전압에 민감한 염료를 사용하여 기니 돼지 장용 네트워크에서 전기 활동의 광학 녹음

이 비디오에서는 전압 민감성 염료 D4-ANEPPDHQ를 사용하여 전기적으로 자극된 장신경계 표본의 박리 및 후속 이미징 과정을 보여줍니다. 안락사시킨 기니피그에서 소장의 짧은 분절을 채취한 후, 광학 기록을 위해 먼저 점막하층을 노출시키고 최종적으로 근층간신경절을 노출시키도록 박리합니다. 초기 고해상도 이미지를 캡처한 후, D4-ANEPPDHQ로 염색하여 고정된 조직 위에 전극을 배치합니다.

전기적 활성을 나타내는 광학적 변화를 고속 카메라로 기록합니다. 고속 촬영 중에 전기 자극을 가합니다. 이후 분석을 위해 고해상도 이미지를 neuro plex를 사용하여 고속 카메라의 픽셀 맵 위에 중첩시킵니다.

안녕하세요, 저는 펜실베이니아 대학교 신경과학과에 위치한 세포 광학 연구소(Laboratory of Cellular Optics, 줄여서 loco라고 부릅니다)의 소장인 Brian Salzberg입니다. 저는 Analia Obide이며, 저 또한 세포 광학 연구소의 연구원입니다.

오늘은 전압 민감성 염료를 사용하여 온전한 포유류 신경세포 네트워크의 전기적 활성을 기록하는 절차를 보여드리겠습니다. 우리는 이 절차를 통해 '제2의 뇌' 또는 '장 뇌'라고도 불리는 장 신경계(enteric nervous system)를 구성하는 두 네트워크 내부 및 네트워크 간의 신경 연결성을 연구합니다. 그럼 시작하겠습니다.

isof fluorine 흡입 마취 후 참수시킨 150~200g 또는 2~3주령의 Hartley 기니피그에서 소장을 적출하여 점막하층 및 장신경총 표본 준비를 시작합니다. 그런 다음 따뜻하고 산소가 공급된 M1 99 DM 용액으로 관강을 세척하여 장 내부의 내용물을 제거합니다. 극성을 유지하도록 주의하며 8~10cm 길이의 장 분절을 절단합니다.

이를 상온의 M1 99 DM이 담긴 sard 코팅 10 centimeter 유리 접시로 옮깁니다. 암시야 조명이 설치된 해부 현미경 위에 접시를 놓습니다. 그런 다음 가위를 사용하여 장간막 경계를 절개하고, 곤충 핀을 이용해 장 분절의 점막 면이 위로 향하게 고정합니다.

핀으로 고정한 후 조직이 직사각형 모양을 유지하고 점막하 신경절(mucosal vii) 열이 규칙적으로 정렬될 수 있도록 균일한 장력을 유지하는 것이 매우 중요합니다. 직선형 팁이 달린 미세 듀몬 핀셋(dumont forceps)을 거의 수평인 상태로 잡습니다. 장 분절의 한쪽 끝에서 VII를 잡아 조직의 종축을 따라 당기면서 점막을 벗겨냅니다. 점막하 신경절과 점막하 혈관이 포함된 점막하층을 노출시키기 위해 점막 리본을 계속해서 분리합니다.

다음으로, 매우 미세한 가위를 사용하여 원형 근섬유의 방향을 따라 점막하층에 절개선을 만듭니다. 그런 다음 미세 핀셋으로 원형 근육을 밀어내면서 점막하층을 매우 조심스럽게 들어 올립니다. 가위를 아래로 넣어 세로 가장자리를 따라 절개합니다.

분리가 진행됨에 따라 점막하층을 나머지 준비물로부터 분리하십시오. 이제 첫 번째 절단 부위에서 1.5~3cm 떨어진 지점에서 환상근 섬유의 방향을 따라 두 번째 절단을 수행하여 점막하층 표본의 최종 크기를 결정합니다. 이렇게 얻은 점막하층 분절은 두께가 30~50 µm이며 거미줄과 같은 외관을 보입니다. 이를 신선한 M1 99 DM이 담긴 다른 syl guard dish로 옮기고, 장력이 가해지지 않도록 조심스럽게 핀으로 고정하십시오.

그다음 디쉬를 상온의 산소 공급 챔버에 넣어 나중에 사용할 수 있도록 보관합니다. 이제 원래의 장 분절에서 점막과 점막하층이 제거되고 환상근이 노출된 상태가 됩니다. 이 분절을 사용하여 근층간신경절 표본을 제작함으로써 근층간신경절을 노출시킵니다.

직선 팁 미세 핀셋을 사용하여 표본의 양쪽에서 섬유 다발을 당겨 원형근 층을 최대한 제거합니다. 노출된 근장 신경절(myenteric plexus)은 종근 층 및 그 아래의 CI와 분리할 수 없습니다. 근장 신경절 표본을 산소화된 M1 99 M이 담긴 새로운 sard 코팅 접시로 옮깁니다. 그다음 살아있는 근육이 포함된 샘플을 느슨하게 핀으로 고정합니다. 광학 실험 시작 몇 분 전, 근육 수축을 방지하기 위해 2 µM nefe가 함유된 M1 99 DM이 채워진 더 작은 새로운 syl guard 코팅 접시로 표본을 옮기고, 주변부에 매우 가는 핀을 여러 개 조심스럽게 배치하여 단단히 고정합니다.

장력이 균일하게 분산되고 조직이 실 가드(sil guard) 바닥에 완전히 평평하게 밀착되었는지 확인하십시오. 이제 조직 준비가 완료되어 생리학적 실험을 수행할 수 있습니다. 유리 바이알에 M1 99 M 용액과 2 µM nifedipine을 포함하여 5~50 µg/mL 농도의 DAI four A-N-E-P-P-D HQ 스탠딩 용액을 조제하고 알루미늄 호일로 덮으십시오.

스톡 솔루션에서 유래한 에탄올의 농도는 Nifedipine이 포함된 M1 99 DM 용액의 0.5% 미만이어야 하며, 준비물을 덮고 있던 이 용액을 준비된 염색액으로 교체해야 합니다. 조직이 완전히 잠길 만큼 충분한 양의 ladder를 사용하여, 인큐베이션 후 실온에서 10분에서 30분 동안 인큐베이션합니다. 챔버의 내용물을 전체적으로 교체하여 산소 공급이 된 M1 99 M plus NEFE로 준비물을 세척합니다.

전기 자극 표본의 신경 세포 활동을 광학적으로 기록하는 과정은 이미지 분할기가 장착된 정립 에피 형광 현미경, 저해상도 정밀 고속 카메라, 고해상도 흑백 카메라, 컴퓨터 제어 자극 발생기 및 마이크로 조작기로 구성된 시스템을 사용하여 수행됩니다. 전체 장치는 능동형 진동 격리 테이블 위에 설치되며, 공기 전달 진동을 최소화하기 위해 두꺼운 차음 커튼과 마일라(Mylar) 지붕으로 둘러싸여 있습니다. 두 카메라의 이미지 획득은 neuro plex와 Global Lab image two 또는 기타 이미지 획득 소프트웨어가 실행되는 단일 컴퓨터를 사용하여 수행할 수 있지만, 본 설정에서는 광학 실험을 시작하기 위해 각각 별도의 카메라를 제어하는 두 대의 컴퓨터를 사용합니다.

염색된 팬 샘플이 들어 있는 챔버를 현미경 스테이지 위에 놓습니다. D four A와 EPPD HQ는 지질 환경에서만 형광을 발하는 막 비투과성 염료이므로, 염색된 장 신경계 표본의 건강한 뉴런은 20 x 이상의 배율로 관찰했을 때 빈 풍선과 같은 모습으로 보여야 합니다. 이때 여기용 필터 HQ 5 35 50, 방출용 필터 HQ 5 72 LP 및 5 65 nanometer 다이크로익 미러를 사용합니다.

다음으로, 마이크로 매니퓰레이터 컨트롤러를 사용하여 멀티 배럴 리니어 매트릭스 어레이 전극을 조직의 구강측 끝단에 위치시키되, 전극이 현미경 대물렌즈에 닿지 않도록 주의합니다. 1cm 범위에 10개의 텅스텐 전극이 분포된 리니어 매트릭스 어레이는 여러 개의 독립적인 신경 경로를 자극할 수 있어 상호 연결된 신경절 회로를 연구하는 데 적합합니다. 다만, 대표 데이터의 경우 자체 제작한 2리드 자극 전극을 사용하였습니다.

기능적 기록을 수행하기 전, 점착성 왁스를 사용하여 챔버의 반대쪽 끝에 접지 전극을 배치하십시오. 시각화를 돕기 위해 전기적 활동이 기록될 영역의 고해상도 흑백 이미지를 획득하십시오. 형광이 어둡게 나타나도록 그레이 스케일을 반전시킬 수 있습니다. 컴퓨터 제어 자극 발생기를 사용하여 전류 자극을 가하려면, 먼저 적절한 강도, 지속 시간, 빈도, 자극 횟수 및 광학 데이터 획득 시작 시점 대비 지연 시간을 선택하여 장치를 프로그래밍하십시오.

자극이 광학 데이터 획득 범위 내에서 발생하는지 확인하려면, 자극 발생기를 neuro plex 제어 장치로 구성하십시오. 다음으로, neuro plex 내에서 프레임 속도, 프레임 수 및 카메라 이득을 지정하여 획득 파라미터를 설정하십시오. 활동 전위의 전체 정의를 구현하려면 프레임 속도를 최소 1 kHz로 설정해야 합니다.

D four A와 E-P-P-G-H-Q는 탈분극 시 전압 변화에 선형적으로 비례하여 형광이 감소하므로, 신경 활동 전위가 거꾸로 나타나지 않도록 neuro plex 내의 광학 신호 표시를 반전시키십시오. 획득을 시작합니다. 각 기능적 기록을 수행하기 전에 각 시야의 새로운 고해상도 흑백 이미지를 획득해야 함을 기억하십시오.

데이터 획득이 완료되면, Neuro Plex를 사용하여 오프라인으로 결과를 분석하십시오. 화면의 페이지 디스플레이(page display) 영역에는 80x80 고속 카메라로 캡처한 준비물의 조작 이미지가 개별 프레임으로 표시됩니다. 페이지 모드가 absolute frame일 때, Neuro Plex 디스플레이 명령을 사용하여 두 번째 카메라로 획득한 고해상도 이미지를 조작 이미지의 픽셀 맵 위에 중첩시킵니다.

이를 위해서는 페이지 모드를 absolute trace에서 traces로 변경하고, display 명령 내에서 superimposed image를 선택해야 합니다. 마우스를 사용하여 페이지 디스플레이에 표시된 이미지에서 개별 픽셀 또는 픽셀 그룹을 선택하십시오. 이러한 관심 영역(regions of interest)의 출력값은 trace 디스플레이 창에 trace 형태로 나타나며, 해당 픽셀들에 의해 기록된 광학적 변화의 크기를 시간의 함수로 보여줍니다.

고해상도 이미지의 그레이스케일을 반전시키면 트레이스 모드 페이지 표시에서의 시각화가 개선되며, 자극기의 아날로그 출력을 함께 표시하는 것을 강력히 권장합니다. 트레이스 표시 창에 포함할 아날로그 출력 채널을 선택하십시오. 이 출력은 실험 중에 가해진 자극의 정확한 타이밍을 나타냅니다.

데이터를 동영상으로 확인하려면, neuro plex 내의 동영상 명령어를 사용하여 형광 강도의 최대 및 최소 변화에 맞춰 조정된 유사 색상 척도(pseudo color scales)로 데이터 세트 내의 연속 프레임을 표시하십시오. DIA four A-N-E-P-P-D-H-Q로 염색된 근층신경총(myenteric plexus) 표본의 신경절을 고해상도 카메라와 60x 대물렌즈로 촬영하였습니다. 데이터 획득 과정에서 표본에 40 hertz의 5회 펄스 트레인으로 자극을 주었습니다.

각 펄스의 진폭은 15 milliamps, 지속 시간은 0.5 milliseconds이며, 4개의 관심 영역(ROI)을 설정하여 선택된 영역의 평균 광학 데이터를 표시하는 트레이스를 생성하였습니다. 가색 프레임 시퀀스에서 뉴런 활동을 나타내는 막 탈분극의 첫 번째 광학 응답 영역은 노란색에서 빨간색으로 나타납니다. 이러한 데이터는 자극으로 유발된 활동이 각 신경절의 불연속적인 영역에서 발생하며, 대부분 통과 축삭(axons of passage)에 의해 전달됨을 나타냅니다. ROI 2, 3, 4는 ROI 1로부터 다양한 거리에 있는 개별 뉴런을 식별합니다.

그림 2는 10배 배율에서 정보가 전달될 수 있는 해부학적 경로를 보여주며, 화살표는 식별된 근층간신경절을 활성화하기 위해 자극이 따라가는 방향을 나타냅니다. 우리는 방금 전압 민감성 염료를 사용하여 전기적 활동을 기록하기 위한 광학 설정의 구성 요소와, 이 기술을 신경계에 적용했을 때 현미경 시야 아래에서 손상되지 않은 두 포유류 네트워크 내부 및 상호 간의 기능적 연결성을 연구할 수 있는 가능성이 열린다는 점을 보여드렸습니다. 광학 기록 기술을 사용할 때는 세부 사항에 주의를 기울이는 것이 매우 중요합니다.

광학적, 기계적 및 전기적 노이즈원을 주의 깊게 제어해야 하며, 시료의 상태를 세심하게 유지해야 합니다. 따라서 광학 기록의 성공을 위해서는 이 프로토콜의 모든 개별 단계를 숙달하는 것이 필수적입니다. 이상입니다.

시청해주셔서 감사드리며, 귀하의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.