Name: 전압에 민감한 염료를 사용하여 기니 돼지 장용 네트워크에서 전기 활동의 광학 녹음 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-12-04T17:45:00.000+00:00
Duration: 14 min 23 s
Description: 배우세요 전압에 민감한 염료를 사용하여 기니피그 장신경망에서 전기 활동을 광학적으로 기록하는 방법을. 이 기술은 단일 세포부터 다중 신경절 회로까지 해상도를 조절하여 신경 활동을 실시간으로 관찰할 수 있습니다.

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우리는 우리와 함께 자신의 기술 전문 지식을 공유에 대한 2 광자 영상의 시작 부분에 표시되는 이미지, H. 다카노를 얻기위한 자신의 2 광자 현미경을 사용하는 허용을위한 검찰 쿨터 (들어온다) 감사드립니다.

<ol><li>Johnson, L. eonard R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCosta%2C+Marcello+%22in+Physiology+of+the+Gastrointestinal+Tract%2C+edited+by+Leonard+R%22">in Physiology of the Gastrointestinal Tract, edited by Leonard R</a>. , Raven Press. New York. 1-1 (1987).</li>
<li>Obaid, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+patterns+of+activity+in+an+intact+mammalian+network+with+single-cell+resolution%3A+optical+studies+of+nicotinic+activity+in+an+enteric+plexus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal patterns of activity in an intact mammalian network with single-cell resolution: optical studies of nicotinic activity in an enteric plexus.</a> J Neurosci. 19 (8), 3073-3073 (1999).</li>
<li>Obaid, A. L., Loew, L. M., Wuskell, J. P., Salzberg, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+naphthylstyryl-pyridinium+potentiometric+dyes+offer+advantages+for+neural+network+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Novel naphthylstyryl-pyridinium potentiometric dyes offer advantages for neural network analysis.</a> J. Neurosci. Methods. 134 (2), 179-179 (2004).</li>
<li>Hirst, G. D., McKirdy, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+potentials+recorded+from+neurones+of+the+submucous+plexus+of+guinea-pig+small+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol+%28Lond%29%22%5BJournal%5D)">Synaptic potentials recorded from neurones of the submucous plexus of guinea-pig small intestine.</a> J Physiol (Lond). 249 (2), 369-369 (1975).</li>
<li>Salzberg, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+Methods+in+Cellular+Neurobiology%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Current Methods in Cellular Neurobiology.</a> Barker, J., McKelvy, J. , John Wiley and Sons, Inc. New York. 139-139 (1983).</li>
<li>Salzberg, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ultra-stable+non-coherent+light+source+for+optical+measurements+in+neuroscience+and+cell+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">An ultra-stable non-coherent light source for optical measurements in neuroscience and cell physiology.</a> Journal of Neuroscience Methods. 141, 165-16 (2005).</li>
<li>Obaid, A. L., Nelson, M. E., Lindstrom, J., Salzberg, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+studies+of+nicotinic+acetylcholine+receptor+subtypes+in+the+guinea-pig+enteric+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Biol%22%5BJournal%5D)">Optical studies of nicotinic acetylcholine receptor subtypes in the guinea-pig enteric nervous system.</a> J Exp Biol. 208 (Pt 15), 2981-2981 (2005).</li>
<li>Obaid, A. L., Zou, D. J., Rohr, S., Salzberg, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+recording+with+single+cell+resolution+from+a+simple+mammalian+nervous+system%3A+Electrical+activity+in+ganglia+from+the+submucous+plexus+of+the+guinea-pig+ileum%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Bull%22%5BJournal%5D)">Optical recording with single cell resolution from a simple mammalian nervous system: Electrical activity in ganglia from the submucous plexus of the guinea-pig ileum.</a> Biol. Bull. 183, 344-344 (1992).</li>
<li>Salzberg, B. M., Davila, H. V., Cohen, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+recording+of+impulses+in+individual+neurones+of+an+invertebrate+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Optical recording of impulses in individual neurones of an invertebrate central nervous system.</a> Nature. 246 (5434), 508-508 (1973).</li>
</ol>

이 프로토콜은 두 가지 목표를 염두에두고 작성되었습니다. 첫 번째는 지난 10의 다양한 기술 발전, 전압에 민감한 염료를 사용하는 전기 활동의 광학 녹음 덕분에 그대로의 연결 네트워크를 공부에 대해 가장 강력하고, 안정적이고 저렴한 방법 중 하나가 있으며, 다른 조사를 설득하는 것입니다, 정말 그것은 쉽게 겸손한 자원을 가지고 실험실에서도 구현할 수 있습니다. 두 번째 목표는 두 가지의 연결 plexuses 및 생물 학적 출력의 전기적 동작과 분자 및 세포 이벤트를 상호 연관시킬하는 독특한 실험 모델로 장용 신경계를 촉진하는 것입니다.

<table><tbody><tr><td>Medium 199</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3769</td><td>Earle&amp;rsquo;s salts 포함, L-Glutamine, Phenol Red 및 Sodium Bicarbonate 제외</td></tr><tr><td>Sylgard</td><td>Dow Corning</td><td>184 silicone elastomer kit</td><td></td></tr><tr><td>해부용 곤충 핀</td><td>F.S.T.</td><td>26001-30</td><td></td></tr><tr><td>Dumont 핀셋</td><td>F.S.T.</td><td>11203-23 또는 11200-33</td><td></td></tr><tr><td>Moria MC19/B Pascheff-Wolff 스프링 가위</td><td>F.S.T.</td><td>15371-92</td><td></td></tr><tr><td>실험 중 조직 고정용 핀</td><td>Seirin Corp.</td><td>Seirin Spinex</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase VII</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0773</td><td></td></tr><tr><td>Protease IX</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6141</td><td></td></tr><tr><td>소태아 혈청 (Fetal Bovine Serum)</td><td>Invitrogen</td><td>10439-016</td><td></td></tr><tr><td>PenStrep</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine 100X</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>Nifedipine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Di-4-ANEPPDHQ</td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td>D36802</td><td></td></tr><tr><td>4채널 자극 발생기</td><td>Multi Channel System MCS GmbH</td><td>2000 Series</td><td></td></tr><tr><td>연동 펌프</td><td>Rainin</td><td>2-channel Dinamax RP-1</td><td></td></tr><tr><td>고속 카메라</td><td>RedShirtImaging, LLC</td><td>NeuroCCD-SM</td><td></td></tr><tr><td>1:10 축소기 / 릴레이 렌즈</td><td>Optem, Qioptiq Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>정립 현미경</td><td>Olympus Corporation</td><td>BX61TRF</td><td></td></tr><tr><td>전동 X-Y 이동 장치가 포함된 Gibraltar 고정 스테이지</td><td>Gibraltar, Burleigh Instruments, EXFO, Quebec, Canada</td><td>PSSG--BX2</td><td></td></tr><tr><td>선형 매트릭스 전극</td><td>FHC, Inc.</td><td>주문 제작</td><td></td></tr><tr><td>능동형 진동 절연 테이블</td><td>Halcyonics,Inc., Menlo Park, CA</td><td>Micro 60</td><td></td></tr><tr><td>초저 리플 피드백 안정화 전원 공급 장치</td><td>Kepco, Flushing, NY</td><td>ATE 75-15M</td><td></td></tr><tr><td>열 필터</td><td>Schott AG</td><td>KG-1</td><td></td></tr><tr><td>High-Q 간섭 필터</td><td>Chroma Inc.</td><td>HQ530/50</td><td></td></tr><tr><td>다이크로익 미러</td><td>Chroma Inc.</td><td>565 nm (투과율 50%)</td><td></td></tr><tr><td>롱패스 필터</td><td>Chroma Inc.</td><td>HQ572LP</td><td></td></tr><tr><td>방음 커튼</td><td>Acoustical Surfaces, Inc.</td><td>BSC-25</td><td></td></tr><tr><td>Neuroplex</td><td>RedShirtImaging, LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IDL</td><td>ITT Visual Information Solutions</td><td></td><td></td></tr><tr><td>전용 카메라 컨트롤러가 포함된 고해상도 CCD 카메라</td><td>Hamamatsu Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>고해상도 카메라용 프레임 그래버</td><td>Data Translation</td><td>DT3120K-1</td><td></td></tr><tr><td>고해상도 카메라용 이미징 소프트웨어</td><td>Data Translation</td><td>Global Lab Image/2</td><td></td></tr></tbody></table>

전압에 민감한 염료를 사용하여 기니 돼지 장용 네트워크에서 전기 활동의 광학 녹음

Optical Recording of Electrical Activity in Guinea-pig Enteric Networks using Voltage-sensitive Dyes

장용 신경계 (팔)는 격리 복잡한 행동을 수행하는 능력이 확인된 기능과 자체 네트워크를 포함하고 있습니다. 그 뉴런은 (직경 10-25 μm의) 창자 벽의 별개의 비행기를 역사는 plexuses에 배열되어<sup&gt; 1</sup&gt;; myenteric 신경 얼기는 세로와 원형 근육층 및 원형 근육 층과 점막 사이의 submucous 신경 얼기 사이 찾을 수 있습니다. 이러한 plexuses에 대한 이펙터 시스템 때문에 (상피 운반, 내분비 세포, 면역 요소, 혈관 및 평활근)이 또한 창자 벽에 포함된 있으며, 세미 손상 준비는 여러 반응 경로의 개별 구성 요소를 보존되는 해부하실 수 있습니다. 효과기 시스템의 동작은 콘서트에서 행동 submucous와 myenteric plexuses에 의해 제어됩니다. 따라서, 신경 사이 사이, 그리고 plexuses 간의 통신의 시냅스 상호 작용에 대한 자세한 지식은 정상적인 위장 기능을 이해하는 데 필수적입니다. 팔은 손상 신경계로 하나의 연결 네트워크 및 생리 출력의 전기적 동작과 분자 및 세포 이벤트를 상호 연관 수있는 독특한 실험 모델입니다. 때문에 plexuses의 준 2 차원 조직의 팔은 특히 전압에​​ 민감한 염료를 고용되는 여러 사이트 광 기록 기술을 사용하여 신경망의 학습에 가장 적합합니다<sup&gt; 2,7,8,9</sup&gt;. 우리는 여기서 비교적 새로운 naphthylstyryl - pyridinium 염색 (DI - 4 - ANEPPDHQ)의 사용을 보여주는 것입니다<sup&gt; 3</sup&gt; 매우 낮은 phototoxicity, 국제화의 속도가 느린 속도와 뛰어난 화학적 안정성 등 이전을 통해 여러 장점을 제공. 하위 밀리초 시간 해상도를 허용 카메라와 함께 사용할 경우,이 염료는 우리 100X 확대 ~ 2.5 μm의의 최대한의 공간 해상도로 볼 수의 분야에있는 모든 뉴런의 전기 활동을 모니터할 수 있습니다. 낮은 배율 (10X 또는 20X)에서, 단일 셀 해상도의 희생은 남북 ganglionic 회로의 복잡한를 공개, 관점의 증가에 의해 보상됩니다.

이 프로토콜은 염료가 조정 해상도 등 기니 돼지 장용 신경계의 plexuses으로 손상 신경망에서 전기 활동의 광학 녹음을 활성화하는 방법 전압에 민감한 개념 단일 세포에서 다중 ganglionic 회로 등을 꼽을 수 있습니다.

장 신경계(ENS)는 고립된 상태에서도 복잡한 행동을 수행할 수 있는, 고유의 기능이 정의된 독립적인 네트워크입니다. 이 신경계의 뉴런은...

본 영상에서는 전압 민감성 염료 D-4 ANEPPDHQ를 사용하여 전기적으로 자극된 장 신경계 표본의 박리 및 후속 이미징 과정을 보여줍니다. 안락사시킨 기니피그로부터 소장의 짧은 분절을 채취하고, 광학 기록을 위해 먼저 점막하층을 노출시킨 뒤 최종적으로 근층신경절을 노출시키도록 박리합니다. 초기 고해상도 이미지를 캡처한 후, D-4 ANEPPDHQ로 염색하여 고정된 조직 위에 전극을 배치합니다.전기적 활성을 나타내는 광학적 변화를 고속 카메라로 기록합니다. 고속 이미지 획득 과정 동안 전기 자극을 가합니다. 이후 분석을 위해 고해상도 이미지를 neuro plex를 사용하여 고속 카메라의 픽셀 맵 위에 중첩시킵니다.안녕하세요, 저는 펜실베이니아 대학교 신경과학과 내 세포 광학 연구소(Laboratory of Cellular Optics), 저희가 흔히 loco라고 부르는 곳의 소장 브라이언 살츠버그(Brian Salzberg)입니다. 제 이름은 아날리아 오비데(Analia Obide)이며, 저 또한 세포 광학 연구소의 구성원입니다.오늘은 전압 민감성 염료를 사용하여 온전한 포유류 뉴런 네트워크의 전기적 활동을 기록하는 절차를 보여드리겠습니다. 우리는 이 절차를 통해 '제2의 뇌' 또는 '장 뇌'라고도 불리는 장신경계(enteric nervous system)를 구성하는 두 네트워크 내부 및 네트워크 간의 뉴런 연결성을 연구합니다. 그럼 시작하겠습니다.이소플루린 흡입 마취 후 안락사시킨 150~200g 또는 2~3주 된 Hartley 기니피그의 소장을 적출하여 점막하층 및 장 신경총 표본 준비를 시작합니다. 그 다음, 따뜻하고 산소가 공급된 M1 99 DM 용액으로 내강을 세척하여 장 내부의 내용물을 제거합니다. 극성을 반드시 유지하며 8~10cm 길이의 장 분절을 절단합니다.이를 상온의 M1 99 DM이 담긴 sard 코팅된 10 centimeter 유리 접시로 옮깁니다. 암시야 조명이 설치된 해부 현미경 위에 접시를 놓습니다. 그다음 가위를 사용하여 장간막 경계를 절개하고, 곤충 핀을 이용해 장 분절의 점막 면이 위로 오도록 고정합니다.핀으로 고정한 후 조직이 직사각형 모양을 유지하고 점막 하 신경절(mucosal vii) 열이 규칙적으로 정렬되도록 균일한 장력을 유지하는 것이 매우 중요합니다. 직선형 팁의 미세 듀몬트 핀셋(dumont forceps)을 거의 수평 위치로 잡습니다. 장 분절의 한쪽 끝에서 VII를 잡아 조직의 세로축을 따라 당겨 점막을 벗겨냅니다. 점막 리본을 계속 분리하여 점막 하 신경절과 점막 하 혈관이 포함된 점막 하층을 노출시킵니다.다음으로, 매우 정밀한 가위를 사용하여 원형근 섬유의 방향을 따라 점막하층에 절개를 가합니다. 그런 다음 정밀 핀셋으로 원형근을 밀어내면서 점막하층을 매우 조심스럽게 들어 올립니다. 가위를 이용해 층을 낮추어 종방향 가장자리를 따라 절단합니다.분리가 진행됨에 따라 점막하층을 나머지 준비물로부터 분리하십시오. 이제 첫 번째 절단 부위에서 1.5~3cm 떨어진 지점에서 원형 근섬유의 방향을 따라 두 번째 절단을 수행하여 점막하층 준비물의 최종 크기를 결정합니다. 이렇게 생성된 점막하층 분절은 두께가 30~50 µm이며 거미줄 같은 외관을 보입니다. 이를 신선한 M1 99 DM이 담긴 다른 syl guard 디쉬로 옮기고, 텐션이 가해지지 않도록 부드럽게 핀으로 고정하십시오.그런 다음 배양 접시를 실온의 산소 공급 챔버에 넣어 나중에 사용할 수 있도록 합니다. 이제 원래의 장 분절에서 점막과 점막하층이 제거되고 환상근이 노출된 상태여야 합니다. 이 분절은 이제 근층신경절을 노출시키기 위한 근층신경절 표본 제작에 사용됩니다.직선 팁의 정밀 핀셋을 사용하여 준비물의 양측에서 섬유 다발을 끌어내어 환상근 층을 가능한 한 많이 제거합니다. 노출된 근층신경절은 종근 층 및 그 아래의 CI와 분리할 수 없습니다. 근층신경절 준비물을 산소가 공급된 M1 99 M이 들어 있는 새로운 sard 코팅 접시로 옮깁니다. 그다음 살아있는 근육이 포함된 샘플을 느슨하게 핀으로 고정합니다. 광학 실험 몇 분 전에, 근육 수축을 방지하기 위해 2 µM nefe가 함유된 M1 99 DM이 미리 채워진 더 작은 새로운 syl guard 코팅 접시로 준비물을 옮기고, 주변부에 매우 가는 핀을 여러 개 조심스럽게 배치하여 단단히 고정합니다.장력이 균일하게 분산되고 조직이 실 가드(sil guard) 바닥에 완전히 밀착되었는지 확인하십시오. 이제 조직 준비가 완료되어 생리학적 실험을 수행할 수 있습니다. 유리 바이알에 M1 99 M 내의 2 µM nifedipine이 포함된 5~50 µg/mL 농도의 DAI four A-N-E-P-P-D HQ 표준 용액을 조제하고 알루미늄 호일로 덮어 보관하십시오.스톡 솔루션에서 유래한 에탄올 농도는 Nifedipine이 포함된 M1 99 DM 용액의 0.5% 미만이어야 하며, 준비물을 덮고 있던 해당 용액을 조제된 염색액으로 교체해야 합니다. 조직이 완전히 잠길 정도의 충분한 양의 ladder를 사용하여, 배양 후 실온에서 10분에서 30분 동안 배양하십시오. 챔버의 내용물 전체를 교체하여 산소가 공급된 M1 99 M plus NEFE로 준비물을 세척하십시오.전기 자극 표본의 뉴런 활동에 대한 광학적 기록은 이미지 분할기가 장착된 정립 에피 형광 현미경, 저해상도 정밀 고속 카메라, 고해상도 흑백 카메라, 컴퓨터 제어 자극 발생기 및 마이크로 조작기로 구성된 시스템을 사용하여 수행됩니다. 전체 장치는 능동형 진동 격리 테이블 위에 설치되며, 공기 중 진동을 최소화하기 위해 무거운 방음 커튼과 마일라(Mylar) 지붕으로 둘러싸여 있습니다. 두 카메라의 이미지 획득은 neuro plex와 Global Lab image two 또는 기타 이미지 획득 소프트웨어가 실행되는 단일 컴퓨터를 사용하여 수행할 수 있지만, 본 설정에서는 광학 실험을 시작하기 위해 각각 별도의 카메라를 제어하는 두 대의 컴퓨터를 사용합니다.염색된 팬 샘플이 들어 있는 챔버를 현미경 스테이지 위에 놓습니다. D four A 및 EPPD HQ는 지질 환경에서만 형광을 발하는 막 비투과성 염료이므로, 염색된 장 신경계 표본의 건강한 뉴런은 20 x 이상의 배율로 관찰했을 때 빈 풍선과 같은 모습으로 보여야 합니다. 여기에는 여기용 필터 HQ 5 35 50, 방출용 필터 HQ 5 72 LP 및 5 65 nanometer 이색 거울을 사용합니다.다음으로, 마이크로 매니퓰레이터 컨트롤을 사용하여 조직의 구강 쪽에 멀티 배럴 선형 매트릭스 어레이 전극을 배치하며, 이때 전극이 현미경 대물렌즈에 닿지 않도록 주의합니다. 1cm 범위에 걸쳐 10개의 텅스텐 전극이 분포된 선형 매트릭스 어레이는 여러 개의 독립적인 신경 경로를 자극할 수 있어, 상호 연결된 신경절 회로를 연구하는 데 매우 적합합니다. 하지만 대표 데이터의 경우, 자체 제작한 2리드 자극 전극을 사용하였습니다.기능적 기록을 수행하기 전, 점착성 왁스를 사용하여 챔버의 반대편 끝에 접지 전극을 배치하십시오. 시각화를 돕기 위해 전기 활동을 기록할 영역의 고해상도 흑백 이미지를 획득하십시오. 형광이 어둡게 나타나도록 그레이스케일을 반전시킬 수 있습니다. 컴퓨터 제어 자극 발생기를 사용하여 전류 자극을 가하려면, 먼저 적절한 강도, 지속 시간, 빈도, 자극 횟수 및 광학 데이터 획득 시작 시점 대비 지연 시간을 선택하여 장치를 프로그래밍하십시오.자극이 광학 데이터 수집 범위 내에서 발생하는지 확인하려면, 자극 발생기를 neuro plex 제어 장치로 설정하십시오. 다음으로, neuro plex 내에서 프레임 속도, 프레임 수 및 카메라 게인을 지정하여 수집 파라미터를 설정합니다. 활동 전위의 완전한 정의를 얻으려면 프레임 속도를 최소 1 kHz로 설정해야 합니다.D four A 및 E-P-P-G-H-Q는 탈분극 시 전압 변화에 선형적으로 비례하여 형광이 감소하므로, 활동 전위가 거꾸로 나타나지 않도록 neuro plex 내의 광학 신호 표시를 반전시키십시오. 획득을 시작합니다. 각 기능적 기록을 수행하기 전에 각 시야의 새로운 고해상도 흑백 이미지를 획득해야 함을 기억하십시오.데이터 획득이 완료되면 Neuro Plex를 사용하여 오프라인에서 결과를 분석하십시오. 화면의 페이지 디스플레이(page display) 영역에는 80x80 고속 카메라로 촬영된 준비물의 조해상도 이미지가 개별 프레임으로 표시됩니다. 페이지 모드가 absolute frame일 때, Neuro Plex 디스플레이 명령을 사용하여 두 번째 카메라로 획득한 고해상도 이미지를 조해상도 이미지의 픽셀 맵 위에 중첩하여 표시합니다.이를 위해서는 페이지 모드를 absolute trace에서 traces로 변경하고, 디스플레이 명령 내에서 중첩 이미지를 선택해야 합니다. 마우스를 사용하여 페이지 디스플레이에 표시된 이미지에서 개별 픽셀 또는 픽셀 그룹을 선택하십시오. 이러한 관심 영역의 출력은 트레이스 디스플레이 창에 트레이스로 나타나며, 해당 픽셀에 의해 기록된 광학적 변화의 크기를 시간의 함수로 보여줍니다.고해상도 이미지의 그레이스케일을 반전시키면 트레이스 모드 페이지 디스플레이에서의 시각화가 개선되며, 스티뮬레이터의 아날로그 출력을 함께 표시하는 것을 강력히 권장합니다. 트레이스 디스플레이 창에 포함할 아날로그 출력 채널을 선택하십시오. 이 출력은 실험 중에 가해진 자극의 정확한 타이밍을 나타냅니다.데이터를 동영상으로 보려면, neuro plex 내의 movie 명령어를 사용하여 형광 강도의 최대 및 최소 변화에 맞춰 조정된 의사 색상 척도(pseudo color scales)를 통해 데이터 세트 내의 연속 프레임을 표시하십시오. DIA four A-N-E-P-P-D-H-Q로 염색된 근층간신경총(myenteric plexus) 표본의 신경절을 고해상도 카메라와 60x 대물렌즈로 촬영하였습니다. 데이터 수집 과정에서 표본에 40 hertz의 펄스 5회 열(train)로 자극을 주었습니다.각 펄스의 진폭은 15 milliamps, 지속 시간은 0.5 milliseconds이며, 4개의 관심 영역(ROI)을 설정하고 선택된 영역의 평균 광학 데이터를 표시하는 트레이스를 생성했습니다. 의사색상 프레임 시퀀스에서 신경 활동을 나타내는 막 탈분극의 첫 번째 광학 반응 영역은 노란색에서 빨간색으로 나타납니다. 이 데이터는 자극으로 유발된 활동이 각 신경절의 불연속적인 영역에서 발생하며, 주로 통과 축삭에 의해 전달됨을 나타냅니다. ROI 2, 3, 4는 ROI 1로부터 다양한 거리에 위치한 개별 뉴런을 식별합니다.그림 2는 10배 배율로 정보가 전파될 수 있는 해부학적 경로를 보여주며, 화살표는 특정 근장 신경절을 활성화하기 위해 자극이 이동하는 방향을 나타냅니다. 전압 민감성 염료를 사용하여 전기적 활동을 기록하기 위한 광학 설정의 구성 요소와, 이 기술을 장 신경계에 적용했을 때 현미경 시야 내에서 온전한 두 포유류 네트워크 내부 및 상호 간의 기능적 연결성을 연구할 수 있는 가능성이 어떻게 열리는지 설명하였습니다. 광학 기록 기술을 사용할 때는 세부 사항에 주의를 기울이는 것이 매우 중요합니다.광학적, 기계적, 전기적 노이즈원은 세심하게 제어되어야 하며, 준비된 시료의 상태는 철저하게 유지되어야 합니다. 따라서 광학 기록의 성공을 위해서는 이 프로토콜의 모든 개별 단계를 능숙하게 수행하는 것이 필수적입니다. 이것으로 모든 설명을 마칩니다.시청해 주셔서 감사합니다. 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

여기 게는 stomatogastric의 신경절의 뉴런에 대한 자세한 활동의​​ 신속하고 고해상도 형광 전압에 민감한 염료를 영상에 대한 방법론을 제시한다.

전압에 민감한 염료와 크랩 Stomatogastric 신경절에서 뉴런의 광학 이미징

형광 염료의 역행 전송 해부학 적 투사에 따라 신경 세포의 하위 인구 레이블. 레이블 축삭은 시각적 대상이 될 수...

역행 형광 라벨이 확인 된 신경 세포의 표적 세포 외 단일 단위 기록을 허용<em&gt; 생체 내</em

서브 마이크로 미터 공간과 하위 밀리 초 시간적 해상도 막 잠재적 인 변화의 모니터링을위한 이미징 기술은 설명되어 있습니다. 전압에 민감한 염색의 레이저 여기에 기반을 둔 기술은, axons과 축삭의 민간인 피해, 터미널 수지상 지점, 개인 수지상 쪽의 신호를 측정 할 수 있습니다.

Axons, 수석 및 뇌 슬라이스의 개별 뉴런의 수지상 쪽의 전압에 민감한 염료 기록

이 비디오는 전압 민감성 염료로 염색된 뇌 절편에서 신경 활동의 변화를 관찰하는 절차를 보여줍니다. 염료는 형광 강도를 변경하여 뉴런의 막 전위의 변화를 반영합니다. 전기 자극과 고급 이미징 기술의 적용을 통해 이 프로세스를 통해 VSD 형광을 기반으로 신경막 전위의 실시간 변화를 시각적으로 추적할 수 있습니다.

전압 민감성 염료로 염색된 뇌 절편의 신경 활동에 대한 광학 기록

이 비디오는 생체 외 쥐 결장에서 결장 구심성 신경의 활동을 기록하는 방법을 보여주며, 양쪽 끝에 캐뉼레이션하고 식염수를 주입하여 내강 내압을 증가시키는 방법을 보여줍니다. 압력이 증가하면 신경 신호가 증가하여 자극을 나타냅니다.

생체 외 쥐 결장에서 결장 구심성 신경의 전기생리학적 기록

장 신경계(ENS)는 장 반사를 제어하는 장 벽에 위치한 뉴런과 신경교세포의 네트워크입니다. 이 프로토콜은 Ca2+ 이미징을 사용하여 ENS의 실시간 제제에서 장 뉴런 및 신경교세포의 활동을 기록하는 방법을 설명합니다.

장용 신경계의 제자리 칼슘 이미징에서

전압에 민감한 염료를 사용하여 뇌 조각을 재현하고 안정적으로 광학 기록 하는 방법을 소개합니다. 이 기사에서는 기존의 해마 슬라이스 준비를 사용하여 전압에 민감한 염료 염색 및 광 신호 기록에 대해 설명합니다.

전압에 민감한 염료를 사용하여 뇌 슬라이스의 광자 광자 광기록

이 프로토콜은 다중 섬유 광도 측정 기록을 구현하고 수행하는 방법, 칼슘 독립적 인 아티팩트를 수정하는 방법 및 이중 색상 광도계 이미징에 대한 중요한 고려 사항을 자세히 설명합니다.

자유롭게 움직이는 동물의 신경 활동을 기록하는 다중 섬유 광도 측정법

이 프로토콜은 흡광도 전압에 민감한 염료 및 포토다이오드 어레이를 사용하여 비 형이상무척추동물 종의 단일 세포 분해와 신경 인구 활성을 이미징하는 방법을 제시한다. 이 접근 방식을 통해 하루 동안 이미징 및 분석을 추구할 수 있는 빠른 워크플로우가 가능합니다.

비 트랜스제닉 무척추 동물의 단일 신경 해상도를 가진 네트워크 역학을 기록하기위한 포토다이오드 기반 광학 이미징

여기에서는 수술 방법 및 도구, 수술 후 자기 공명 영상, 청각 피질의 전기 생리학, 임플란트의 전기 화학적 특성 및 사후 면역 화학을 설명하는 minipig 모델에서 연질 경막하 전극 어레이의 장기 성능 및 안전성 평가 방법을 제시합니다.

경막하 연피질검사(ECoG) 어레이 이식 및 Minipig의 장기 피질 기록

배우세요 전압에 민감한 염료를 사용하여 기니피그 장신경망에서 전기 활동을 광학적으로 기록하는 방법을. 이 기술은 단일 세포부터 다중 신경절 회로까지 해상도를 조절하여 신경 활동을 실시간으로 관찰할 수 있습니다.

전압에 민감한 염료를 사용하여 기니 돼지 장용 네트워크에서 전기 활동의 광학 녹음

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