디 - 8 - ANEPPS으로 유도된 막 전압 측정

생물학자에게 세포는 다양한 소기관을 포함하는 생명의 기본 단위이며, 각 소기관은 특정 과업을 수행함으로써 세포가 전기적 관점에서 필수적인 기능을 수행할 수 있도록 합니다. 하지만 전기적 분석 시 내부 구조는 그리 중요하지 않으며, 세포는 절연성 막으로 둘러싸인 전도성 세포질과 그 외부를 둘러싼 전도성 환경으로 간주될 수 있습니다. 이온 농도의 미세한 불균형으로 인해 막 근처에 과잉 이온이 축적되면 휴지 막전위가 발생합니다.

세포를 전기장에 배치하면 막 양측에서 국소적인 전하 재분포가 일어납니다. 그 결과로 유도 막 전압이 발생하며, 이는 휴지 전압에 중첩되었다가 전기장이 꺼지면 사라집니다. 단순한 세포 모양의 경우, 구형 세포에 대해 유도 막 전압을 분석적으로 계산할 수 있습니다.

이는 전압이 전기장 강도 및 세포 크기에 비례하며, 막을 따라 코사인 함수를 따른다는 Schwan 방정식으로 설명됩니다. 더 복잡한 세포 형태의 경우, 유도 전압이 코사인 함수에서 상당히 벗어날 수 있으며, 이는 고성능 컴퓨터를 이용한 수치 해석이나 전위 측정 염료를 이용한 실험적 방법으로 결정해야 합니다. 이러한 목적으로 널리 사용되는 전위 측정 염료 중 하나가 diC$_{18}$(diAIPs)입니다.

막 전압에 따라 들뜸 및 방출 스펙트럼이 변하는 빠른 염료인 AIPs는 막에 결합했을 때 강한 형광을 띠며, 형광 강도의 변화는 막 전압의 변화에 비례합니다. 본 영상에서는 D AIPs를 사용하여 유도된 막 전압을 측정하는 프로토콜을 보여줍니다. 본 예제에서는 중국 햄스터 난소 세포를 사용하며, 챔버당 100,000개의 세포가 되도록 챔버에 세포를 분주합니다.

HAMF 12 배지에 fetal calf serum, L glutamine 및 항생제를 첨가하여 배양하며, 구형의 부착 세포를 얻으려면 세포를 배양액에서 2~4시간 동안, 더 복잡한 형태의 단일 부착 세포를 얻으려면 16~20시간 동안 배양합니다. 원래의 바이알 내에서 DMSO에 용해된 DiAAPS의 10 mM 스탁 용액을 준비합니다. 일부 세포주의 경우 염료의 막 삽입을 용이하게 하기 위해 추가적인 Pluronic이 필요할 수 있습니다. 1 mL의 Spinner's modification of the minimum essential medium (SMEM)을 EOL 튜브에 옮기고 2.5 µL의 20% Pluronic과 3 µL의 10 mM DiAAPS를 첨가합니다.

이를 통해 약 30 micromolar의 diet aaps와 0.05%의 onic이 포함된 로딩 용액이 생성됩니다. 챔버 내의 배양액을 로딩 용액으로 교체하십시오. 챔버를 냉장고로 옮겨 4 °C에서 10분 동안 보관하십시오.

염색 후 플라스마 막을 통한 염료의 세포 내 유입이 크게 억제되므로, 순수 SMEM으로 과잉 염료를 여러 번 주의 깊게 세척합니다. 마지막으로 챔버에 1.5 milliliters의 SMEM을 남겨둡니다. 세포는 오일 침강 렌즈, 모노크로메이터 및 CCD 카메라가 장착된 형광 현미경을 사용하여 관찰합니다.

데이터 수집 소프트웨어에서 들뜸 파장을 419 nanometers로 설정하고, 여기서는 적용하지 않았으나 약 605 nanometers로 설정된 밴드패스 필터를 선택합니다. Diet aaps는 막전위의 비례 측정(ratio metric measurement) 또한 가능하게 합니다. 세포가 담긴 챔버를 현미경 스테이지 위에 놓고, 챔버 바닥에 전극을 배치한 후 이를 펄스 발생기에 연결합니다.

본 예시에서는 진폭 35 V, 지속 시간 50 ms인 사각 펄스를 생성합니다. DC 전압 공급 장치와 마이크로프로세서 제어 스위처를 사용하여 펄스를 한 쌍의 전극에 전달함으로써 전극 사이에 전기장을 형성하고 막 전압을 유도합니다. 펄스 전달은 이미지 획득 과정과 동기화되어야 합니다.

관심 세포를 찾고, 각 펄스당 단일 전기 펄스 또는 일련의 펄스 시퀀스를 인가합니다. 염료의 반응성이 낮으므로, 펄스 직전의 대조군 이미지와 펄스 인가 중의 펄스 이미지 등 두 개의 형광 이미지를 획득합니다. 형광의 변화는 구분하기 어려우며, 각 펄스에 대한 이미지를 처리한 후에야 뚜렷하게 나타납니다.

대조군 이미지와 펄스 이미지 모두에서 배경을 감산합니다. 세포 하나를 선택하고 관심 영역(ROI)이 세포막에 해당하도록 설정합니다. 대조군 및 펄스 이미지에서 해당 영역을 따라 형광을 측정하고, 각 펄스에 대한 값을 스프레드시트로 옮깁니다.

펄스 데이터에서 대조군 데이터를 뺀 후, 그 결과를 대조군 데이터로 나누어 상대적 형광 변화량을 구합니다. 일련의 펄스가 가해진 경우, 각 펄스에 대해 결정된 상대적 변화값들의 평균을 낼 수 있습니다. 더 신뢰할 수 있는 측정값을 얻으려면, 상대적 형광 변화량을 유도된 막 전압으로 변환하십시오.

검정 곡선을 사용하며, 이 곡선의 대략적인 추정치는 문헌에서 얻을 수 있으나, 더 높은 정확도를 위해서는 각 특정 설정에 대해 측정해야 합니다. 상대적 호 길이에 따른 전압의 함수로 그래프를 그립니다. 또한 구형 세포의 경우 적절한 필터를 사용하여 곡선을 매끄럽게 만들 수 있습니다.

결과 그래프는 Schwan 방정식과 일치하며 코사인(co-sign) 형태에 가깝게 나타납니다. 더 복잡한 세포 모양의 경우, 동일한 절차를 통해 막 전압의 더 정교한 공간적 분포를 얻을 수 있습니다.