애벌레의 모니터링 심장​​ 기능 Drosophila melanogaster 생리 연구

초파리(Drosophila)는 심장의 발달과 기능 및 그 기초가 되는 페이스메이커 활동을 연구하기에 유전적으로 매우 적합합니다. 이 실험 절차에서는 온전한 상태와 해부된 상태의 유충 표본을 준비하는 방법과 심박수를 모니터링하는 방법을 설명합니다. 해부된 표본을 이용하면 세포 외 또는 세포 내 전위를 기록하여 이온 채널 기능을 더욱 자세히 분석할 수 있습니다.

안녕하세요, 저는 켄터키 대학교 생물학과 교수인 로빈 쿠퍼(Robin Cooper)입니다. 오늘은 제 학생들인 앤 쿠퍼(Ann Cooper), 카일라 라이먼(Kyla Ryman), 매트 워드(Matt Ward), 이스터 보쿠(Easter Boku)가 Drosophila larvae의 심박수를 모니터링하는 다양한 절차를 보여드릴 것입니다. 다음과 같은 구속하지 않는 방법은 유충을 하나의 초점 평면 내에서 시각화하기 때문에 개미 농장(ant farm) 방식이라고 불립니다.

유충을 가장 잘 관찰하기 위해서는 2배 배율의 대물렌즈와 0.5배 튜브 렌즈가 장착된 실체 현미경을 사용하여 1 cm x 0.5 cm 직사각형 영역에서 최적의 공간 해상도와 배율을 확보하십시오. 사진 및 영상은 접안렌즈 마운트에 장착된 카메라를 통해 기록할 수 있습니다. 이 방법을 시작하려면 두 개의 슬라이드 글라스 사이에 유충과 얇은 층의 먹이를 겹쳐 놓으십시오.

슬라이드는 네 면 모두에 플라스틱 스페이서(spacer)를 사용하여 1~1.5mm 간격으로 유지합니다. 유충의 머리가 계속 아래쪽을 향하도록 준비물을 20~45도 사이로 몇 분간 기울입니다. 심장 박동을 관찰하기 위해 심장이나 두 개의 기관(trachea)이 가장 잘 대비되어 보이도록 현미경 거울을 조절합니다.

글루 방법은 유리 슬라이드 위에 유충을 고정하기 위한 영구 마운트 방법입니다. 글루 방법을 시작하려면, 깨끗한 커버슬립을 유리 슬라이드 위에 올립니다. 커버슬립의 한쪽 모서리에 순간접착제를 소량 떨어뜨립니다.

다음으로, 유충을 물로 헹굽니다. 과잉 먹이를 제거하기 위해 티슈나 페이퍼 타월의 모서리를 사용하여 액체를 흡수합니다. 유충이 충분히 헹궈지면, 깨끗한 핀셋으로 조심스럽게 집어 현미경 아래 슬라이드의 커버 슬립에서 떨어진 곳에 놓으며, 유충의 배 부분이 아래로 향하도록 배치합니다.

위에는 미세한 검은색 털과 함께 가로 방향의 희미한 홈이 나 있을 것입니다. 유충의 등 쪽이 위를 향하게 해야 하며, 기관(trachea)에 해당하는 두 개의 레이싱 스트라이프 모양 선이 특징입니다. 접착제 전용 핀셋을 사용하여 슬라이드 끝에 있는 접착제 방울에서 소량을 덜어 반대쪽 모서리에 묻힙니다.

핀셋 끝부분을 살짝 덮을 정도의 아주 적은 양만 사용하십시오. 동물을 집어 올려 접착제 위에 올리되, 동물이 검은색 구멍을 향해 배 부분이 아래로 가도록 유지하십시오.

갈고리는 커버슬립의 가장자리나 그 근처에 위치해야 하며, 구강 갈고리와 갈색 나선형 구조가 포함되어야 합니다. 접착제에 닿지 않도록 주의하십시오. 유충을 가볍게 눌러 평평하게 폅니다.

시험 물질을 처리하려면 시린지를 사용하여 유충의 머리 근처에 소량의 액적을 분주하는 것이 가장 좋습니다. 나선형 심장이 1분 동안 박동하는 횟수를 세어 심박수를 관찰하십시오. 더 오랜 시간 관찰하려면 유충에게 그 자리에서 먹이를 주고 탈수를 방지하기 위해 습기를 유지하십시오. 현미경 하에서 사용할 수 있는 해부용 플레이트를 만들려면, 메스를 사용하여 마그네틱 테이프 조각 중앙에 지름 2cm의 구멍을 뚫고 이를 유리 슬라이드에 부착하십시오.

고정하기 쉽도록 굽힌 후 종이클립에 접착제로 붙인 해부용 핀을 사용하십시오. 해부 과정 중, 온전한 3단계 star larvae를 해부 플레이트에 놓습니다. 배면이 위로 오게 하면 큐티클을 통해 기관(trachea)이 보여야 합니다.

유충의 구강 갈고리(mouth hooks) 양쪽에 핀 두 개를 꽂고, 나선(spirals) 양쪽에 다시 핀 두 개를 꽂습니다. 다음으로, 유충이 건조해지지 않도록 식염수를 첨가합니다. 그 후, 꼬리 끝부분 쪽으로 가로 절개를 하고, 이어서 나선을 따라 동물의 머리 방향으로 세로 절개를 수행합니다.

등쪽 핀 하나를 들어 올려 큐티클 아래에 겁니다. 핀을 사용하여 벌립니다. 체강을 엽니다.

나머지 3개의 핀으로도 동일하게 반복합니다. 동물을 핀으로 고정하여 개방한 후, 기관이나 심장이 손상되지 않도록 주의하며 내장을 제거합니다. 뇌와 일부 지방체를 포함한 일부 구조는 심장에 부착되어 있어, 이를 제거할 때 심장이 손상될 수 있습니다.

박리 후 준비물을 HL three saline bath에 3~5분 동안 두어 안정시킵니다. 이 준비물에서 세포 내 및 필드 기록을 수행하며, 약물을 심장에 직접 투여합니다. 이 박리 단계에 소요되는 총 시간은 3~6분입니다. 전기적 페이싱을 수행하려면 먼저 초점 전극을 제작해야 합니다. 유리 전극을 가열 요소 위로 통과시켜 화염 연마(fire polish)를 하고 약 45도의 점진적인 굴곡을 만들어 초점 전극을 제작하십시오. 실온의 HL three saline이 채워진 초점 전극을 팁이 아래를 향하도록 조절기(manipulator)에 장착합니다.

자극기 와이어가 전극 내부의 식염수에 닿아 있는지 확인하고 자극기의 전원이 꺼져 있는지 확인하십시오. 새로 박리한 심장 표본을 현미경 위에 고정합니다. 접지 와이어를 식염수에 넣으십시오.

핀을 건드리거나 준비물을 흐트러뜨리지 않도록 주의하십시오. 조작기를 사용하여 전극을 식염수 속으로 내리는 동안 전극에 계속 집중하십시오. 식염수에 진입하면, 전극의 루멘(lumen) 부분이 심장에 평평하게 밀착되어 살짝 닿도록 팁을 배치하십시오.

전극을 배치한 후, 전압을 최저 설정으로 두고 자극기의 주파수를 2 Hz로 설정하십시오. 자극기를 켭니다. 주파수를 약 3 Hz로 조정하고, 심박수가 자극기의 리듬과 일치하도록 전압을 천천히 높이십시오.

이제 자극기를 통해 리듬을 조절할 수 있습니다. 화합물을 첨가하여 수축이나 전기 전도에 영향을 주는지 확인할 수 있습니다. 전위 기록(field potential recordings)을 수행하려면, 매크로 패치 기록 전극에 배양액을 채우고 화합 현미경의 조작기에 장착하십시오.

전극을 증폭기와 기록 장치에 연결합니다. 마니퓰레이터를 사용하여 현미경에 고정된 해부 표본의 심장 위로 전극의 루멘을 내립니다. 전극 팁으로 심장을 아주 가볍게 접촉시킵니다.

이제 심장의 다른 부위에서 전위 변화를 기록하기 위해 현장 기록을 수행할 수 있습니다. 조작기를 사용하여 전극의 팁을 조심스럽게 들어 올려 새로운 영역으로 이동시킨 후, 다시 팁의 현장 전위 기록을 수행하십시오. 심장 내 전기 신호의 속도와 지속 시간을 정밀하게 모니터링하여 유생 근세포의 막전위를 측정하십시오.

먼저, 3 M KCl로 채워진 날카로운 전극의 루멘(lumen)이 수직에서 약 45도 각도로 심장에 평평하게 밀착되었는지 확인하십시오. 적절하게 위치가 잡히면, 전극 팁으로 심장을 가볍게 터치한 후 팁을 세포 안으로 톡톡 쳐서 삽입하십시오. 전극이 부러지지 않았다면 다시 사용할 수 있습니다.

세포 내 기록을 통해 활동 전위의 이온적 기초와 전위의 특징적인 형태를 측정함으로써 이온 채널 돌연변이나 채널 조절제의 영향을 조사할 수 있습니다. 지금까지 심장 기록 방법뿐만 아니라 세포 내 전위 및 장 전위를 측정하는 방법을 살펴보았습니다. 이러한 기술을 사용하여 심장의 변화뿐만 아니라 약물학적 조작 및 유전자 변형을 연구할 수 있습니다.

이 절차를 수행할 때, 심장에 부착된 관련 구조물을 당기지 않도록 하고 초점 전극으로 너무 세게 누르지 않는 것이 중요합니다. 또한 글루 방법을 사용할 때는 입이나 구형 부분이 붙어 닫히지 않도록 주의하십시오. 이상입니다.

시청해 주셔서 감사드리며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.