인간의 DNA 수리 단백질의 유전자 연구는 모델 시스템으로 효모를 사용하여

WRN 플라스미드를 제한 효소 Cel1 및 Mlu1으로 절단하고, 젤에서 단편을 정제합니다. Cel1에서 Mlu1까지의 WRN 단편으로 절단된 이 발현 벡터들을 효모 벡터의 Cel1 및 Mlu1 부위에 리게이션합니다. 이 다중 복제 플라스미드는 TRP1 선택 마커도 포함하고 있습니다.

W Rrn 구조체를 표준 프로토콜에 따라 효모로 형질전환시키고, 트립토판이 결핍된 합성 완전 글루코스 배지에서 형질전환체를 선택합니다. 이후 개별 형질전환체를 트립토판이 결핍된 합성 완전 글루코스 배지에 스트리킹하고, 마스터 플레이트로부터 플레이트를 배양합니다. WRN이 형질전환된 SGS1 상위 3개 이중 돌연변이 균주 형질전환체에서 느린 성장 표현형의 회복을 분석하기 위해, 해당 형질전환체를 글루코스 또는 갈락토스를 함유한 플레이트에 스트리킹합니다.

WRN 발현이 HU 및 MMS 민감도에 미치는 영향을 분석하기 위해, WRN을 발현하는 효모 세포의 세포 주기 분포를 결정하는 스포팅(spotting)을 수행합니다. DAPI 염색을 진행합니다. 이종 숙주에서의 WRN 발현은 웨스턴 블롯 분석으로 분석합니다.

안녕하세요, 저는 국립보건원(National Institutes of Health) 산하 국립노화연구소(National Institute on Aging) 분자노화학 연구소의 DNA 헬리케이스(hela cases) 부문을 담당하고 있는 Robert Broch입니다. 안녕하세요, 저 또한 국립노화연구소 분자노화학 연구소의 DNA 헬리케이스 부문에서 근무하고 있는 Monica Agarwal입니다. 인간 DNA 복구 단백질과 유전적 경로의 역할을 이해하는 것은 많은 연구자에게 매우 까다로운 과제입니다.

포유류 시스템의 유전학 연구는 돌연변이 유전 세포주, 조절 발현 시스템, 적절한 선택 표지자와 같이 즉시 사용할 수 있는 도구의 부족으로 인해 제한적이었습니다. 오늘 우리는 조기 노화 방지에서 헬리케이스(helicase)로 알려진 DNA 풀림 효소의 분자 및 세포 기능을 조사하기 위해 효모를 모델 시스템으로 활용하는 절차를 보여드리겠습니다. 본 연구실에서는 이러한 절차를 통해 조기 노화 질환에서 DNA 복구 및 게놈 안정성 유지에 결함이 있는 인간 burner 유전자 산물의 역할을 유전학적으로 규명하고 있습니다.

베르너 증후군(Werner Syndrome)의 Werner 단백질은 효모(east)에 존재하는 5가지 인간 RecQ 패밀리 헬리케이스(heli case) 중 하나입니다. 인간 Werner의 복제 스트레스 반응 역할을 연구하기 위해 명명된 sgs1 단백질이 유일합니다. 우리는 다양한 생물학적 엔드포인트에 대해 효모 돌연변이 배경에서 Werner 발현의 효과를 조사하였습니다.

그럼 이제 시작하겠습니다. 효모를 이종 숙주로 사용할 것이므로, 첫 번째 단계는 인간 Werner 유전자 또는 그 변이체를 효모 벡터에 클로닝하는 것입니다. Werner 플라스미드를 제한 효소 Sal I과 Mlu I으로 절단하고 정제된 단편을 갈락토스 유도 프로모터의 조절을 받는 효모 발현 벡터의 Sal I 및 Mlu I 부위에 결합시켰습니다.

이 다중 복제 플라스미드는 TRP1 선택 마커 또한 포함하고 있습니다. 이후 이러한 Werner 발현 플라스미드를 본 연구에 사용된 적절한 트립토판 영양 요구성 효모 균주에 형질전환시킵니다. 그리고 현탁액을 합성 완전 포도당 배지에 도말하여 형질전환체를 선택합니다.

트립토판이 결핍된 배지에서 콜로니가 나타날 때까지 30 °C에서 3~4일 동안 배양합니다. 콜로니가 성장하면, 개별 형질전환체를 합성 완전 포도당 배지에 스트리킹하고 30 °C에서 2~3일 동안 배양합니다. 그 후, 인간 weer 유전자 및 그 변이체를 발현하는 돌연변이 효모 균주의 세포 표현형을 다음 섹션에서 시연하는 기술을 사용하여 조사합니다.

상위 3개 돌연변이체는 심각한 성장 결함을 보입니다. 그러나 SGS1 유전자의 돌연변이는 상위 3개 돌연변이체의 성장 지연 표현형을 억제합니다. Werner 발현이 야생형 SGS1 또는 SGS1 상위 3개 균주의 성장에 미치는 영향을 조사하기 위해, 해당 균주들을 벡터 또는 Werner 발현 플라스미드와 함께 트립토판이 결핍되고 2% glucose 또는 2% galactose가 포함된 합성 완전 배지 플레이트에 스트리킹하여 양성 대조군으로 사용하였습니다. SGS1 발현의 효과를 결정하기 위해 플레이트를 30°C에서 2일 동안 배양하였습니다.

벡터 또는 Werner가 형질전환된 야생형 및 SGS one 돌연변이 균주는 성장 패턴에서 아무런 차이를 보이지 않습니다. 그러나 Werner의 느린 성장 표현형 복구에 필요한 기능적 요구 사항을 평가하기 위해 분석한 결과, Werner가 형질전환된 SGS one top three 이중 돌연변이 균주는 벡터가 형질전환된 SGS one top three 이중 돌연변이 균주보다 유의하게 느리게 성장합니다. sgs one top three 배경에서, Warner 촉매 도메인 돌연변이가 형질전환된 sgs one top three 균주를 2% glucose 또는 2% galactose가 포함된 트립토판 결핍 합성 완전 배지에 도말하고 2일 후 확인합니다.

E 84 A로 표시된 Werner Exonuclease 돌연변이체는 Werner와 유사하게 느린 성장 표현형을 회복시키며, 이는 상위 3개 느린 성장 표현형의 회복에 exonuclease 활성이 필요하지 않음을 보여줍니다. Werner Helicase 돌연변이체는 잘 성장하며, 이는 상위 3개 느린 성장 표현형의 회복에 Werner helicase 활성이 필요함을 입증합니다. sgs의 성장 속도에 영향을 미치는 Werner의 능력을 결정하기 위해.

단백질 발현 수준이 낮은 top three 변이주 하나를 선택하여, vector Werner 또는 sgs1로 형질전환된 top three 변이주들을 트립토판이 결핍되고 갈락토스 농도가 점차 증가하는 합성 완전 배지(synthetic complete plates)에 스트리킹합니다. 모든 플레이트를 30°C에서 2일 동안 배양합니다. Werner 및 Werner Exonuclease 돌연변이체는 모든 갈락토스 농도 수준에서 top three slope-with 표현형을 회복시킵니다.

하지만 Werner Helicase 돌연변이체는 그렇지 않습니다. SGS1 top three 이중 돌연변이체가 DNA 알킬화제인 methyl methane SULFONATE(MMS) 또는 복제 억제제인 hydroxyurea(HU)에 대해 top three 단일 돌연변이체보다 덜 민감하다는 것이 밝혀졌습니다. Werner 발현이 SGS1 또는 SGS1 top three 균주의 MMS 및 HU 민감도에 미치는 영향을 결정하기 위해, 대조군으로서 벡터 또는 Werner가 형질전환된 효모 균주를 트립토판이 결핍된 합성 완전 라피노스 배지에서 30 °C로 배양합니다.

벡터로 형질전환된 야생형 부모 균주를 사용하여, 트립토판이 결핍된 합성 완전 라피노스 배지에 모든 배양액을 재접종하고 30 °C에서 초기 대수 증식기까지 배양합니다. 배양액이 초기 대수 증식기에 도달하면, 트립토판 결핍 합성 완전 배지를 사용하여 해당 균주들을 10,000배까지 10배 연속 희석합니다. 각 희석액 4 µL를 10 mM HU 또는 0.0025% MMS가 포함된 트립토판 결핍 합성 완전 GAL 배지 플레이트에 점적(spot)하고, 플레이트를 30 °C에서 4일 동안 배양합니다. 야생형 sgs로 형질전환된 SGS1 top3 이중 돌연변이체입니다.

하나의 세포는 세포 주기의 후기 S기 G2 단계에서 지연되어 아령 모양의 형태를 띱니다. 이와 대조적으로, 야생형 효모는 세포 분열을 완료하므로, Werner 형질전환 sgs1-top3 균주의 세포 주기 분포를 연구하기 위해 아령 모양의 세포가 적게 남게 됩니다. 먼저, 트립토판이 결핍된 synthetic complete RAF 배지에서 다음 균주들의 대수 성장 배양액을 30 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다.

vector Werner 또는 SGS one으로 형질전환된 SGS one, 그리고 야생형 부모 균주로 형질전환된 vector를 OD 0.05에서 재접종합니다. 재접종 후 배양액을 OD 0.5까지 성장시킨 다음 원심분리로 회수합니다. 그 후 2% 농도의 gala lactose를 첨가하여 Werner 발현을 유도합니다. 배양액을 30 °C에서 6시간 동안 성장시킵니다.

6시간 후, 배양물을 수확하고 원심분리를 통해 세포를 수집합니다. 원심분리 후 배양물을 마이크로 원심분리 튜브로 옮기고, PBS로 세포를 한 번 세척합니다. 그 다음, 세포를 70% ethanol에 넣고 실온에서 20분 동안 고정합니다. 고정된 세포를 PBS로 두 번 세척한 후, 1X PBS에 세포를 재부유시킵니다.

슬라이드 위에 세포 현탁액을 놓고 vector shield를 첨가합니다. 1 µg/mL 농도의 DAPI가 포함된 마운팅 매질을 사용합니다. XI Saxo vert 현미경으로 슬라이드를 관찰하여, 세포 주기 SG 2단계의 효모 세포 특징인 덤벨 모양의 핵을 가진 세포가 있는지 확인합니다.

형질전환된 SGS one 또는 SGS one top three 효모 균주에서 Werner 단백질의 발현 또는 그 변이를 결정합니다. 먼저 Werner 단백질의 발현을 유도하기 위해 갈락토스가 함유된 배지에서 균주를 6시간 동안 배양합니다. 원심분리로 세포를 수집한 후, PBS로 세척하고 재현탁합니다.

알칼리 용해 버퍼입니다. 세포를 5분 동안 끓인 후, 원심분리를 통해 상층액을 분리하고 1 M 염산으로 중화합니다. 이렇게 준비된 용해물은 8~16% poly acrylamide SDS 젤 전기영동에 사용할 수 있으며, 이를 통해 다양한 농도의 galactose 영향 하에서 Warner 단백질의 발현 수준을 결정합니다.

먼저, 다양한 농도의 galactose로 6시간 동안 배양물을 유도합니다. 그다음 원심분리를 통해 세포를 수확하고 프로테아제 억제제가 포함된 puffer에 다시 현탁합니다. 혼합물에 425~600 µm의 유리 구슬을 넣고, 고속으로 1분간 vortexing하여 세포를 파쇄한 후 1분 동안 얼음에 박아둡니다.

총 8회 반복합니다. 다음으로, 생성된 균질액을 15,000 Gs에서 5분 동안 원심분리하고 상층액 분획을 수집합니다. Bradford 법으로 용해물 분획의 단백질 양을 측정한 후, 8~16% Poly acrylamide SDS 겔에서 동일한 농도의 단백질을 분리합니다. 그 후 Western blot을 통해 Werner의 발현을 결정하며, sgs 내의 Werner 발현을 확인합니다.

이 사진들에서 보는 바와 같이, One top three는 top three의 서행 성장 표현형을 복구합니다. 벡터 Werner 또는 sgs one으로 형질전환된 sgs one top three 균주를 2% glucose 또는 2% galactose가 함유된 SC tryptophan 플레이트에 스트리킹합니다. galactose에 의해 유도된 Werner의 발현은 SGS one top three 균주의 성장 속도를 더 느리게 만듭니다.

반면, 야생형 부모 균주 또는 Werner가 형질전환된 SGS one 균주는 성장에 영향을 받지 않았으며, 이는 Werner에 의해 유발된 성장 지연이 sgs. One top three 배경에 특이적임을 나타냅니다. Werner 변이체가 형질전환된 SGS one top three 균주를 2% glucose 또는 2% galactose만 포함하는 SC tryptophan 플레이트에 스트리킹하였습니다.

엑소뉴클레아제 활성이 없는 Werner는 여전히 느린 성장 표현형을 복구할 수 있었습니다. 이는 top three의 느린 성장 표현형을 복구하는 데 Werner의 엑소뉴클레아제 활성이 아니라 ATPase 헬리카제 활성이 필요함을 입증합니다. SGS one top three 배경에서 Werner는 GAL 농도 범위 전반에 걸쳐 SGS one top three의 느린 성장 표현형을 복구했습니다.

이러한 결과는 sgs one top three 돌연변이 배경에서 느린 성장 표현형의 복구가 낮은 Werner 단백질 발현 수준에서 일어남을 나타냅니다. Werner 또는 그 변이체들이 형질전환된 sgs one top three 균주의 대수 성장기 배양액을 glucose 또는 galactose와 MMS 또는 HU가 포함된 SC tryptophan 플레이트에 10배 단계 희석하여 점적하였습니다. Werner 발현이 SGS one top three 균주의 MMS 및 HU 민감성을 증가시키는 것을 관찰하였습니다. 또한, SGS one top three 배경에서 MMS 및 HU 민감성에 미치는 이러한 영향은 Werner ATP-dependent helicase 활성은 필요하지만, exonuclease 활성은 필요하지 않았습니다.

마지막으로, Werner 발현은 크기가 큰 엉덩이 세포(butted cells)의 집단 증가에서 나타나듯이 top three의 특징적인 SG two 지연을 복구합니다. Werner를 발현하는 sgs one top three 돌연변이 세포와 대조적으로, 벡터 세포로 형질전환된 sgs one top three 세포를 Dabi로 염색하였습니다.

핵을 시각화하였으며, 화살표는 분열되지 않은 핵의 Werner 발현을 나타냅니다. 형질전환된 sgs에서 상위 3개 세포에 표시된 갈락토스 농도를 첨가하여 유도하였으며, 유도 6시간 후에 세포를 수확하였습니다. 동일한 양의 전체 세포 용해물을 8~16% poly acrylamide SDS 겔에 로딩한 후, anti Werner 항체를 사용하여 western blot 검출을 수행하였습니다.

우리는 인간 학습 유전자의 촉매 활성 및 단백질 상호작용에 의해 매개되는 세포 및 분자 기능을 규명하기 위해, 정의된 효모 돌연변이 배경과 관련된 세포 표현형을 조사하는 방법을 보여드렸습니다. 효모는 정의된 경로에서 해당 유전자의 기능을 연구하기 위한 모델 생물로 사용될 수 있습니다. 이러한 절차를 수행할 때, 조사 대상 유전자가 정의된 경로에서 수행하는 역할을 식별하기 위해 적절한 효모 돌연변이 배경을 선택하는 것이 중요합니다.

이상입니다. 시청해 주셔서 감사하며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.