩. </li><li> 솔루션을 차단과 배 린스. </li><li> 20 분 0.4 μL / PBS에 ML DAPI를 사용하여 세포 핵을 얼룩. </li><li> PBS로 3 배 린스. </li><li> epifluorescent 또는 공촛점 현미경을 사용하여 세포를 시각화. </li></ol></li><li> 젤 내의 세포의 확산은 일반적으로 시판 assays (예, 전체 DNA 또는 생화학 콘텐츠)를 사용하여 평가됩니다. PicoGreen 더블 - 좌초된 DNA quantifying에 대한 얼룩 일반적으로 사용하고 민감한 형광 핵산이다 (싱어 외 있습니다.). 세포도 계산하고 2 단계에 설명되어있는 시각화 방법을 사용하여 초기 제어 번호 정상화 수 있습니다. </li><li> Histological sectioning와 얼룩은 또한 세포를 시각화하고 매트릭스를 형성하는 데 사용할 수 있습니다. 3D hydrogels의 탈수 및 sectioning에 대한 다음과 같은 프로토콜은 유리 슬라이드에 횡단면 조각을 얻을하는 데 사용할 수 있습니다 : <ol class="lalpha"><li> 고정 및 탈수 <ol class="lroman"><li> PBS로 3 배 표본 린스. </li><li> 4 % paraformaldehyde 30 분 - 5 수정. </li><li> PBS로 3 배 표본 린스. </li><li> 25 EtOH에서 샘플을 품어 ° C 다음 EtOH (V / V) 물 농도 (순서대로) 각각 1 시간 동안 : 50 % 70 % 95 %, 95 %, 100 % (이 시점에서, 표본 25 밤새 저장할 수 있습니다 ° C). </li></ol></li><li> 클리어링와 침투 <ol class="lroman"><li> 25 1 시간 ° C, 65 한 시간 뒤에 ° C. 100 % Citrisolv로 전송 </li><li> 샘플의 단면이 노출되는 등 페트리 접시에 면도날로 절반 샘플 컷. </li><li> 65 1 시간에 대한 Citrisolv / 마이크로 컷 파라핀의 혼합물로 전송 1시 1분 ° C. </li><li> 65 1 시간 100 % 마이크로 컷 파라핀으로 전송 ° C. </li><li> 65 밤새 백퍼센트 마이크로 컷 파라핀으로 전송 ° C. </li><li> 65 1-2시간 100 % 마이크로 컷 파라핀으로 전송 ° C. </li></ol></li><li> 퍼가기 <ol class="lroman"><li> 100 % 파라핀과 껍질 - 거리 금형의 위치 표본. </li><li> 금형 침대에서 왁스의 작은 금액을 놓고, 단면이 아래로 향하게있는 샘플의 두 반쪽을 삽입합니다. </li><li> 상단 필터 조각을 적용 <ol><li> 잠수함 상단 부분을 추가 왁스를 추가하고 ~ 10 분 동안 경화 수 있습니다. </li></ol></li><li> ° C의 냉장고가 강화하기 위해 표본은 하룻밤 수 있도록 4 삽입을 전송. </li><li> 스피스먼 섹션 수 있습니다에드 다음날은 일반적으로 슬라이스 당 50-10 μm의 두께에 상용 microtomes를 사용합니다. 일반적으로 껍질 - 거리 금형은 마이크로톰 단계에 대해 수직으로 장착되며, 수동 제어는 칼날과 샘플의 섹션 두께, 슬라 이서 및 정렬을 설정하는 데 사용됩니다. </li></ol></li><li> RNA 추출 유전자 발현도 (예, 실시간 중합 효소의 연쇄 반응 (PCR)을 통해) 양적 평가 수 있습니다. 3 차원 hydrogels에서 RNA 추출, 아래는 그 중 예를 들면,에 대한 프로토콜은 훨씬 간단 2D 사건에서 상당히 다릅니다. <ol class="lroman"><li> 각 3D 히드로겔에 대한 인증 RNAse 무료 Eppendorf 튜브에 레이블을 각 튜브 500 μL Trizol ® 시약을 추가합니다. </li><li> 명확한 솔루션 얻을 때까지 수동으로 hydrogels을 부러 유봉 (조직 분쇄기)를 사용합니다. 확인 다른 그라인더는 각 조건에 사용됩니다. </li><li> 와동 각 Eppendorf 20 초 동안 샘플을 균질 수 있습니다. </li><li> 핵 단백질의 단지의 완전한 분리를 허용하기 위해 5 분 동안 실온에서 샘플을 품어. </li><li> 20 분 얼음 쿨 샘플 </li><li> 각각의 샘플 및 와동 200 μL (사람마다 ML Trizol) 클로로포름을 추가합니다. </li><li> 다섯 분 실온에서 샘플을 품어. </li><li> 4 12,000 XG에서 샘플을 원심 분리기 ° C를 15 분. </li><li> 새로운 Eppendorf 튜브 (계면 지역 및 로우어 레드, 페놀 - 클로로포름 단계를 피하는)에 수성 단계 (명확 상단 레이어)를 전송합니다. RNA는 명확 수성 단계에 남아 있습니다. </li><li> RNA 격리 및 저장을위한 일반적인 기법을 이제 사용할 수 있습니다. </li><li> 다음 RNA 추출, 리버스 transcriptase 실시간 PCR을위한 상용 키트는 종종 일부 수정 (Elisseff 외., Strehin 외.)으로 사용됩니다. </li></ol></li></ol></li></ol> 대표 결과 : photopatterned hydrogels 및 젤류 내에서 세포의 캡슐의 시각화의 대표적인 결과를 그림 2-4 (로 위의 프로토콜에서 참조)를 참조하십시오. <img src="/files/ftp_upload/1590/1590fig1_2.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. 3D 캡슐 절차의 개요. 다이어그램 단계 stepwise 프로토콜 섹션 제목과 일치합니다. <img src="/files/ftp_upload/1590/1590fig2.jpg" alt="그림 2" /> 연속 마이클 형 외에 다음 급진 중합을 사용하여 그림 2. Photopatterned의 히드로겔. 사진 반응의 색소의 설립과 함께 부분적으로 가교 히드로겔의 photopatterning의 (A) 도식. (B) 서클 또는 (C) 스트 라이프 투명 필름 마스크 hyaluronic 산성 hydrogels를 패턴. Methacrylated rhodamine (MeRho)는 오직 조명에 노출되었던 젤의 지역에서 통합됩니다. 스케일 바 = 100 μm의. <img src="/files/ftp_upload/1590/1590fig3.jpg" alt="그림 3" /> 그림 3. 차원 hydrogels에서 세포의 시각화. 줄기 세포는 (a) 가벼운 현미경을 통해 시각 또는 (b) 라이브 (녹색, Calcein AM)와 죽은 (빨강, Ethidium homodimer - 1) 얼룩 24 시간 조명을 통해 가교 hyaluronic 산성 히드로겔에서 1,000,000 세포 / ML에서 캡슐을 따라 자유 라디칼 메커니즘을 시작하였습니다. 스케일 바 = 100 μm의. <img src="/files/ftp_upload/1590/1590fig4.jpg" alt="그림 4" /> 그림 4. 차원 hydrogels에서 세포의 시각화. hMSCs는 (마이클 타입 메커니즘을 통해 가교 hyaluronic 산성 히드로겔에서 1,000,000 세포 / ML에서 캡슐 다음 (A) 라이브 셀 (Calcein AM) 또는 (b) 세포 굴지 (rhodamine phalloidin)과 핵 (DAPI) 5 일간 스테인드 ) 펜던트 접착제의 펩티드 및 bifunctional proteolytically 분해 펩티드 crosslinkers를 사용합니다. 스케일 바 = 100 μm의.

<ol><li>Singer, V. L., Jones, L. J., Yue, S. T., Haugland, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+PicoGreen+reagent+and+development+of+a+fluorescence-based+solution+assay+for+double-stranded+DNA+quantitation%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Characterization of PicoGreen reagent and development of a fluorescence-based solution assay for double-stranded DNA quantitation.</a> Anal Biochem. 249, 228-238 (1997).</li>
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<li>Khetan, S., Katz, J. S., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+crosslinking+to+control+cellular+spreading+in+3-dimensional+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Sequential crosslinking to control cellular spreading in 3-dimensional hydrogels.</a> Soft Matter. 5, 1601-1606 (2009).</li>
</ol>

설명 프로토콜 cytocompatible 방식으로 히드로겔 공사장 공중 발판 내에서 세포를 캡슐로 간단하고 강력한 방법을 나타냅니다. 말기 차별화된 이후 이러한 기술은 특히 중요하고 줄기 세포는 2D 3D microenvironments에 비해 현저하게 다른 동작을 수 있습니다. 도 자료의 주입 (예에서 현장 급진 중합), 세포 캡슐화 및 생존과 차별에 대한 분석을 포함하는 치료 방법에 대한 소재 개발 과정에서 도움이 될 수 있습니다. 설명 순차 프로세스 공간 히드로겔 환경을 조작하는 데 사용하고, 따라서 세포의 행동 (Khetan 외를 참조하십시오.)하실 수 있습니다. 전체 설명 프로토콜의 가장 중요한 요소는 사용되는 모든 솔루션의 균질성입니다. 특히, 특별한주의가 crosslinker 솔루션뿐만 아니라 다음 피펫 resuspension에 의해 세포가 균일하게 예비 중합체 솔루션에 배포하고 있으며, 해결이 잘 혼합되도록로 이동해야합니다. 이것을 보장하기 위해 실패하면 셀 또는 겔 구조와 붓기 지역 유사 clumping 발생할 수 있습니다. 프로토콜 여기 캡슐 세포에 대한 절차에 주로 초점을 제시하지만, 그것은 캡슐 일반적으로 2D 시딩용으로 작성된 분석 프로토콜을 일부 조정이 필요한 수도주의하는 것이 중요합니다. 몇 가지 예제가 hydrogels에 세포를 시각화 및 평가를위한 그림했다.

<table><tbody><tr><td>I2959</td><td>시약</td><td>Ciba Specialty Chemicals</td><td></td><td></td></tr><tr><td>.2 M Triethanolamine Buffer</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0449</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>시약</td><td>Invitrogen</td><td>14040-117</td><td>1x, 멸균 액체</td></tr><tr><td>Live/Dead 염색 키트</td><td>시약</td><td>Invitrogen</td><td>L3224</td><td>생존(Calcein AM) 및 사멸(ethidium homodimer-1) 프로브 포함</td></tr><tr><td>Phalloidin-FITC</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5282</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine Phalloidin</td><td>시약</td><td>Invitrogen</td><td>R415</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>Methacryloxyethyl thiocarbamoyl rhodamine B (MeRho)</td><td>시약</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>23591</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Citrisolv</td><td>시약</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-143975</td><td></td></tr><tr><td>Micro-cut paraffin</td><td>시약</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>24202</td><td></td></tr><tr><td>Trizol 시약</td><td>시약</td><td>Invitrogen</td><td>15596-026</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &amp;mu;m 공극 크기 나일론 시린지 필터</td><td>장비</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-719C</td><td></td></tr><tr><td>1 mL 일회용 시린지</td><td>장비</td><td>BD Biosciences</td><td>309602</td><td>UV 노출을 위해 시린지를 일정한 높이로 절단함</td></tr><tr><td>Wide orifice 피펫 팁</td><td>장비</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6800</td><td></td></tr><tr><td>365 nm 필터가 장착된 Omnicure UV Spot Cure System</td><td>장비</td><td>EXFO</td><td>S1000</td><td></td></tr><tr><td>254 nm 살균 UV 광원</td><td>장비</td><td></td><td></td><td>대부분의 생물 안전 작업대(BSC)에 내장됨</td></tr></tbody></table>

조직 공학을위한 3d hydrogels에서 셀룰러 봉지

Cellular Encapsulation in 3D Hydrogels for Tissue Engineering 

hydrogels 내에서 세포의 3D 캡슐은 culturing 세포 및 조직 공학을위한 구조의 개발을 향해 점점 더 중요하고 인기있는 기술을 나타냅니다. 이 환경은 더 인해 조직과 같은 속성과 3D 환경, 표준 조직 문화에 비해 세포가 생체내에서 관찰 무엇 모방한 것이었 지요. 합성 고분자 hydrogels은 안정이나 새로운 조직이 캡슐 세포에 의해 입금 그대로 가수 분해 또는 proteolysis를 통해 저하될 수 있도록 설계 수있는 물을 부었 네트워크입니다. 고분자의 다양한는 같은 폴리 (에틸렌 글리콜)과 hyaluronic 산성 이러한 응용 프로그램에 대해 살펴왔다. 가장 일반적으로, 고분자는 이러한 methacrylates 또는 다양한 메커니즘을 통해 crosslinking를 겪고 수 acrylates 같은 반응 그룹으로 작용합니다. 캡슐 줄기 세포 (. 버딕 외)의 분화를 포함하여 생존과 직접적인 세포 표현형을 개선하기 위해 - 생화 학적 신호의 물리적 또는 펜던트 공유 결합 정관을 통해, 예를 들어 - 지난 10 년간 많은 진전이 엔지니어링이 microenvironments을 이루어왔다. 세포의 3D 캡슐에 대한 다음과 같은 방법 cytocompatibility을 극대화하고 히드로겔 처리 단계의 수를 최소화하기 위해 다른 실험실에서 최적화되었습니다. 다음과 같은 프로토콜 (절차의 그림에 대한 그림 1 참조), 그것은 crosslinking를 겪고 수 기능화 고분자가 손에 이미 것으로 간주됩니다, 같은 조직 공학 분야에 적용 고분자 화학 우수 리뷰는 다른 찾을 수 있습니다 (버딕 외.) 이러한 방법은 폴리머 타입의 범위와 호환됩니다. 또한, 마이클 타입 추가 (Lutolf 외를 참조하십시오.)와 자유 라디칼 (Elisseeff 외를 참조하십시오.) 메커니즘 여기에 초점을 맞춘 가벼운 시작은 보고된 crosslinking 기술의 단지 작은 부분을 구성합니다. 반응 그룹의 일부가 처음 추가 crosslinking에 의해 소비하고 근본적인 메커니즘 뒤에있는 혼합 모드 crosslinking은 캡슐화된 세포 (Khetan 외., 살리 나스 외.)의 표현형를 지시하고 또 다른 일반적으로 사용하고 강력한 패러다임이다.

우리는 합성 hydrogels 내에서 세포의 3 차원 (3D) 캡슐에 대한 프로토콜을 제시한다. 캡슐화 절차는 캡슐화된 세포의 행동을 평가하는 두 가지 일반적으로 사용되는 crosslinking의 방법 (마이클 타입뿐만 아니라 가벼운 - 시작 자유 라디칼 메커니즘),뿐만 아니라 기술의 번호를 설명합니다.

조직 공학을위한 3D Hydrogels에서 셀룰러 봉지

하이드로젤 내에 세포를 3차원으로 캡슐화하는 것은 세포 배양 및 개발을 향한 갈수록 중요하고 대중적인 기술이 되고 있으며...

세포 캡슐화의 단계별 과정은 하이드로젤 몰드 및 기타 재료의 준비와 멸균으로 시작하며, 이어서 세포를 각 젤 세트용 튜브에 개별 집단으로 분리합니다. 그 다음 세포가 존재하는 상태에서 젤화가 수행되며, 이후 in vitro 또는 in vivo 배양 기간을 거칩니다. 세포 거동에 대한 하류 분석에는 생존율, 형태, 증식 및 분화 테스트가 포함될 수 있습니다.안녕하세요, 펜실베이니아 대학교 바이오공학과 Jason Burdick 박사님 연구실의 Amidio Kahan입니다. 오늘은 조직 공학을 위한 3D 하이드로겔 내 세포 캡슐화 절차를 보여드리겠습니다. 저희는 이 절차를 통해 하이드로겔의 조성과 구조가 캡슐화된 세포의 거동에 미치는 영향을 연구합니다.이제 시작해 보겠습니다. 이 절차를 시작하려면, PBS에 광개시제 Irgacure 2959 또는 I2959를 0.5%weight 용액으로 준비하십시오. 이를 혼합한 후 37 °C의 암실에서 2~3일 동안 배양하십시오.준비가 되면, 시린지 필터를 사용하여 용액을 멸균하고 실온에서 보관하십시오. 다음으로, Microsoft Excel과 같은 스프레드시트 프로그램을 사용하여 제시된 폴리머와 가교제의 필요량을 계산하십시오. 여기 아크릴레이트 반응기로 기능화된 히알루론산이 있습니다.또한 아미노산 시스테인, 아르기닌, 글리신 및 아스파르트산을 포함하는 기능성 접착 도메인의 펜탄트 펩타이드 양을 계산하십시오. 시스테인은 폴리머에 결합시키기 위한 것입니다. 필요한 양의 폴리머 가교제와 펜탄트 펩타이드가 결정되었으면, 각각을 칭량하여 에펜도르프 튜브에 넣으십시오.계산 스프레드시트를 그에 맞게 조정하십시오. 실제로 얻은 폴리머 질량에 대해서는 겔 몰드 준비 단계로 진행하십시오. 면도날을 사용하여 개별 포장된 멸균 팁의 끝부분을 잘라내십시오.1 mL 일회용 주사기. 젤에 포토 패턴을 적용하기 위한 몰드로 사용할 경우, 단면이 평평하게 절단되었는지 확인하십시오. 마지막으로, 캡을 열어둔 주사기 몰드 EOR 튜브와 기타 필요한 재료들을 생물안전작업대(biological safety cabinet) 내부에 설치된 살균등 아래에 30분 동안 두어 멸균하십시오.멸균이 완료되면, 실험 기구의 멸균 후 세포 준비 단계로 넘어갑니다. 후드 내에서 작업하며, 마이칼(mical) 유형 가교에 사용된 폴리머에는 멸균된 TEA를, 자유 라디칼 가교에 사용된 폴리머에는 멸균된 PBS를 첨가하십시오. 펜던트 잔기(pendant moiety) 튜브에 해당 버퍼를 넣고 볼텍싱합니다.펜던트 부분을 고분자에 부착하기 위해, 펩타이드의 INE 그룹에 있는 티올을 통해 알킬화된 히알루론산에 펜던트 부분을 결합시키려면, 이를 고분자 용액에 첨가하고 파라필름으로 밀봉하십시오. 간단히, 볼텍싱 후 37 °C에서 혼합하며 배양합니다. 펜던트 부분이 부착되는 동안, 캡슐화할 세포인 인간 중간엽 줄기세포(hMSCs)를 PBS로 세척하여 준비하십시오.그 후 실온에서 trypsin으로 1분 동안 배양하고, trypsin을 제거한 뒤 37°C에서 5분 더 배양합니다. 그런 다음 HMSC 성장 배지를 첨가하여 trypsin을 중화시키고 플레이트 표면에서 세포를 분리합니다. 혈구계수기(hemocytometer)를 사용하여 세포 수를 측정합니다.계수한 세포를 각 겔 세트에 필요한 적절한 수의 분량으로 나누십시오. 10 million cells/mL 밀도로 50 µL 겔 3개를 한 세트로 구성하는 경우, 1.5 million cells를 개별 원뿔형 튜브에 나누어 담으십시오. 겔 형성 시간으로 인해 개별 세트당 4개 이상의 겔을 준비하지 마십시오.다음으로 세포를 500 RCF에서 6분 동안 원심 분리합니다. 세포가 침전되는 동안 실온에서 mical edition 교차결합을 위한 중합 혼합물을 준비합니다. 교차결합제에 버퍼를 추가하여 적절한 농도를 맞춥니다.광개시 자유 라디칼 가교를 위해, 미리 준비한 I 2 9 5 9 용액을 폴리머 용액에 첨가합니다. 최종 개시제 농도가 0.05%weight가 되도록 전체 겔 설정 부피의 10%를 첨가합니다. 이제 세포와 중합 혼합물이 하이드로겔 내 캡슐화 준비가 되었습니다.먼저 원심분리된 세포에서 상층액을 흡입하여 제거합니다. 1차 흡입 후 액체가 가라앉을 때까지 기다렸다가, 세포 펠렛을 손상시키지 않는 범위 내에서 배지를 최대한 다시 흡입하여 제거합니다. 공기 방울이 생기지 않도록 폴리머 용액을 사용하여 세포 펠렛을 재현탁합니다.용액을 천천히 10회 정도 피펫팅하여 세포가 균일하게 분산되도록 합니다. 마이컬(mical) 타입 첨가 반응의 경우, 구경이 넓은 피펫 팁을 사용하여 고분자 세포에 적절한 부피의 가교제 용액을 첨가합니다. 혼합합니다. 피펫을 원하는 개별 겔 부피로 설정합니다.용액을 피펫으로 상하 혼합하여 균질화한 후 시린지 팁 몰드에 분주합니다. 세포가 고르게 분포되도록 이 단계를 신속하게 수행하고, 가교 결합을 위해 배양 후드에서 10~30분 동안 배양합니다. 광개시 자유 라디칼 가교 결합을 위해.적절한 부피를 시린지 팁 몰드에 분주합니다. 라디칼 가교를 위해 시린지를 365 nanometer 파장의 UV 광선에 10분 동안 노출시킵니다. ACRL 기능화 폴리머의 경우 4 milliwatts per centimeter squared의 UV 광선이 일반적으로 사용됩니다.UV 광 노출 전 세포가 가라앉는 것을 최소화하기 위해 이 단계를 빠르게 수행하십시오. 가교 결합 후, 배양 및 분석을 위해 배지가 담긴 조직 배양 플레이트의 웰에 겔을 넣으십시오. 하이드로겔의 가교 결합은 순차적으로 진행할 수도 있습니다.먼저, 작용기화된 염료인 metholated rumine을 겔 내 최종 농도가 20 nanomolar가 되도록 첨가합니다. 이 염료는 겔의 라디칼 가교 영역에 우선적으로 통합되므로 패턴 시각화에 도움을 줍니다. 그런 다음, 다음에 설명할 이론적 가교 수의 일부만 생성하는 mic 유형의 중합 반응을 시작합니다.자유 라디칼 가교법을 위해서는 Adobe Photoshop 또는 Illustrator와 같은 프로그램으로 설계하여 투명 마스크에 직접 인쇄한 마스크가 필요합니다. 마스크의 크기는 원형 시린지 상단과 일치해야 합니다. 멸균 핀셋을 사용하여 멸균된 마스크를 겔 표면에 직접 부착하고, 빛에 노출시켜 겔을 가교합니다.캡슐화 1시간 후 HA 기반 하이드로젤 내의 HMC가 여기에 추가로 제시되어 있습니다. 합성된 하이드로젤은 일반적으로 투명하기 때문에 광학 현미경을 사용하여 세포의 형태를 시각화할 수 있습니다. 동일한 세포의 생존능을 캡슐화 24시간 후에 형광 live dead 염색 키트를 사용하여 시각화하였습니다.생존 세포를 검출하기 위해 calcium M을 사용하고 죽은 세포를 위해 atherium homodimer를 사용한 결과, 95% 이상의 생존율이 관찰되었습니다. 또한, 세포가 분석 시약을 대사하여 색이 변하는 정도를 통해 세포 증식 수준을 결정하는 alamar blue 분석을 수행하였습니다. 세포 염색은 분해성 및 접착성 HA 기반 하이드로겔 내로 캡슐화한 7일 후의 H HMCs를 대상으로 표준 고정 및 투과화 절차를 사용하여 진행되었습니다.플루오레세인으로 표지된 phalloidin을 사용하여 세포 액틴을 시각화하고, dpi로 핵을 염색하였습니다. 하이드로젤 매트릭스 내의 국소 접착물을 시각화하기 위해 cullin에 대한 면역염색을 실시하였습니다. 라디칼 중합된 HMSC 캡슐화 HA 하이드로젤의 탈수, 파라핀 매립 및 절편 제작을 표준 프로토콜에 따라 수행한 후 조직학적 염색을 실시하였습니다.배양 일주일 후, 핵을 표시하는 hematoxylin과 결합 조직을 표시하는 ASIN, 그리고 글리코사미노글리칸을 위한 청색 염색을 통해 염색하였습니다. 캡슐화된 줄기세포의 분화 정도를 정량화하기 위해 Realtime PCR을 사용합니다. 배경값을 뺀 후, 상시 활성화된 하우스키핑 유전자인 수동 참조 신호와 비교하여 임계 형광값에 도달한 사이클 수를 통해 표적 유전자의 발현 수준을 결정합니다. 지금까지 3D 하이드로젤에 세포를 캡슐화하고 젤 내에서의 세포 행동을 연구하는 방법을 보여드렸습니다.이 절차를 사용할 때는 멸균 버퍼 용액과 시약을 장기 보관하거나 살균 UV 램프로 멸균하여 재료의 완전한 멸균 상태를 보장하는 것이 중요합니다. 이것으로 모두 마치겠습니다. 시청해 주셔서 감사하며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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연구

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우리는 신생아 cardiomyocytes 및 조직 공학을위한 섬유소의 히드로겔 구조의 캡슐에 대한 세포의 준비의 절연을 설명합니다. 우리는 전기 자극 및 세포 생존과 immunohistological 얼룩에 따라 생성되는 활성 강제를 포함하여 문화 시대 이후 조직 공학 m​​yocardium을 분석하는 방법을 설명합니다.

심장 조직 공학을위한 섬유소 히드로겔에 Cardiomyocytes의 캡슐

이 동영상은 3D 하이드로겔로 캡슐화된 세포를 면역 염색하는 기술을 보여줍니다. 신경전구세포를 포함하는 하이드로겔 배양액은 고정, 투과화 및 차단 용액으로 처리되어 비특이적 면역 염색을 방지합니다. 특정 단백질에 결합하기 위해 1차 항체 칵테일을 첨가한 다음 형광 표지된 2차 항체와 핵 염색을 추가합니다. 그런 다음 샘플을 슬라이드에 장착하고 컨포칼 현미경으로 관찰합니다.

3D 하이드로겔 시스템에 캡슐화된 세포의 면역염색

이 연구에서는 콜라겐, 평활근 세포 및 내피 세포를 직접 배양하여 살아있는 혈관 조직을 신속하게 만드는 기술을 제시합니다. 또한 엔지니어링된 혈관 조직의 기계적 특성화를 위한 새로운 프로토콜이 설명됩니다.

혈관 조직 재생을위한 엔지니어링 3D Cellularized 콜라겐 젤

Cartesian bioprinter는 정밀하고 재현 가능한 형상으로 다중 재료 증착을 허용하는 동시에 환경 요인을 제어할 수 있도록 설계 및 제작되었습니다. 3차원 바이오프린터를 사용하면 복잡하고 실행 가능한 구조를 인쇄하고 쉽게 복제할 수 있습니다.

세 디스펜서 데카르트 프린터 사용 Bioprinted 세포를 구축의 생존

우리는 독립형 형태로 조립 및 조작할 수 있는 간단한 프로세스를 사용하여 미세 패턴화된 하이드로겔 시트의 제작을 설명합니다. 이러한 모듈식 하이드로겔 시트를 사용하면 제어된 세포 미세환경으로 간단한 매크로 스케일 3D 세포 배양 시스템을 생성할 수 있습니다.

미세 패턴 매크로 스케일 3D 셀룰러 아키텍처 모듈 형 하이드로 겔 시트의 건설

이 폐 세포 외 기질에서 3 차원 세포 배양 지지체를 제작하는 방법이다. 그대로 폐 세 차원 세포의 성장을 지원할 수있는 하이드로 겔로 처리된다.

3 차원 세포 배양을위한 폐 세포 외 매트릭스에서 조정 히드로 겔

단백질 기반 hydrogels 3 차원 구조를 조작 하는 다른 메서드 여기 소재 속성에 대해 계산 됩니다. 세포 접착 펩 티 드와 함께 macroporous 네트워크는 공업화 하 고 두 개의 서로 다른 모델 셀 라인을 사용 하 여 세포 배양에서 그들의 타당성을 평가.

셀 문화 응용 프로그램에 대 한 단백질 기반 Hydrogels 아키텍처의 쉬운 조작

이 프로토콜 cryogelation 기술로 제작을 통합 하 여 탄력 있는 3D macroporous microcryogels의 제작을 설명 합니다. 재생 치료를 촉진 하기 위하여 쉽게 주입된 비보 수 또는 생체 외에서 높은 처리량 마약 검사에 대 한 배열로 조립 셀 로딩 시 3D microtissues 생성 됩니다.

주 사용 재생 치료와 높은 처리량 마약 검사에 대 한 3D Microtissues

여기는 키토 산 기반의 주 사용 hydrogels 동적 것 화학을 사용 하 여 손쉬운 준비에 설명 합니다. 하이드로 겔의 기계적 강도 및 3D 세포 배양에서의 응용 프로그램을 조정 하는 방법은 제시 하는.

주 사용 Hydrogels 키토 산 기반 및 3D 세포 배양에서의 응용의 준비

그들은 완전 한 tunability 폴리머 백본 및 따라서 셀 microenvironment의 허용으로 재조합 단백질 엔지니어링 hydrogels는 3D 세포 배양에 대 한 유리한 있습니다. 여기, 우리 재조합 엘라 스 틴 같은 단백질 정화의 과정 및 3 차원 하이드로 겔 셀 캡슐화에의 응용을 설명합니다.

캡슐화 및 3d에서 셀의 Immunostaining에 대 한 엘라 스 틴 같은 단백질 Hydrogels의 생산

여기에서는 지방 유래 줄기 세포(ADSC) 배양을 위한 3차원(3D) 세포 배양 프레임워크로 하이드로겔을 사용하는 방법을 시연하고 3D 배양 환경 내에서 ADSC의 증식을 향상시키기 위해 광생물 조절(PBM)을 도입하는 프로토콜을 제시합니다.

광생물조절 증강을 이용한 하이드로겔 내 지방 유래 줄기세포의 3차원 세포 배양

학습하세요 조직 공학을 위한 3D 하이드로겔에서 세포 캡슐화 방법을. 교차결합 기법과 세포 생존율, 형태, 증식, 분화 분석을 포함한 프로토콜을 통해 캡슐화된 세포의 거동을 평가합니다.

조직 공학을위한 3D Hydrogels에서 셀룰러 봉지

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