애벌레의 모니터링 심장​​ 기능 Drosophila melanogaster 생리 연구

초파리(Drosophila)는 심장의 발달과 기능 및 그 기초가 되는 박동조절기(pacemaker) 활성 연구에 유전적으로 매우 유용한 모델입니다. 본 절차에서는 온전한 상태 및 해부된 상태의 유충 표본을 제작하는 방법과 심박수를 모니터링하는 방법을 보여줍니다. 해부된 표본을 이용하면 세포 외 또는 세포 내 전위를 기록하여 이온 통로 기능을 추가로 분석할 수 있습니다.

안녕하세요, 켄터키 대학교 생물학과 교수 로빈 쿠퍼입니다. 오늘은 제 학생들인 앤 쿠퍼, 카일라 라이먼, 맷 워드, 이스터 보쿠와 함께 초파리 유충의 심박수를 모니터링하는 다양한 절차를 보여드리겠습니다. 다음의 비구속 방법은 유충을 하나의 초점 평면 내에서 시각화하기 때문에 '개미 농장(ant farm)' 방식이라고 불립니다.

유충을 가장 잘 관찰하기 위해, 1 cm x 0.5 cm 직사각형 영역에서 최적의 공간 분해능과 배율을 얻을 수 있도록 2배로 배율의 대물렌즈와 0.5배로 튜브 렌즈가 장착된 실체 현미경을 사용하십시오. 접안렌즈 마운트에 장착된 카메라를 통해 사진과 영상을 기록할 수 있습니다. 이 방법을 시작하려면 두 개의 유리 슬라이드 사이에 유충과 얇은 먹이 층을 함께 넣어 샌드위치 형태로 배치하십시오.

슬라이드는 네 면의 플라스틱 스페이서를 사용하여 1~1.5 mm 간격으로 고정합니다. 유충의 머리가 계속 아래쪽을 향하도록 준비물을 20~45도 사이로 몇 분 동안 기울입니다. 심장 박동을 관찰하기 위해 심장 또는 두 개의 기관이 가장 잘 대비되도록 현미경 거울을 조정합니다.

글루법(glue method)은 유리 슬라이드 위에 유충을 고정하기 위한 영구 마운트 방식입니다. 글루법을 시작하려면, 깨끗한 커버슬립을 유리 슬라이드 위에 놓으십시오. 커버슬립의 한쪽 모서리에 순간접착제를 소량 떨어뜨립니다.

다음으로, 유충을 물로 헹굽니다. 과잉 공급된 먹이를 제거하기 위해 조직지나 페이퍼 타월의 모서리로 액체를 흡수시킵니다. 유충이 충분히 헹궈지면, 깨끗한 핀셋으로 조심스럽게 집어 현미경 아래 슬라이드 위의 커버 슬립과 떨어진 곳에 놓으며, 유충의 배 부분이 아래로 향하도록 방향을 잡습니다.

위장 부분에는 미세한 검은색 털과 함께 가로 방향의 희미한 홈이 나 있습니다. 유충의 등 부분이 위를 향해야 하며, 기관(trachea)에 해당하는 두 줄의 레이싱 스트라이프 형태의 무늬가 특징입니다. 접착제 전용 핀셋을 사용하여 슬라이드 끝에 맺힌 접착제를 소량 묻혀 반대편 모서리에 배치합니다.

핀셋 끝부분을 덮을 수 있을 만큼 아주 적은 양만 사용하십시오. 동물을 집어 올려 배 부분이 검은 입쪽을 향하도록 한 상태로 접착제 위에 놓으십시오.

갈고리는 커버슬립의 가장자리나 그 근처에 위치해야 하며, 구강 갈고리와 갈색 나선형 구조가 이에 해당합니다. 접착제에 닿지 않아야 합니다. 유충을 부드럽게 눌러 평평하게 폅니다.

시험 물질을 처리하려면, 주사기를 사용하여 유충의 머리 근처에 작은 방울을 떨어뜨리는 것이 가장 좋습니다. 1분 동안 나선형의 박동 횟수를 세어 심박수를 관찰하십시오. 더 장시간 관찰해야 하는 경우, 유충에게 그 자리에서 먹이를 공급하고 수분을 공급하여 탈수를 방지할 수 있으며, 현미경 하에서 사용할 수 있는 해부판을 만들려면 메스를 사용하여 마그네틱 테이프 조각 중앙에 지름 2cm의 구멍을 뚫고 이를 유리 슬라이드에 부착하십시오.

핀 고정을 더 쉽게 하기 위해 구부린 후 클립에 접착제로 붙인 해부용 핀을 사용하십시오. 해부 과정에서 3단계의 온전한 별 모양 유충(star larvae)을 해부 접시에 놓습니다. 등면이 위로 향하게 하면 큐티클을 통해 기관이 보일 것입니다.

구강 갈고리 양쪽에 핀 두 개를 꽂고, 나선형 구조 양쪽에 추가로 핀 두 개를 꽂습니다. 다음으로, 유충이 건조해지지 않도록 식염수를 첨가합니다. 그런 다음 꼬리 끝부분에 수평 절개를 가하고, 이어 나선형 구조 옆을 따라 동물의 머리 방향으로 세로 절개를 실시합니다.

등쪽 핀 하나를 들어 올려 큐티클 아래에 겁니다. 핀을 사용하여 벌립니다. 체강을 엽니다.

나머지 세 개의 핀에 대해서도 동일하게 반복합니다. 동물을 핀으로 고정하여 개방한 후, 기관이나 심장에 손상을 주지 않도록 주의하며 내장을 제거합니다. 뇌와 일부 지방체를 포함한 일부 구조는 심장에 연결되어 있어, 이를 제거할 때 심장이 손상될 수 있습니다.

박리 후 준비물을 HL three 염분욕에서 3~5분 동안 안정시킵니다. 약물을 심장에 직접 투여하는 동안 이 준비물에서 세포 내 기록 및 전장 기록을 수행합니다. 이 박리 단계의 총 소요 시간은 3~6분입니다. 전기적 페이싱을 수행하려면 먼저 국소 전극을 제작해야 합니다. 유리 전극을 가열 요소 위로 통과시켜 화염 연마를 하고 약 45도 각도로 서서히 구부려 국소 전극을 만듭니다. 실온의 HL three 염분액이 채워진 국소 전극의 팁이 아래를 향하도록 조작기에 장착합니다.

자극기 와이어가 전극 내부의 식염수에 닿아 있는지 확인하고, 자극기의 전원이 꺼져 있는지 확인하십시오. 새로 해부한 심장 표본을 현미경 위에 고정하십시오. 접지 와이어를 식염수에 넣으십시오.

핀을 건드리거나 준비된 샘플을 방해하지 않도록 주의하십시오. 조작기(manipulator)를 사용하여 전극을 식염수 속으로 내리는 동안 전극에 계속 집중하십시오. 전극이 식염수에 들어가면, 전극 팁의 루멘(lumen)이 심장에 평평하게 밀착되어 가볍게 닿도록 배치하십시오.

전극을 배치한 후, 자극기의 주파수를 2 Hz로 설정하고 전압을 최저 설정값으로 맞춥니다. 자극기를 켭니다. 주파수를 약 3 Hz로 조정하고, 심박수가 자극기의 리듬과 일치할 때까지 전압을 천천히 높입니다.

이제 자극기를 통해 리듬을 조절할 수 있습니다. 화합물을 첨가하여 수축이나 전기 전도에 영향을 미치는지 확인할 수 있습니다. 전위 기록(field potential recordings)을 수행하려면, 매크로 패치 기록 전극을 배양액으로 채운 후 복합 현미경의 조절기에 장착하십시오.

전극을 증폭기와 기록 장치에 연결합니다. 마이크로 조작기를 사용하여 현미경에 고정된 해부 표본의 심장 위로 전극의 루멘을 내립니다. 전극 팁으로 심장을 매우 가볍게 터치합니다.

이제 심장의 다른 부위에서 야외 전위를 기록하기 위해 필드 기록을 수행할 수 있습니다. 전극 끝부분을 조심스럽게 들어 올려 조작기로 새로운 영역으로 이동시킨 후, 다시 전극 끝부분의 필드 전위 기록을 실시하십시오. 심장 내 전기 신호의 속도와 지속 시간을 정밀하게 모니터링하여 유생 심근세포의 막전위를 측정하십시오.

먼저, 3 M potassium chloride로 채워진 날카로운 전극의 루멘(lumen)이 심장과 수직에서 약 45도 각도로 평평하게 맞닿았는지 확인하십시오. 적절히 위치가 잡히면, 전극 팁으로 심장을 가볍게 터치한 후 팁을 세포 안으로 톡 쳐서 삽입합니다. 전극이 부러지지 않았다면 다시 사용할 수 있습니다.

세포 내 기록을 통해 활동 전위의 이온적 기초와 전위의 특성 형태를 측정함으로써 이온 채널 돌연변이나 채널 조절제의 영향을 조사할 수 있습니다. 지금까지 심장 기록 방법과 세포 내 및 장 전위 측정 방법을 살펴보았습니다. 이러한 기술을 사용하여 심장의 변화뿐만 아니라 약리학적 조작 및 유전자 변형을 관찰할 수 있습니다.

이 절차를 수행할 때, 심장에 부착된 관련 구조물을 잡아당기거나 초점 전극으로 너무 세게 누르지 않는 것이 중요합니다. 또한 접착제 방법을 사용할 때는 입이나 구형 부분이 붙지 않도록 주의하십시오. 이상입니다.

시청해 주셔서 감사하며, 실험에서 좋은 결과 얻으시길 바랍니다.