2009년 11월 4일
Microvolume 샘플 cuvettes이나 모세 혈관의 사용없이 샘플을 유지하기 위해 천연 표면 장력을 사용하는 분광 광도계 시스템 계량입니다. 그들이 측정 수있는 단백질 농도와 속도의 동적 범위는 크게이 방법으로 증가하고 있습니다.
NanoDrop 기술은 광섬유와 표면 장력을 결합하여 핵산 및 단백질과 같은 소량의 샘플을 보관하고 측정합니다. 작은 방울의 샘플을 아래쪽 받침대에 직접 피펫으로 고정합니다. 그런 다음 상부 광학 받침대가 샘플과 맞물려 컬럼을 형성합니다.
받침대는 최적의 경로 길이에 맞게 조정하기 위해 자동으로 이동합니다. 경로 길이가 짧아지면 대부분의 단백질 샘플에 대해 희석을 수행할 필요가 없으며, 몇 초 만에 측정이 이루어지고 VIS 스펙트럼 결과가 표시됩니다. 안녕하세요, 저는 Thermo Fisher Scientific의 NanoDrop 연구소에서 근무하는 Lynn Kalhorn입니다.
오늘 우리는 혁신적인 마이크로 볼륨 분광 광도계를 사용하여 단백질 농도를 측정하는 절차를 보여줄 것입니다. NanoDrop 2000 C.NanoDrop 2000 C 분광 광도계는 큐벳이나 모세관을 사용하지 않고 두 개의 광학 받침대 사이에서 마이크로 부피 샘플을 고정하고 측정하기 위해 액체의 표면 장력에 의존하는 혁신적인 샘플 보존 시스템을 사용합니다. micros 샘플은 검출 표면 바로 위에 배치되고 표면 장력에 의해 광섬유 끝 사이에 액체 컬럼이 생성됩니다.
이 액체 컬럼은 수직 광학 경로를 형성합니다. 크세논 플래시 램프는 광원을 제공하고 선형 CCD 어레이를 사용하는 분광계는 샘플을 통과하는 빛을 분석하는 데 사용됩니다. 시스템에서 큐벳과 같은 기존 격납 장치를 제거하면 몇 가지 이점이 있습니다.
측정을 위해 매우 적은 양의 샘플이 필요합니다. 1-2마이크로리터 청소는 실험실용 와이프로 광학 표면을 닦기만 하면 되며, 경로 길이는 측정 중에 실시간으로 자동으로 변경됩니다. 또한 경로 길이를 줄이면 더 높은 농도를 측정할 수 있으므로 대부분의 단백질 샘플에 대해 희석을 수행할 필요가 효과적으로 제거됩니다.
동역학 연구와 같이 수의사가 필요한 경우, NanoDrop 2000 C는 동일한 분광 광도계에서 수의사 옵션을 제공합니다. 이 프로토콜의 경우 마이크로 볼륨 페데스탈 옵션을 사용하여 단백질 농도를 결정합니다. 단백질 A 2 80 방법은 트립토판 티로신 및 페닐 알라닌 잔기 또는 시스테인 시스테인 디스 설파이드 결합을 포함하고 280 나노미터에서 흡광도를 나타내는 정제된 단백질에 적용할 수 있습니다.
이 절차를 시작하려면 메인 메뉴에서 protein A two 80 application을 선택하십시오. 파장 확인 창이 나타나면 암이 내려갔는지 확인하고 드롭다운 목록에서 측정할 샘플 유형을 선택합니다. 기본 설정은 1 ABSORBENCE가 1밀리리터당 1밀리그램과 같은 대부분의 알려지지 않은 단백질 혼합물에 권장됩니다.
이전에 특성화된 정제된 단백질을 측정하는 경우 질량 흡광 계수 또는 몰 흡광 계수를 입력할 수 있습니다. 단백질 농도를 보다 정확하게 측정하려면 색상 코드 상자 옆에 있는 드롭다운 목록에서 농도 단위를 선택하십시오. 그런 다음 공백을 설정합니다.
적절한 완충액을 사용하여 단백질이 현탁된 완충액을 사용하는 것이 중요합니다. 사용되는 완충액은 pH가 동일하고 샘플 용액과 유사한 이온 강도여야 합니다. 서로 다른 단백질 간의 표면 장력이 가변적이기 때문에 적절한 컬럼 형성을 보장하기 위해 2마이크로리터의 샘플을 로딩하는 것이 좋습니다.
부하하려면 저유지량 피펫 팁을 바닥 받침대 표면에 접촉하면서 용액을 배출하여 용액이 피펫 팁 외부에 부착되는 것을 방지하고 전체 샘플보다 적은 양을 배출하여 분출 및 기포 유입을 방지하십시오.ample. 샘플이 로드되면 암을 내리고 블랭크를 클릭합니다. 블랭킹이 완료되면 아래쪽 및 위쪽 받침대에서 블랭크 용액을 닦아냅니다.
측정을 위해 부분 표본을 채취하기 전에 건식 실험실 와이프를 사용하여 샘플이 균질한지 확인하는 것이 중요합니다. 유체에 미세 기포가 유입되지 않도록 중간 수준의 RPM을 사용하여 부드럽게 와류를 사용하여 샘플을 부드럽지만 철저하게 혼합합니다. 해당 필드에 샘플 ID를 입력합니다.
첫 번째 샘플의 2마이크로리터를 로드합니다.amp블랭크에 대해 이전에 표시된 대로 암을 내리고 측정을 클릭합니다.측정이 완료되면 샘플을 하단 및 상단 받침대에서 닦습니다. 건식 실험실용 와이프를 사용하여 각 측정에 대해 2마이크로리터의 새로운 샘플 분취량을 사용하여 동일한 방식으로 다른 모든 샘플을 측정합니다. 보푸라기가 없는 일반적인 실험실 와이프는 종종 측정 사이에 광학 받침대를 청소하기에 충분합니다.
호환되지 않고 사용해서는 안 되는 유일한 용매는 불화수소산 용액이며 계면활성제를 함유한 시약은 시간이 지남에 따라 측정 받침대 표면을 조절하지 못해 샘플 액체 컬럼의 형성을 방지할 수 있습니다. 아래쪽 받침대에 있는 물방울이 평평해지는 것은 광학 표면이 재조정하기에 조건이 없어진다는 것을 나타냅니다. 받침대 표면은 실험실용 와이프를 사용하여 강력하게 버프하거나 지시에 따라 NanoDrop 받침대 재생 화합물 PR one을 사용하는 것이 선호됩니다.
샘플이 특성화되지 않은 단백질 용액, 세포 용해물 또는 조단백질 추출물인 경우 NanoDrop 2000 C에서 사용할 수 있는 사전 구성된 비색 방법 중 하나를 사용하는 것이 좋습니다. 이러한 비색 방법에는 BCAP 60 Bradford 및 Lowy 분석이 포함됩니다. BCA 분석은 여기에서 시연됩니다. BCA 분석에 필요한 시약은 Thermos Scientific 피어스 환원제 호환 키트 BCA, 시약 A, B, C, A, 시약 B 및 소 혈청 알부민 표준물질에 포함되어 있습니다.
당사의 표준은 pierce BCA 문헌을 참조하여 귀하의 상황에 적합한 분석 표준을 결정하기 때문에 pierce의 사전 희석 알부민 세트를 사용할 것입니다. 시약을 준비하려면 먼저 알려지지 않은 모든 단백질과 단백질 표준물질을 실온에서 평형을 이루고 부드러운 와류로 철저히 혼합합니다. 유체에 미세 기포가 유입되지 않도록 중간 수준의 RPM을 사용하십시오.
거품은 판독값에 부정적인 영향을 미칠 수 있기 때문입니다. 이 예에서 B.In 시약 A를 50:1 비율로 사용하여 측정할 표준 및 샘플에 대해 충분한 새로운 작업 시약을 준비하고, 참조 5개 표준물질과 6개 샘플을 커버하기 위해 3밀리리터의 작업 시약을 준비합니다. 일반 BCA 분석은 더 넓은 동적 범위를 포괄하고 20:1 시약 대 단백질 비율을 사용하는 반면, 마이크로 BCA 분석은 1:1 시약 대 단백질 비율을 사용하여 더 민감하고 더 좁은 동적 범위를 갖습니다.
우리는 정기적인 BCA 분석을 수행하기 때문에 샘플에 대한 작업 시약을 20:1 비율로 준비할 것입니다. 모든 샘플과 표준물질을 처리할 수 있는 충분한 튜브와 함께 각 튜브에 190마이크로리터의 작업 시약을 추가합니다. 다음으로, 시약이 들어있는 각 튜브에 10 마이크로 리터의 표준 또는 샘플을 추가합니다.
부드러운 소용돌이로 잘 섞습니다. 튜브를 섭씨 37도에서 30분 동안 배양합니다. 배양 후 약 10분 동안 반응이 실온과 평형을 이루도록 합니다.
protein A two 80 분석법과 달리, 단백질 BCA 분석법은 시료 단백질 농도를 측정하기 전에 표준 곡선을 생성해야 합니다. 표준 곡선을 생성하려면 먼저 메인 메뉴에서 단백질 BCA 분석법을 선택합니다. 파장 확인 창이 나타나면 암이 내려갔는지 확인합니다.
오른쪽 창 테이블에 각 표준 농도에 대한 값을 입력합니다. 이 소프트웨어는 참조 및 최대 7개의 추가 표준을 허용합니다. 기준 및/또는 표준은 반복실험으로 측정할 수 있습니다.
적절한 버퍼를 사용하여 공백을 설정합니다. 컬러 메트릭 분석의 블랭크는 일반적으로 탈이온화됩니다. 물 피펫으로 2 마이크로 리터의 물을 바닥 받침대에 놓고 암을 내립니다.
공백을 클릭합니다. 참조 및 표준물질의 모든 후속 측정을 다루기 위해 하나의 블랭크만 필요합니다. 단백질이 없는 작동 시약과 완충액으로만 구성된 2마이크로리터의 Eloqua를 하부 받침대에 피펫팅하여 참조를 설정합니다.
암을 내리고 측정을 클릭합니다. 표준물질 탭에서 원하는 표준물질을 강조 표시하고 원하는 표준물질의 2마이크로리터를 하단 받침대에 피펫팅합니다. 암을 내리고 측정을 클릭합니다.
모든 표준에 대해 이 프로세스를 반복합니다. 표준 원곡선을 보려면 표준 원곡선 보기를 클릭합니다. 모든 표준물질을 측정한 후 샘플 버튼을 클릭합니다.
샘플 ID를 입력하고 2마이크로리터의 샘플을 하단 받침대에 로드한 다음 측정을 클릭합니다. 각 측정에 대해 새로운 2마이크로리터 샘플 분취액을 사용해야 합니다. 측정이 완료되면 건식 실험실 와이프를 사용하여 하단 및 상단 받침대에서 샘플을 닦아냅니다.
그런 다음 샘플의 최종 농도가 표준 곡선을 사용하여 자동으로 계산됨에 따라 결과를 얻습니다. 단백질 농도를 측정하는 두 가지 방법을 보여주었는데, 두 번의 80 측정을 직접 하거나 마이크로 볼륨 NanoDrop 2000 C 분광 광도계를 사용하여 간접 색상 측정 방법을 각각 사용했습니다. 그게 전부에요.
시청해 주셔서 감사합니다.
NanoDrop 2000 C 분광광도계는 혁신적인 기술을 활용하여 전통적인 쿠벳 없이 단백질 및 핵산의 마이크로 볼륨 샘플을 측정합니다. 이 방법은 측정 속도와 동적 범위를 향상시켜 효율적인 단백질 농도 결정을 가능하게 합니다.
Microvolume protein quantification addresses the challenge of limited sample availability in early-stage discovery, enabling precise target validation with minimal material. The NanoDrop 2000c enhances predictive confidence by delivering rapid, reproducible concentration data without dilution, supporting go/no-go decisions in lead identification. Its real-time path length adjustment and broad dynamic range improve assay standardization across discovery workflows.
The NanoDrop 2000c fits within the discovery continuum from early target validation through lead identification to preclinical evaluation, supporting consistent protein quantification across stages.