Murine 배아 줄기 세포로부터 조혈 줄기 세포의 유도

가장 먼저 수행할 작업은 합류(confluent) 상태의 T 25 플라스크에 담긴 umsl을 준비하는 것입니다. 우선 PBS로 세척한 후, Trypsin을 몇 방울 첨가하고 수 분 동안 그대로 둡니다. 이제 세포들이 플레이트에서 떨어져 나오는 것을 확인할 수 있으며, 준비가 거의 완료되었습니다.

이제 트립신 처리된 세포를 수집하겠습니다. 콜로니 덩어리를 분해하여 UN 플레이트에 옮기기 위해 트립신 처리된 세포를 잠시 동안 파이펫팅하는 것이 좋습니다. 그리고 이를 인큐베이터에 약 30분에서 45분 동안 둡니다. 이제 세포를 수집하기 위해 원심 분리한 후, 상층액을 흡입하겠습니다.

이제 수 분 후에 재현탁하여 세포 수를 측정하겠습니다. 세포를 재현탁한 후 수를 측정하였으며, 이제 일부 분취액을 취해 50 mL로 희석하겠습니다. 이는 세포의 상태를 확인하기 위해 한 방울당 100개의 세포가 들어가도록 적절한 농도를 맞추기 위함입니다. 이제 준비된 리저버가 있습니다.

다시 한번 가볍게 흔들어 준 다음, 이 용액들을 리저버에 붓습니다. 좋습니다, 이미 프로그래밍이 되어 있습니다. 됐습니다.

이제 꽤 곧게 펴졌습니다. 뒤집어서 잠시 놓아둡니다. 플레이트를 몇 개마다 한 번씩 살짝 기울여서 내용물이 약간 섞이도록 합니다.

좋습니다, 이렇게 다섯 개의 플레이트가 준비되었습니다. 이제 이것들을 인큐베이터에 넣겠습니다. 이것들은 우리가 이틀 전에 준비한 현탁 방울(hanging drops)입니다.

따라서 수집을 위해 플레이트를 흔들어 방울들을 모읍니다. 모든 것을 수집하되, EV가 너무 많이 손상되지 않도록 부드럽게 진행하겠습니다. PBS 5~6 mL를 취해 플레이트를 세척합니다. 그런 다음 이를 최소 10분 동안 방치하면 EV가 중력에 의해 침강합니다.

EBS가 안정적으로 가라앉은 것을 육안으로 확인한 후, 상층액의 대부분을 제거합니다. 이때 세포층이 흐트러지지 않도록 완전히 모두 제거하지는 않습니다. 이제 6일째까지 배양하며 흔들어 줍니다. 이것들은 6일 전로 배아줄기세포로부터 준비된 배아체들로, 보통 플레이트를 가볍게 회전시켜 수집합니다.

플레이트를 회전시키면 엣지(eds)가 디시 중앙으로 모이게 되어 교정하기가 조금 더 수월해집니다. 이제 엣지가 중력에 의해 튜브 바닥으로 가라앉도록 둡니다. 그런 다음 배지를 제거하고 10~12 mL의 PBS로 한 번 세척합니다. 이제 잠시 기다리겠습니다.

이제 P를 제거하겠습니다. 효소 혼합물 250 µL와 1 mM을 첨가한 후, 37 °C 항온 수조에 넣습니다. 그리고 가끔, 두어 번 정도 튜브를 톡톡 쳐서 섞어주는데, 이는 EDTA가 가라앉기 때문입니다. 이제 gpro에서 제공하는 효소가 포함되지 않은 세포 해리 버퍼를 준비했습니다.

각 튜브에 이 용액을 약 8 mL씩 추가합니다. 그런 다음 5 mL 피펫으로 반복해서 섞어 세포를 분리합니다. 반복적으로 섞어 분리하면서 용액이 매우 탁해질 것입니다. 이는 세포가 배지 속으로 분산되고 있다는 시각적 신호입니다. 이제 Trypan blue 배제법으로 세포 수를 측정하겠습니다. 감염 실험을 수행하거나 MOI를 계산하려는 경우, 세포 수를 측정하는 것이 매우 중요합니다.

따라서 적절한 농도의 바이러스, 배지, 세포, 그리고 황산단백질을 혼합하여 대량으로 준비하겠습니다. 그리고 다시 한번 말씀드리지만, 저는 세포가 부유 상태에서 벗어나는 것에 매우 민감하므로 세포 상태를 확실히 확인합니다. 그래서 항상 소량의 용기를 사용하며, 튀는 현상이 너무 많이 발생하지 않도록 주의하면서 2,500 rpm으로 원심 분리합니다.

이제 10일 차 세포를 수집하겠습니다. 모든 세척액은 따로 보관합니다. 이전에는 PI(프로피디움 요오드화물)를 사용했으나, 7-AAD는 밝기가 덜하기 때문에 다른 채널로의 간섭이 적어 훨씬 더 깨끗합니다.

이제 변수를 가져오겠습니다. 이는 볼륨으로 인해 니들 내에서 손실이 발생하는 것을 방지하는 좋은 방법입니다. 저는 Boston 어린이 병원의 George Families Life Attorney에서 박사후 연구원으로 재직 중인 Shannon McKinney Freeman입니다.

오늘은 마우스 배아줄기세포로부터 이식 가능한 세포군, 즉 조혈 시스템의 이식 가능한 세포군을 유도하는 방법에 대해 알아보겠습니다. 이 실험을 수행하는 이유는 무엇일까요? 이 시스템을 사용하면, 우선 치사량의 방사선 조사 후 마우스를 회생시키고, 유기체의 수명 동안 말초 혈액의 모든 계통에서 조혈 시스템을 재구성할 수 있는 조혈줄기세포 활성을 가진 세포군을 배아줄기세포로부터 유도할 수 있다는 점이 입증되었기 때문입니다.

이것이 바로 해당 프로토콜이 개발된 이유입니다. 이제 저희는 이렇게 유도된 확장 세포군 내에서 실제 조혈모세포 활성을 매개하는 세포군의 표현형을 이해하기 위해 추가 실험을 진행하고 있습니다. 왜냐하면 저희는 이 세포군이 매우 이질적이라는 점과, 실제로 마우스를 회복시키는 세포는 이 세포군 내에서 극도로 희귀하다는 점을 알고 있기 때문입니다.

따라서 우리는 이 세포의 표현형을 기본적으로 정의하여, 매우 이질적인 세포들로부터 이를 정제하고자 합니다. 그런 다음, 골수 전체에서 유래한 실제 조혈모세포와 기능적으로 어떻게 비교되는지 이해하는 데 가장 큰 관심을 두고 있습니다. 발달 과정에서 동일한 재구성 능력을 갖추고 있는지, 그리고 성인 골수 HSC를 반영하는 것으로 보이는지 확인하고자 합니다.

또는 아마도 조혈 줄기세포와 더 비슷할 수도 있습니다. 초기 발달 단계의 세포를 GM이나 태아 간에서 찾을 수 있을 것입니다. 이것이 궁극적으로 우리가 이해하려는 바이며, 이러한 질문들을 해결하고자 하는 이유는 이 프로토콜이 우리가 관심을 가지고 있는 인간 배아 줄기세포를 이용한 유사한 연구에 정보를 제공하기를 원하기 때문입니다.

또한 우리는 수학적 시스템을 통해 학습한 정보가 향후 실험들에 큰 도움이 될 것이라고 생각합니다. 몇 가지 이유가 있을 것 같습니다. 우선, 이것은 훌륭한 in vitro 모델이며, 발달 과정에 대한 훌륭한 in feature 모델이기도 합니다.

우선 우리는 조혈모세포의 발달 과정을 이해하고자 합니다. 따라서 이는 이소성 유전자 발현을 매우 최소한으로 구현하여 이러한 요인들이 조혈모세포 발달에 어떤 영향을 미치는지 살펴볼 수 있는 훌륭한 시스템입니다. 이는 기초 과학 관점에서 매우 유용합니다.

하지만 궁극적으로 저희는 인체 세포로부터 이식 가능한 대사 줄기세포를 유도하여 임상적으로 사용할 수 있는 일종의 세포 기반 치료법을 도출하고자 합니다. 하지만 그것은 아마도 미래의 일이 될 것입니다. 사실 저희는 세포 자체를 유도하는 것보다 더 어려운 부분이 있다는 것을 발견했습니다. 세심한 실험을 통해, 유도된 세포가 수용 동물 내에서 재구성이 되지 않아 어려움을 겪었던 시기가 있었음을 확인했습니다.

그리고 우리가 결과적으로 발견한 점은 수혜자의 제거(ablation) 과정에 매우 세심한 주의를 기울여야 한다는 것이었는데, 이는 이 세포들이 능력이 없기 때문입니다. 일반적으로 골수 유래 HSC를 이용해 마우스 이식을 수행할 때, 마우스를 처리하기 위해 10 또는 11 Gy의 방사선을 조사하며, 골수 HSC는 동물들을 회복시킬 능력이 충분합니다. 하지만 우리가 확장시킨 이 세포 집단은 그렇게 높은 선량의 방사선으로부터 동물을 회복시킬 능력이 없다는 것이 밝혀졌습니다.

따라서 우리는 동물의 크기에 주의를 기울이며 조사 선량을 매우 세심하게 조절해야 했습니다. 동물의 크기가 너무 큰 상태에서 동일한 선량을 사용하면 효과적으로 절제되지 않는다는 것을 발견했기 때문입니다. 하지만 반대로 동물에게 충분한 조사를 하지 않으면, 세포가 더 강한 저항성을 가진 숙주와 경쟁할 수 없게 됩니다.

결국 이것이 주요 변수라는 점을 파악하여 세포의 ab 활성을 관찰하는 데 어려움이 있었다는 것을 알게 되었고, 조사 선량을 적정화하며 동물의 연령과 체중이 매우 중요하다는 사실을 깨달았을 때 비로소 실험 결과가 매우 재현성 있게 나오기 시작했습니다. 저희가 발견한 것은 약 20g, 즉 15~20g 정도의 동물을 사용하여 9.25 gray로 절제했을 때, 이 세포들이 마우스의 체내 재구성에 필요한 우위를 점할 수 있게 하는 최적의 선량이 된다는 점입니다. 네, 이것이 가장 중요한 변수 중 하나였다고 생각합니다.

또 다른 중요한 사항은 주입하는 세포의 수입니다. 우리는 모델 생물을 방사선 조사하기 위해 이러한 특정 조건을 사용하여 역가를 측정했습니다. 또한 마우스에 주입한 분획되지 않은 이질적 세포 풀의 수에 대해서도 역가를 측정했습니다.

기본적으로 동물을 회복시키기 위해서는 최소 약 200만 개에서 500만 개의 세포가 필요하다는 것을 발견했습니다. 그보다 적은 양을 주입하면 동물들이 회복되지 않습니다. 이는 아마도 이 이질적인 구획 내에서 회복을 매개하는 세포의 희소성과 관련이 있다고 생각합니다.

따라서 저는 가장 중요한 변수가 주입하는 세포의 수라고 생각하며, 사용하는 이식 모델이 무엇이든 세포가 재생하는 데 필요한 이점을 얻을 수 있을 만큼 충분히 처리하되, 세포가 구조(rescue)를 수행할 수 없을 정도로 과하게 처리하지 않는 것이 중요하다고 봅니다. 이러한 요소들이 주요한 변수였습니다.