Name: 성인 Zebrafish에서 레트로 - 궤도 분사 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-12-07T18:43:00.000+00:00
Duration: 4 min 50 s
Description: 학습하세요 성인 제브라피시에서 레트로-궤도 분사 기법을 활용한 조혈모세포 이식 연구 방법을. 형광 표지된 적혈구 수집 및 주사 후 전동물 형광현미경으로 이미징하여 혈액세포 역학을 분석합니다.

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이 작품은 하워드 휴즈 의학 연구소와 배아 조혈 연구에 대한 NIH에서 교부금에 의해 지원됩니다.

1 부. 사출 재료의 준비 <ol><li> TG (globin : GFP) 세포 : </li><li> 길 뒤에 찔린 물고기 헤파린 (1unit/ul)에 코팅 10ul 피펫 팁을 사용하여 성인 기증자 물고기 출혈. </li><li> 적혈구를 기음과 셀 버퍼에 분배 (0.9X PBS + 5% FBS + 1 %의 펜 / Strep). </li><li> 필터 셀 40uM 메쉬 이상의 정지 및 이전 르블랑 외 의해 설명한대로 hemocytometer를 사용하여 세포의 농도를 결정한다. </li><li> 스핀 다운 및 최종 사출 량이 5ul 이상 없다는 등 원하는 농도에서 세포 버퍼에 resuspend. 여기 1.5-2000000 세포 /받는 사람을 주입. </li><li> dextran, 텍사스 레드 ® 들어, 10-12 MG / ML의 최종 주입 농도에 대한 DPBS에 염료를 해산. 물고기마다 네 UL을 주입 계획입니다. </li></ol> 2 부. 주사 <ol><li> (4.2ml (4mg/ml) tricaine/100ml 물고기 물) tricaine 물고기를 마취. </li><li> 와시 해밀턴 주사기 이전 70 % 에탄올을 사용하여 주사하는 3-4 회. 0.9X DPBS로 3-4 회 린스. </li><li> 플레이스 최대 생선 등의 측면과 젖은 스폰지에 바로 직면. </li><li> 오른손과 플런저에 검지 손가락으로 해밀턴 주사기 들고. 천천히 왼쪽 손으로 물고기의 시체를 안정화. </li><li> 물고기의 눈이 시계라면, 바늘이 7시 위치와 물고기 (그림 1)에 45도 각도 가리키는 것이 같은를 직면하고있는 베벨과 바늘을 위치. </li><li> 부드럽게 7시 위치에 바늘 1~2밀리미터를 삽입하고 천천히 플런저를 우울. </li><li> 신선한 E3 물에 복구하는 물고기를 허용합니다. </li><li> 다른 시약의 주사 사이에 위에서 설명한 바와 같이, 바늘을 씻으십시오. </li><li> 셀 clumping을 방지하기 위해 세포마다 몇 분 resuspend에 플릭 셀 솔루션입니다. </li><li> 감염을 피하기 위해 매일 물을 변경 1 주일 동안 흐름에서 생선 보관하십시오. 우리는 (10mL 스트레스 코트 + 5mL pemafix + 38리터 E3 물 당 5mL melafix)이 기간 동안 ICU 소금물에 생선을 보관. </li></ol> 부 3. 대표 결과 제대로 수행하면, 그것이 어떤 식으로든 표시되었는지 주입 자료를 시각화 할 수 있습니다. 예를 들어, TG (globin : GFP) 적혈구는 그림 2와 같이 빨리 주입 후받는 캐스퍼 물고기의 vasculature의 순환 형광등 해부 현미경 아래에서 볼 수 있습니다. 마찬가지로, 텍사스 레드 ®에 복합 70kDa dextran의 주입은 역전사 궤도 분사 바로 다음에 투명 물고기 (그림 3)의 vasculature에 시각하실 수 있습니다. TG (β - 굴지 : GFP)에서 형광 신장 세포 기증자 물고기도 조사 캐스퍼받는 생선으로 역전사 orbitally 주입 수 있습니다. 이 세포는 결국 다음 몇 주 (그림 4B) 후 신장을 repopulate하기 위해받는 사람 골수 (그림 4A)로 가정에 갈 수 있습니다. 주사가 너무 얕은하거나 바늘의 각도는 복고풍 - 궤도 정맥 부비동의 캐비티를 무시하는 경우, 주입 물질은 눈 주위 풀링 또는 밖으로 흐르는 시각 수 있습니다. 주사가 너무 깊은 경우 그들은 여전히​​ 복구할 수 있지만 또한, 물고기, 조직 손상이나 과도한 출혈이 발생할 수 있습니다. 제대로 수행되면, 복고풍 - orbital은 주사 후 사망률 총 주입 생선과 혈류에 납품 성공의 5 % 이하의 총 주입 물고기보다 90 % 이상되어야한다. <img src="/files/ftp_upload/1645/1645fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1 : 역전사 궤도 분사 기법의 일러스트 레이션. 물고기의 오른쪽 눈은 일곱 O 클럭 위치가 올바른 주사 장소에 해당하는 아날로그 시계로 표현된다. <img src="/files/ftp_upload/1645/1645fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2 : TG (globin : GFP) 삼일 역 궤도 분사 이후 성인 캐스퍼 물고기의 꼬리 vasculature에 순환 적혈구. <img src="/files/ftp_upload/1645/1645fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3 : 레드 텍사스에 복합 70kDa dextran ® 염료는 투명 성인 생선, 캐스퍼의 형광 vasculature을 생산하고 쉽게 표준 전체 동물의 형광 현미경을 사용하여 볼로 사용 성공적으로 주입. <img src="/files/ftp_upload/1645/1645fig4a.jpg" alt="그림 4a" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 4A"> 그림 4A : TG (β - 굴지 : GFP)의 전체 신장 골수 세포의 복고풍 - 궤도 분사 다음과 같은 세 가지 일 기증자 물고기, 세포가 조사 성인 캐스퍼받는 물고기의 신장 골수에 돌입 시각하실 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/1645/1645fig4b.jpg" alt="그림 4b" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 4B"> 그림4B : TG (β - 굴지 : GFP)의 전체 신장 골수 세포의 복고풍 - 궤도 분사 다음 4 주 기증자 생선, 녹색 기증자 전체 신장 골수 세포로받는 신장의 repopulation이 조사 성인 캐스퍼받는 물고기의 시각하실 수 있습니다.

<ol><li>Steel, C. D., Stephens, A. L., Hahto, S. M., Singletary, S. J., Ciavarra, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+lateral+tail+vein+and+the+retro-orbital+venous+sinus+as+route+of+intravenous+drug+delivery+in+a+transgenic+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Animal%22%5BJournal%5D)">Comparison of the lateral tail vein and the retro-orbital venous sinus as route of intravenous drug delivery in a transgenic mouse model.</a> Lab Animal. 37, 26-32 (2008).</li>
<li>Pinkerton, W., Webber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+of+injecting+small+laboratory+animals+by+the+ophthalmic+plexus+route%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Soc.+Exp.+Bio.+Med%22%5BJournal%5D)">A method of injecting small laboratory animals by the ophthalmic plexus route.</a> Proc. Soc. Exp. Bio. Med. 116, 959-961 (1964).</li>
<li>White, R. M., Sessa, A. S., Burke, C., Bowman, T., LeBlanc, J., Ceol, C., Bourque, C., Dovey, M., Goessling, W., Burns, C. E., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transparent+adult+zebrafish+as+a+tool+for+in+vivo+transplantation+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis.</a> Cell Stem Cell. 2, 183-189 (2008).</li>
<li>LeBlanc, J., Bowman, T. V., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+whole+kidney+marrow+in+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Transplantation of whole kidney marrow in adult zebrafish.</a> J. Vis. Exp. , (2007).</li>
</ol>

성인 zebrafish에서 레트로 - 궤도 분사는 사망률의 가장 낮은 발병률과 혈류에 주입 물질의 전달 가장 높은 효율을 제공합니다. 때문에 분사 지점의 성격, 주사 감염과 혈액 손실 금액의 발생을 감소 신속하게 치유가 나타납니다. 사이트도 반복 예를 들어, 약물의 매일 주사를위한 짧은 시간 동안 주입 수 있습니다. 약물의 다량은 간단하게 포장되어과 관심의 약물을 포함하는 물에 배어있는 물고기의 성인 물고기의 전통적인 치료 방법에 대한 구입하셔야합니다. 약물이 동물의 혈액에 직접 주입하는 경우 그러나, 훨씬 작은 수량은이를 실험 비용을 줄이는 치료를 위해 필요합니다. 특정 펩티드의 경우에 몸을 담글 수를 통해 물고기 순환을 입력하기에는 너무 큰 특정 화합물 들어, 복고풍 - 궤도 분사도 유리한 수 있습니다. RO 주사는 성인 물고기의 intracardiac 사출 기술을보다 빠르고 쉽게이기 때문에 또한, RO 주사의 또 다른 ...

<table><tbody><tr><td>돼지 장점막 유래 헤파린 나트륨염</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>2106</td><td>300 USP 단위가 미리 계량된 바이알</td></tr><tr><td>트리케인-M (Tricaine-M)</td><td>Western Chemical</td><td></td><td>MS-222</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;인산완충생리식염수</td><td>Invitrogen</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>덱스트란, Texas Red&amp;#174;</td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td>D1830</td><td></td></tr><tr><td>E3</td><td></td><td></td><td>5mM NaCl&lt;br/&gt;0.17 mM KCl&lt;br/&gt;0.33 mM CaCl2&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&lt;br/&gt;0.33 mM MgSO4&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>마이크로리터 주사기</td><td>Hamilton Co</td><td>80300</td><td>701N 10uL SYR (26s/2&amp;#8221;/2)</td></tr></tbody></table>

성인 zebrafish에서 레트로 - 궤도 분사

Retro-orbital Injection in Adult Zebrafish

전체 동물의 약물 치료 약리 화학 유전 연구에 대한 모델 시스템에 필수적인 도구입니다. 정맥 주사 (IV) 주사가 종종 관심의 대리인의 전달의 가장 효과적이고 비침 투 형태입니다. zebrafish에서 (<em&gt; Danio rerio</em&gt;), 약물의 IV 주입 길이 때문에 작은 혈관 직경의 도전을했습니다. 이것은 또한 hematopoeitic 줄기 세포 이식하는 동안 세포의 주입을위한 중요한 장애물을 입증했다. 역사적으로, 혈류로 주사는 심장을 통해 직접 수행했다. 심장이 자주 감염, 과다 출혈이나 치명적인 장기 손상하는 경향이 물고기를 떠나 주입하는 동안 구멍이다 그러나,이 내부 심장 절차는 매우 높은 사망률이 있습니다. 마우스로 우리의 경험에 그리기, 우리는 사출 사이트가 눈 뒤에과 복고풍 - 궤도 정맥 부비동에있는 zebrafish의 새로운 주사 절차를 개발했습니다. 이 역 - 궤도 (RO) 사출 기술은 성공적으로 성인 물고기에서 약물 주입뿐만 아니라 전체 신장 골수 세포의 이식 모두에 채용되었습니다. RO 주입은 전통적인 내부 심장 주사보다 훨씬 낮은 사망률이 있습니다. 복고풍 - orbitally 주입 물고기 적은 다음과 같은 주사를 출혈하는 경향이 있고 심장과 같은 주요 장기에 부상의 훨씬 더 낮은 위험에 처해질 수 있습니다. 또한, 정상적으로 수행하면, 주입된 세포 및 / 또는 약물 빠르게 화합물들이 틈새 시장을 집에서 쉽게 전체 생선과 신장의 세포를 그들의 효과를 발휘 수 있도록 혈류를 입력합니다. 성인 물고기의 혈류로 재료의 효율적인 전송을 허용하는 동안 따라서,이 새로운 사출 기술은 사망률을 최소화합니다. 여기 TG의 역전사 궤도 주입하여이 기술을 예시 (<em&gt; globin</em&gt; 성인에 GFP) 전지<em&gt; 캐스퍼</em&gt; 생선뿐만 아니라 적색 형광 색소의 주입 (dextran, 텍사스 레드<em&gt;</em&gt;) 성인에<em&gt; 캐스퍼</em&gt; 물고기. 그러면 모든 동물의 형광 현미경에 의해 성공적으로 주사를 시각화.

여기 우리는 성인 zebrafish에서 역전사 궤도 주사를하는 방법을 보여줍니다.

성인 Zebrafish에서 레트로 - 궤도 분사

전신 동물 대상의 약물 처리는 약리학 및 화학 유전학 연구를 위한 모든 모델 시스템에서 필수적인 도구입니다. 정맥 내(IV) 주사는 ...

먼저 공여자의 심장을 천자하여 적혈구를 흡인함으로써 형질전환 globin GFP 어류로부터 공여 적혈구를 수집합니다. 세포가 주입 준비가 되면 수혜 어류의 안와 뒤로 주입하며, 이후 표준 전신 동물 형광 현미경을 사용하여 형광 표지된 세포의 주입 성공 여부를 촬영합니다. 마찬가지로, Texas red가 접합된 유색 염료 덱스트린을 준비하여 안와 뒤로 주입하고, 주입된 동물을 촬영하여 주입 성공 여부를 확인합니다.안녕하세요, 저는 보스턴 어린이 병원 혈액종양학과의 Leonard Zan 실험실 소속 Emily Atch입니다. 오늘은 성체 제브라피시의 안와후 주사 절차를 보여드리겠습니다. 저희 실험실에서는 조혈모세포 이식을 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다.이제 시작하겠습니다. 성체 Casper fish(제브라피쉬의 투명 품종)에 형질전환 globin GFP 세포와 Texas red가 결합된 적색 형광 염료 dextrin을 안와하 정맥으로 주입하는 방법을 시연하겠습니다. 형질전환 lobin GFP 세포를 준비하기 위해, 헤파린이 코팅된 10 µL 피펫 팁을 사용하여 성체 공여어의 아가미 뒤쪽을 찔러 적혈구를 흡입한 후 세포 버퍼에 분주하여 채혈합니다.다음으로, 세포 현탁액을 40 µm 메쉬로 여과합니다. 앞서 LeBlanc 등이 설명한 바와 같이 혈구계수기(hemo cytometer)를 사용하여 세포 농도를 결정한 후, 세포를 1500 RPM에서 5분 동안 원심 분리합니다. 최종 주입 부피가 5 µL를 초과하지 않도록 원하는 농도의 세포 버퍼에 세포를 다시 현탁합니다.본 시연에서는 수용체당 1.5~2백만 개의 세포를 주입할 것이며, 적색 형광 염료를 준비하여 최종 주입 농도가 10~12 mg/mL가 되도록 DPBS에 용해하겠습니다. 주입 절차는 동일하므로 물고기 한 마리당 4 µL를 주입하겠습니다. 주입 물질과 관계없이, 여기서는 적색 형광 염료의 주입 과정만을 시연하겠습니다.어류에 주입하기 전, Hamilton 시린지를 70% ethanol로 3~4회 세척하십시오. 그 후 0.9 XDPS로 3~4회 헹굽니다. Trica로 어류를 마취시킨 후, 젖은 스펀지 위에 어류의 등 쪽이 위로 향하게 하고 머리가 오른쪽을 향하도록 놓습니다.시료가 충전된 Hamilton 시린지를 오른손으로 잡고, 왼손 검지로 플런저를 누른 상태에서 물고기의 몸통을 부드럽게 고정합니다. 바늘의 사면(bevel)이 위를 향하도록 하여, 물고기의 눈을 시계라고 가정했을 때 바늘이 7시 방향을 가리키도록 위치시킵니다. 물고기 몸통에 대해 45도 각도로 7시 방향의 1~2mm 깊이까지 바늘을 천천히 삽입한 후 플런저를 서서히 누릅니다.물고기가 신선한 E3 용액에서 회복하도록 합니다. 감염을 방지하기 위해 매일 물을 갈아주며 일주일 동안 수류가 없는 곳에 물고기를 둡니다. 이 기간 동안 물고기는 ICU 수조에서 관리합니다. 후안와 주사를 정확하게 시행하면 표지된 주입 물질을 시각적으로 확인할 수 있습니다.예를 들어, 형질전환 globin GFP 적혈구가 주입 3일 후 성체 Casper 수용어의 꼬리 혈관 내에서 순환하는 것을 형광 해부 현미경으로 관찰할 수 있으며, 마찬가지로 Texas red가 접합된 70 kilodalton 덱스트린을 성공적으로 주입하면 즉시 형광 혈관이 나타납니다. 표준 전신 동물 형광 현미경으로 쉽게 시각화할 수 있는 투명한 성체 Casper fish의 경우, 형질전환 beta actin GFP 공여자 fish로부터 유래한 형광 신장 골수 세포를 방사선 조사된 Casper 수용어에게 경구 후로 주입할 수 있습니다. 이 세포들은 여기에서 보는 바와 같이 주입 3일 후 수용어의 골수로 최종적으로 이동하며, 4주 후에는 이 녹색 공여자 세포들이 수용어의 신장을 다시 채울 수 있습니다.지금까지 성체 제브라피시의 안와후 주사법을 살펴보았습니다. 이 절차를 수행할 때는 바늘을 물고기의 평면과 45도 각도가 되도록 주사하는 것이 중요하다는 점을 기억하십시오. 이것으로 모든 과정을 마칩니다.시청해 주셔서 감사합니다. 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

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생물학

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