Denaturing 그라디언트 젤 전기 영동 (DGGE)

안녕하세요, 제 이름은 Celeste Peterson이며 하버드 대학교에서 미생물 바이오필름 커뮤니티를 연구하는 펠로우입니다. 저는 16S rRNA 서열을 분석하여 박테리아 커뮤니티의 특성을 파악하고, 이 서열이 시간과 공간에 따라 어떻게 변화하는지 연구하고 있습니다. 이를 위해 저는 DGGE를 사용하고 있습니다.

이것은 일반적인 웰의 아크릴이 아니며, 구동 시 60°C로 유지해야 하고 완충액을 지속적으로 펌핑해야 합니다. 따라서 완충액이 60°C에 도달할 때까지 약 1시간 동안 예열한 후, 타월을 구동할 수 있습니다. 이제 희석된 uc 용액으로 이 플레이트를 세척하여 불순물을 제거하고, 그것을 조명하겠습니다.

그러한 모든 요소가 불규칙성을 유발할 수 있습니다. 모든 물기를 닦아내는 것이 중요합니다. 따라서 겔을 조립할 때, 해당 칩을 겔의 외측에 배치하겠습니다.

따라서 겔은 이 두 개의 유리판 사이에 위치하게 되며, 칩은 바깥쪽에 놓여 사이에 있는 겔에 영향을 주지 않습니다. 이제 이 클램프들에 겔을 조립한 다음, 함께 눌러주고 오른쪽으로 돌려 조여줍니다. 다른 모든 겔 작업과 마찬가지로, 바닥 부분이 평평하게 밀착되었는지 확인하는 것이 중요합니다.

누설을 방지하기 위해, 이제 젤의 방향을 돌려 가스켓으로 밀봉될 수 있도록 여기에 넣습니다. 이때 젤 플레이트가 여기 가스켓과 정확히 일치하도록 정렬하는 것이 중요합니다. 그런 다음 측면의 노브를 끼우고 아래로 눌러 밀봉합니다.

이것은 30 mL 주사기입니다. 이 부분과 이 부분은 bio red 키트에 포함되어 있으며, 다음과 같이 장착합니다. 이는 튜브 내의 과잉수를 제거하기 위한 것입니다.

이제 겔을 로딩하기 위해 튜브를 겔 위에 배치합니다. 먼저 어댑터를 튜브에 끼운 다음, 작은 어댑터가 달린 바늘을 사용하여 겔의 정중앙, 즉 하단 유리의 약간 아래쪽에 위치시킵니다. 그다음 와이어 어댑터를 긴 튜브에 연결하며, 이는 고밀도 및 저밀도 용액이 들어 있는 두 개의 시린지와 연결됩니다.

여기 미리 준비된 용액들이 있습니다. 파란색 용액에는 이 용액이 가장 강한 변성 용액임을 나타내는 염료를 첨가했으며, 나머지 하나는 변성 정도가 가장 낮은 저밀도 용액입니다. 이 용액들에는 필요한 모든 성분이 포함되어 있습니다.

이제 제작하겠습니다. 실제로는 일주일에 두 번 정도 진행합니다. 적정 온도에 도달하면, 콜라겐이 중합되기 전까지 약 5~7분 이내에 젤을 채워야 합니다. 이제 주사기에 용액을 채웁니다.

약 15µL의 용액을 채우겠습니다. 그런 다음 기포를 제거하기 위해, 상단의 기포가 사라질 때까지 조심스럽게 누르면서 거꾸로 뒤집습니다. 이제 이 작은 나사를 이 홈에 끼우겠습니다.

이 어댑터는 여기 있는 클램프와 일직선으로 정렬되며, C-클램프로 매우 단단히 고정됩니다. 그런 다음 이 튜브를 시린지에 연결합니다. 고밀도 매트릭스가 있는 반대편에서도 전달 준비가 되면 동일한 과정을 수행합니다.

이제 휠을 일정한 시계 방향으로 회전시키겠습니다. 가장 농도가 높은 파란색 용액이 먼저 나오고 겔의 바닥 부분을 형성하게 됩니다. 그러고 나서 잠시 후 투명한 용액이 겔을 채우기 시작하면서 구배(Gradient)가 형성될 것입니다.

잠시 동안 비스듬히 기울인 상태를 유지하십시오. 젤을 다 붓자마자 튜브를 즉시 세척해야 합니다. 그렇지 않으면 튜브 안에서 중합 반응이 일어나기 때문입니다. 이제 그 그룹으로 이동하여 아래로 누르십시오. 이 작은 부분과 반대편에도 동일하게 작업을 수행하겠습니다. 좋습니다.

안녕하세요, 제 이름은 Celeste Peterson이며 하버드 대학교에서 미생물 생물 군집을 연구하는 펠로우입니다. 저는 16S rRNA 서열을 분석하여 세균 군집의 특성을 파악하고, 시간과 공간에 따라 서열이 어떻게 변화하는지 연구하고 있습니다. 이를 위해 저는 DGGE를 사용하고 있습니다.

DGE는 변성 젤 전기영동(Denaturing Gel Electrophoresis)을 의미합니다. 기본 원리는 구배(gradient)가 형성되어 있어 DNA가 구배를 따라 이동하면서 변성되는 것입니다. 이에 따라 서로 다른 16가지 종이 구배를 따라 서로 다른 지점에서 멈추게 됩니다.

따라서 이는 커뮤니티 내 다양한 세시노스(sexiness) 종들의 지문과 같은 역할을 하게 됩니다. 그러므로 제 실험의 목표는 커뮤니티에 어떤 종들이 존재하는지, 그리고 그것이 시간과 공간에 따라 어떻게 변화하는지 확인하는 것입니다. 세시노스 DDD 겔을 전기영동한 후, 밴드를 절단하여 각 커뮤니티에 존재하는 종들을 식별할 수 있습니다.

DDG 겔을 제작할 때 가장 큰 문제 중 하나는 최적의 구배(gradient)를 결정하는 것입니다. 따라서 특정 군집에 어떤 유형의 구배가 적합한지는 직접 여러 번 시도하며 찾아내야 합니다. 오늘 제가 사용하고 있는 것은 35에서 55% urea 구배입니다.

이 기술에서 발생할 수 있는 주요 문제 중 하나는 레인에 스미어(smear) 현상이 나타나는 것입니다. 저는 어떤 이유에서인지 젤을 아주 오랫동안 전기영동하면 스미어 현상이 사라진다는 점을 발견했습니다. 오늘은 일반적인 박테리아 군집에 사용하고 있지만, 이 방법은 특정 박테리아 과(family)가 시간에 따라 어떻게 변화하는지 확인하는 데에도 사용할 수 있으며, 이 경우 젤 결과가 매우 깨끗하게 나오는 경향이 있습니다.

DDGE를 사용하여 단일 유전자의 돌연변이를 확인할 수도 있습니다.