October 26th, 2009
우리는 합성 hydrogels 내에서 세포의 3 차원 (3D) 캡슐에 대한 프로토콜을 제시한다. 캡슐화 절차는 캡슐화된 세포의 행동을 평가하는 두 가지 일반적으로 사용되는 crosslinking의 방법 (마이클 타입뿐만 아니라 가벼운 - 시작 자유 라디칼 메커니즘),뿐만 아니라 기술의 번호를 설명합니다.
세포를 캡슐화하기 위한 단계적 공정은 하이드로겔 주형 및 기타 물질의 준비 및 멸균으로 시작하여 세포를 개별 집단으로 분리하여 각 겔 세트에 대한 튜브로 분리합니다. 그런 다음 세포가 있는 상태에서 이온을 수행한 후 시험관 내 또는 생체 내 배양 기간을 수행합니다. 세포 거동에 대한 다운스트림 분석에는 생존력, 형태, 증식 및 분화에 대한 테스트가 포함될 수 있습니다.
안녕하세요, 펜실베니아 대학교 생명공학과 제이슨 버딕 박사 연구실의 아미디오 카한입니다. 오늘 우리는 조직 공학을 위한 3D 하이드로겔의 세포 캡슐화 절차를 보여드리겠습니다. 우리는 이 절차를 사용하여 하이드로겔 조성 및 구조가 캡슐화된 세포의 거동에 미치는 영향을 연구합니다.
시작하겠습니다. 이 절차를 시작하려면 PBS에서 광개시제 공기 경화 2 9 5 9 또는 I 2 9 5 9의 0.5 % 중량 용액을 준비하십시오. 섞어서 섭씨 37도의 어둠 속에서 2-3일 동안 배양합니다.
준비가 되면 주사기 필터를 사용하여 용액을 멸균하고 실온에서 보관합니다. 다음으로, Microsoft Excel과 같은 스프레드시트 프로그램을 사용하여 시연에 필요한 폴리머 및 가교제의 양을 계산합니다. 다음은 아크릴레이트 반응기로 기능화된 히알루론산입니다.
또한 아미노산 시스틴, 아르기닌, 글리신 및 아스파르테이트와 함께 기능적 접착 도메인을 포함하는 페넌트 펩타이드의 양을 계산합니다. 시스틴은 폴리머에 테더링하기 위한 것입니다. 이제 필요한 양의 폴리머 가교제와 펜트가 결정되었으므로 무게를 측정하고 각각을 einor 튜브에 넣습니다.
그에 따라 계산 스프레드시트를 조정합니다. 얻어진 폴리머의 실제 질량에 대해, 겔 몰드를 준비하기 위해 진행한다. 면도날을 사용하여 개별 포장된 멸균의 끝을 자릅니다.
1밀리리터 일회용 주사기. 사진 패턴을 젤로 만드는 데 사용할 금형에 대해 플랫 컷이 이루어졌는지 확인하십시오. 마지막으로, 캡이 열린 상태로 주사기 몰드 EOR 튜브 및 기타 필요한 재료를 생물 안전 캐비닛에 내장된 살균 광원 아래에 30분 동안 놓아 멸균합니다.
멸균이 완료되면 실험 장비의 멸균 후 세포 준비를 진행합니다. 후드에서 작업하고 mical type cross linking에 사용되는 고분자에 sterile TEA를 추가하고 자유 라디칼 가교에 사용되는 고분자에 sterile PBS를 추가합니다. 펜던트 부분 튜브와 와류에 일치하는 버퍼를 추가합니다.
펜던트 부분을 펩타이드의 INE 그룹의 티올을 통해 알킬화 히알루론산에 결합하여 펜던트 부분을 폴리머에 부착하고 폴리머 용액에 첨가하고 param으로 밀봉하기 위해 펜던트 부분을 용해시키십시오. 간단히 말해서, 소용돌이와 혼합으로 섭씨 37도에서 배양합니다. 세포를 준비하는 동안 펜던트 부분이 부착되는 동안 PBS로 세척하여 캡슐화된 트리스, 인간 중간엽 줄기세포 또는 HMC가 될 세포를 준비합니다.
그런 다음 실온에서 1분 동안 트립신으로 배양하고 트립신을 37도에서 5분 더 배양합니다. 그런 다음 HMSC 성장 배지를 추가하여 트립신을 중화하고 플레이트 표면에서 세포를 분리합니다. 혈류 세포 분석기로 세포를 계수합니다.
계수된 세포를 각 젤 세트에 대해 적절한 수를 포함하는 부분으로 분리합니다. 밀리리터당 1,000만 개의 세포 밀도를 가진 50마이크로리터 겔 3개 세트의 경우 150만 개의 세포를 개별 원뿔형 튜브로 분리합니다. 타이밍 때문에 개별 세트에 4개 이상의 젤을 준비하지 마십시오.
다음으로 500 RCF에서 6분 동안 세포를 원심분리합니다. 세포가 회전하는 동안 실온에서 mical edition 가교를 위한 중합 혼합물을 준비합니다. 적절한 농도를 달성하기 위해 가교제에 완충액을 추가합니다.
광으로 시작된 자유 라디칼 가교의 경우, 이전에 준비된 I 2 9 5 9 용액을 고분자 용액에 첨가합니다. 0.05%weight의 마지막 개시제 농도를 위한 총 젤 세트 부피의 10%에. 이제 세포와 중합 혼합물은 하이드로겔에 캡슐화할 준비가 되었습니다.
먼저 원심분리기 셀에서 스내트(snat)를 흡인합니다. 초기 흡인 후 액체가 가라앉을 때까지 기다렸다가 다시 흡인하여 세포 펠릿 Resus를 방해하지 않고 가능한 한 많은 매체를 제거합니다. 기포를 방지하기 위해 고분자 용액으로 세포 펠릿을 현탁시킵니다.
용액을 약 10회 위아래로 천천히 피펫팅하며, 이는 세포를 고르게 분포시키기에 충분해야 합니다. mical type 추가 반응의 경우, 넓은 오리피스 피펫 팁을 사용하여 적절한 부피의 가교제 용액을 폴리머 셀에 첨가합니다. 혼합. 피펫을 원하는 개별 젤 부피로 설정합니다.
용액을 위아래로 피펫팅하여 균질화하고 Eloqua를 주사기 팁 몰드에 넣습니다. 세포의 균일한 분포를 보장하고 가교를 위해 배양 후드에서 10-30분 동안 배양할 수 있도록 단계를 신속하게 수행합니다. 빛을 위해 개시된 유리기 교차 결합.
적절한 부피를 주사기 팁 몰드에 분취합니다. 주사기를 자외선에 노출시켜 365나노미터에 10분 동안 노출시키면 근본적으로 가교됩니다. 센티미터 제곱 당 4 밀리와트의 자외선은 ACRL 기능성 폴리머에 일반적입니다.
UV 광선에 노출되기 전에 세포 침강을 최소화하기 위해 단계를 빠르게 수행하십시오. 가교 후 배양 및 분석을 위한 배지가 들어 있는 조직 배양 플레이트의 웰에 겔을 주입합니다. 하이드로겔의 가교 결합도 순차적으로 수행될 수 있습니다.
먼저, 기능성 염료 메톨화 된 루민을 겔의 최종 농도 20 나노 몰에 첨가합니다. 염료는 겔의 근본적으로 가교 된 영역에 우선적으로 통합되기 때문에 패터닝을 시각화하는 데 도움이됩니다. 그런 다음 마이크 유형 중합 반응으로 시작하여 다음에 대한 이론적 가교의 일부를 생성합니다.
자유 라디칼 가교는 Adobe Photoshop 또는 Illustrator와 같은 프로그램에서 디자인하고 투명 마스크에 직접 인쇄 한 마스크를 사용해야합니다. 마스크 치수는 원형 주사기 상단과 일치해야 합니다. 멸균된 핀셋을 사용하여 멸균 마스크를 젤 표면에 직접 바르고 빛에 노출시켜 젤을 교차 연결합니다.
여기에 추가로 표시된 것은 캡슐화 후 1시간 후에 HA 기반 하이드로겔 내의 HMC입니다. 합성된 하이드로겔은 일반적으로 투명하기 때문에 광학 현미경을 사용하여 형태를 위해 세포를 시각화할 수 있습니다. 동일한 세포를 형광 살아있는 사체 염색 키트를 사용하여 캡슐화 후 24시간 동안 생존력을 시각화했습니다.
우리는 살아있는 세포를 검출하기 위해 칼슘 M을 사용하고 죽은 세포에 대한 아테리움 호모다이머를 사용하여 95% 이상의 생존율을 관찰했습니다. 또한 alamar blue assay를 사용하여 세포가 분석 시약을 얼마나 잘 대사하여 색상 변화를 일으키는지에 따라 측정된 세포 증식 수준을 확인했습니다. 세포 염색은 분해 가능한 접착성 HA 기반 하이드로겔 내에서 캡슐화 후 7일 후에 표준 고정 및 투과성 절차를 사용하여 H HMC에 대해 수행되었습니다.
세포 액톤은 플루오레세인(fluorescein)으로 표지된 핀(phin)과 dpi로 억제된 핵을 사용하여 볼 수 있습니다. cullin에 대한 면역염색은 하이드로겔 매트릭스 내 국소 접착을 시각화하는 데 사용됩니다. 조직학적 염색은 표준 프로토콜 radicically polymerized HMSC 캡슐화된 HA 하이드로겔을 사용하여 하이드로겔의 탈수, 파라핀 포매 및 절단에 따라 수행됩니다.
배양에서 일주일 후, 핵을 표시하는 헤마트 토인과 결합 조직 A를 표시하는 ASIN과 글리코사미노글리칸에 대한 파란색 염색으로 염색했습니다. 실시간. PCR은 캡슐화된 줄기세포의 분화를 정량화하는 데 사용됩니다.배경을 뺀 후, 관심 유전자의 발현 수준은 구성적으로 활동적인 하우스키핑 유전자인 수동 참조 신호와 비교하여 역치 형광에 도달한 주기 수에 의해 결정됩니다. 지금까지 세포를 3D 하이드로겔로 캡슐화하고 겔에서 세포의 거동을 연구하는 방법을 보여드렸습니다.
이러한 절차를 사용할 때는 멸균 완충액 및 시약을 장기간 보관하거나 살균 UV 램프로 멸균하여 완전한 멸균 물질을 보장하는 것이 중요합니다. 그게 다야. 씻어 주셔서 감사하고 실험에 행운을 빕니다.
이 기사는 합성 하이드로젤 내부에 세포를 3D로 캡슐화하는 프로토콜을 제시하며, 교차 연결 및 세포 행동 평가 방법을 자세히 설명합니다.
3D hydrogel encapsulation enables physiologically relevant cell culture models that improve predictive confidence in early-stage target validation and mechanistic de-risking. By mimicking native tissue microenvironments, this approach supports more translatable assessments of stem cell behavior, differentiation, and response to bioactive cues. It addresses a key discovery-stage challenge: reducing biological ambiguity when evaluating therapeutic candidates in preclinical workflows.
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical evaluation, particularly for modalities requiring assessment of cell-matrix interactions and differentiation potential.