Name: 가역 Biotinylation에 의해 플라즈마 막 단백질 Endocytic 요금 측정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-12-23T16:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 32 s
Description: 배우세요 가역 바이오틴화법을 이용하여 세포막 단백질의 내재화 속도를 측정하는 방법을. 이 기법은 도파민 수송체(DAT)와 같은 막 단백질 동역학 연구에 활용됩니다.

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이 작품은 # DA15169 앙에 NIH 교부금에 의해 투자되었다

절차 개요 : 이 방법을 사용하여, 세포 표면 단백질은 covalently (그림 참조 1. 인신 매매 제한 조건 (즉, 낮은 온도)에서 막 impermeant, 이황화 결합 biotinylation 시약을 (sulfo - NHS - SS - 비오틴)를 사용하여 사용 가능한 세포 리신 잔류물에 비오틴과 레이블 아르 그림에 대한). 세포 중 하나 세트 매매 허용 조건 이동 (37 ° C)와 biotinylated 단백질 internalize입니다. 세포의 다른 집합 시간 = 0 1)의 전체 표면 단백질, 그리고 2) 스트립 컨트롤에 대한 컨트롤로 저온에서 보관됩니다. 국제화의 짧은 기간에 따라, 세포가 내면화을 막을 저온으로 이동하고, 잔여 표면 비오틴은 이황화 결합 비오틴을 클리브스 감소 요원과 세포를 치료에 의해 해제 벗겨지고 있습니다. 세포 표면에서 발생한 및 internalized되었습니다 Biotinylated 단백질은 스트립 단계에서 보호하고 있으며, 남아있는 유일한 biotinylated 단백질 것입니다. 세포 용해 후, biotinylated 단백질은 streptavidin 친화도 크로마 토그래피에 의해 고립되고 관심의 단백질은 양적 immunoblotting에 의해 감지됩니다. endocytic 속도를 확인하려면, internalized 단백질의 양은 시간이 = 0에 표시된 전체 표면 제어 비교됩니다. 우리는 성공적으로의 연결을 norepinephrine 1 도파민 1-4 전송기의 국제화 속도를 측정하는이 방법을 사용했습니다. 상세 프로토콜 : 1 일 : <ol><li> 그들은 일 2 ~ 80 %의 합류한다는 등 6 접시에 잘 플레이트 세포. 또는, transfected 세포를 사용하고있다면, 그들은 국제화 속도가 측정되는 시간 ~ 80 %의 합류됩니다 같은 밀도에서 transfect. 세포가 강력하게 자기편하지 않는 경우, 조직 문화 도자기는 광범위한 세척 단계 동안 세포 손실을 방지하기 위해 세포 부착 기판 (예 : 폴리 - D - 라이신)와 함께 치료를해야합니다. </li><li> 각각의 단백질이 테스트되고 들어, 하나의 접시에 번호판이 우물은 전체 표면 단백질 (T = 0)와 스트립 컨트롤로 사용할 수 있습니다. 두 번째 접시에, 테스트중인 각각의 국제화 조건에 대해 잘 플레이트 한 (즉, 기초 endocytic 속도 대 약물 치료). </li><li> 일 2 사용하기 위해 지정된 온도에서 다음과 같은 솔루션 및 상점 준비 : <ul><li> PBS 2 + : 인산 1.5 MM MgCl 2, 0.2 MM CaCl 2, (4 ° C)과 보충 (산도 7.4) 살린 버퍼 </li><li> Biotinylation는 솔루션 끄지 : PBS 2 + 100 MM 글리신 (4 ° C)와 보충 </li><li> NT 버퍼 : 150 MM NaCl, 1.0 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 0.2 % BSA, 20 MM 트리스, 산도 8.6 (4 ° C) </li><li> 리파 버퍼 : 10 MM 트리스, 산도 7.4, 150 MM NaCl, 1.0 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 0.1 % SDS, 1.0 % 트리톤 X 100, 1.0 %의 나트륨 deoxycholate (4 ° C) </li><li> Sulfo - NHS - SS - 비오틴 주식 솔루션 : 200 MG / ML (-20 ° C)에 (DMSO) dimethylsulfoxide에서 디졸브 </li><li> 트리스 (2 - Carboxyethyl) phosphine 하이드로 클로라이드 (TCEP) 재고 솔루션 : H 2 O 500 MM (-20 ° C, 빛을 차단하는 호일로 덮여) </li></ul></li></ol> 일 2 : <ol><li> PBS 2 + 0.18g/ml 포도당과 보충, 0.2 % IgG / 프로 테아제 무료 소 혈청 알부민 (PBS 2 + / g / BSA). 준비 ° C 물 목욕에서 37 미리 따뜻한이 솔루션입니다. </li><li> DMSO을 녹일 벤치 위에 sulfo - NHS - SS - 비오틴 주식 솔루션을 누그 러 뜨 리다. 사용하기 바로 전에, 신선한 sulfo - NHS - SS - 비오틴 솔루션 (2.5 얼음 차가운 PBS 2 +, 0.75에 대한 충분한 ML / 음에 MG / ML) 준비합니다. DMSO를 solubilize하기 위해 적극적으로 소용돌이 솔루션입니다. NHS - 비오틴 시약이 수용액에서 쉽게 분해됩니다. 따라서, 모든 솔루션은 사용하기 전에 바로 준비를해야합니다. </li><li> Biotinylation : 플레이스 추운 방에 얼음 욕조에 접시와 얼음 차가운 PBS 2 3 X 2 ML을 씻어 +. 접시가 약간 완전한 배수 및 버퍼 솔루션의 제거를 허용하기 위해 직각 것을 확신한다. / 잘 각 잘 수있는 신선한 sulfo - NHS - SS - 비오틴 솔루션의 0.75 ML을 추가합니다. 부화 X 15 ', 4 명이 활발한 흔들림으로 얼음 욕조에 C. 배양이 완료되면, 또 다른 신선한 sulfo - NHS - SS - 비오틴 솔루션을 준비합니다. 신선한 솔루션 및 부화 X 15 ', 4 ° C.와 함께 기존 솔루션을 대체 </li><li> 담금질 : 그들이 함께 반응하고 세포 lysed되면 세포내 단백질을 biotinylate 않도록 모든 비 반응 NHS - 비오틴 분자가 침묵하는 중요한 IT합니다. 칭 솔루션 세포에게 3 X 2 ML 씻으십시오 2 ML의 담금질 솔루션 X 15 ', 4 명이 부드러운 잡고 C 두 번 품어. </li><li> 국제화 : 약물 치료가 테스트되고있다면, PBS 2 + / g / BSA 적절한 약물 농도를 추가합니다. 4 ° C에서 컨트롤 플레이트를 유지하고 국제화 플레이트 차가운 방에서 가지고. 사전 예열 PBS 2 3 X 2 ML 씻으 + / g / BSA (+ / - 박사동일한 솔루션 (2 ML / 음)에 UGS)와 두십시오. 접시에 걸쳐도 온도를 보장하기 위해 미리 예열 솔루션으로 모든 빈 우물을 입력합니다. 10 '에 대한 37 ° C 배양기에 세포를 전송합니다. 37 종료 즉시 이전 ° C 부화, 얼음 스트립 단계 및 저장을 위해 사용되는 NT 버퍼의 신선한 50 MM의 TCEP 솔루션을 준비합니다. 1.0 ML / 음에 대한 충분한 양의를 준비합니다. </li><li> 스트립 : 얼음 욕조와 차가운 방으로 다시 즉시 전송 플레이트 (S). 신속 얼음 차가운 NT 버퍼, 3 세포를 씻어 endocytosis를 중지 X 2 ML. 또한 NT 버퍼와 스트립 제어 우물 3 X 2 ML 씻는다. 각 물론 1.0 ML 신선한 잎을 솔루션을 추가합니다. 부드러운 잡고, 얼음 15 ', 4 ° C를 품어. 신선한 스트립 솔루션 우물을 교체하고 얼음에 추가 15 ', 4 ° C를 품어. </li><li> 용해 : 스트립 솔루션, 3 X 2 ML NT 버퍼에 노출된 모든 우물을 씻으십시오. 다음 3 * 2 ML PBS 2 + 모든 우물 (총 컨트롤 포함) 씻으십시오. 신선한 테아제 억제제 (1.0 MM PMSF, 1.0 μg / ML 각 류펩틴, aprotinin과 pepstatin)이있는 300μl/well 리파 버퍼 (또는 관심의 단백질에 대한 호환 가능한 다른 용해 버퍼)에 Lyse. X 20 ', 4 ° C.를 흔들어하여 Lyse 18,000 XG, 10 ', 4 ° C.를 centrifuging하여 microfuge 튜브 맑은 세포 부스러기로 전송 </li><li> 단백질 농도 결정 : 표준 BSA 곡선에 비해 lysates의 단백질 농도를 결정하여 용해 조건 (예 : DC 단백질 분석, 바이오 래드)와 호환되는 단백질 분석을 사용합니다. </li><li> Streptavidin 친화도 크로마 토그래피 : 각 시료에 대해 동일한 양의 단백질과 microfuge 튜브를 준비합니다. 200μl 각 샘플의 최종 볼륨을 가지고 용해 버퍼를 추가합니다. 소용돌이 streptavidin 아가로 오스 비즈 최선을 다해도 중지 가지고 있습니다. 끝에있는 200μl pipettor을 사용하면 각각의 튜브에, 피펫 비즈를 잘라. 20μl beads/50 μg의 lysate를 추천. 튜브 회전에서 하룻밤, 4 ° C를 품어. </li></ol> 3 일 : <ol><li> 비드 세척 : 원심 분리기 샘플, 18000 XG 2 '구슬을 수집합니다. 흡인기로 비드 펠렛 접근하지 않도록주의하고, lysate를 대기음. 더 나은 컨트롤에 대한 흡인기의 끝에 플라스틱 피펫 팁을 사용합니다. 0.75 ML의 용해 각각의 튜브에 버퍼, 그리고 구슬을 씻어 와동을 추가합니다. 원심 분리기 샘플, 18000 XG 2 '구슬과 반복 뜻을 수집하고 (총 세 세척) 두 번 세탁합니다. 최종 세척 후, 비드 펠렛을 방해하지 않고 가능한 버퍼만큼 대기음. 흡인기쪽으로 튜브를 티핑하면이 단계 지원합니다. </li><li> 샘플 용출 : 각 튜브 20 - 25μl 2X Laemmli 샘플 버퍼 (감소)를 추가합니다. 감소 에이전트 솔루션으로 분리된 단백질을 방출 클리브는 NHS - SS - 비오틴의 이황화 결합합니다. 대부분의 멤브레인 단백질이 삶은 때 집계에 매우 취약하며, SDS - PAGE를위한 젤에 로딩하기 전에 가열해서는 안됩니다. 이러한 실험을 수행하기 전에 관심의 단백질의 열 감도를 확인합니다. 단백질 / 끓는 난방을 용인할 수 없다면, SDS - PAGE로 분석하기 전에 회전, 30 ', 실온에서 알을 품다. 이것은 클리브 이황화 결합에 충분하고 단백질을 elute. </li><li> SDS - PAGE과 immunoblotting : SDS - PAGE에 의해 분리 단백질. 각 샘플은 다음 순서로 샘플을 실행하는 가장 쉬운 방법을입니다 단백질에 적합한 항체와 함께 총 표면 (시간 = 0), 스트립, 국제화 조건 # 1, 조건 # 2, 등등 immunoblotting을 위해 막에 전송하고 얼룩 관심. 더 포화 픽셀이 없다는 것을 확신하고, CCD 카메라 겔 문서 시스템을 사용 immunoreactive 밴드를 캡처합니다. 겔 분석 / densitometry 소프트웨어를 사용하여 각 밴드 밀도를 계량. </li></ol> 대표 결과 : 대표 immunoblot 결과는 그림 2A에 표시됩니다. 강한 신호는 이전에 내면화하는 표면 단백질의 총 금액은 "총"레인 (T)에 있습니다. "스트립"제어 (S)는 이상적인 스트립이 실험을 위해 효율적인 것을 보여줍니다 공백에 가까이해야합니다. 스트립 효율성은 "총"차선의에있는 '스트립'차선의 밀도를 비교하여 계산 (스트립과 병렬로 biotinylated되었다 예 : 단백질,하지만 둘 다 37 ° C로 예열하지 않고 스트립 솔루션에 노출되었습니다.) 다음과 같은 공식이 사용됩니다 : [1 - (스트립 / 총)] * 백퍼센트 이 수식을 사용하여, 그림 2의 스트립은 99.8 % 효율되었다. 마지막으로, 당신은 국제화 차선의 총 (S) (I)보다 낮은 강도의 밴드를 볼 수 있습니다. 예를 들어 (그림 2)에서 치료 세포가 차량 또는 10 중에 1μM phorbol myristate 아세테이트 (PMA) 중 하나와 함께 치료를했다 초기 국제화 시대 '국제화와 도파민 전송 국제화 요금은 10 측정되었다. 국제화 속도로 계산됩니다다음 : 합계 / internalized * 100 그림 2B에서 본, 10.4 % 표면 DAT는 차량 처리 조건에서 10 '이상 internalized. PMA 치료 총 표면 DAT의 23.2 %에 DAT의 국제화 속도를 향상시켰습니다. <img src="/files/ftp_upload/1669/1669fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 프로토콜 일러스트 레이션. 전지 4 biotinylated 아르 ° C가 독점적으로 표면 인구 라벨, 37으로 이동 아르 ° C 국제화를 시작합니다. 국제화에 따라, 세포가 빠르게 endocytic 프로세스와 잔여 표면 비오틴를 중지 추위 것은 줄이고 요원과 세포를 치료에 의해 분해까지입니다. 남아있는 유일한 biotinylated 단백질은 t = 0의 표면에서 발생한 및 internalized 있었다 따라서 스트립 치료에서 그들을 보호하시는 분들입니다. Biotinylated 단백질은 streptavidin 비즈와 함께 배치 친화도 크로마 토그래피에 의해 고립되고 관심의 단백질은 immunoblotting에 의해 감지됩니다. <img src="/files/ftp_upload/1669/1669fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. PKC의 활성화는 DAT endocytic 속도를 증가시킵니다. 내면화 분석은. 안정 DAT 표현 PC12 세포는 biotinylated, 4 ° C로 "상세 프로토콜"에 설명되어 하였다. 전지는 급속하게 37 기까지했다 ° C ± 1 μm의 PMA와 incubated 10 '37 ° C. 나머지 비오틴은 줄임으로써 뺏겼어요, streptavidin 친화도 크로마 토그래피에 의해 세포 lysed되었고 biotinylated 단백질은 고립되었다. (A) 대표 immunoblot 총 표면 DAT를 보여주는 t에서 = 0 (T), 스트립 제어 (S), 그리고 지정된 조건 하에서 internalized DAT (I). (B) 밴드는 CCD 카메라로 캡처한 및 수량 데이터 소프트웨어 (바이오 래드)와 계량되었습니다. 데이터는 %의 총 DAT internalized/10의 분으로 표현됩니다. <img src="/files/ftp_upload/1669/1669fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. 예 immunoblot는 가난한 비오틴의 스트립. 내면화 분석을 묘사한. 안정 DAT 표현 PC12 세포는 biotinylated, 4 ° C로 "상세 프로토콜"에 설명되어 하였다. 전지는 급속하게 37 기까지했다 ° C와 incubated 10 '37 ° C. 나머지 비오틴은 줄임으로써 뺏겼어요, streptavidin 친화도 크로마 토그래피에 의해 세포 lysed되었고 biotinylated 단백질은 고립되었다. immunoblot 총 표면 DAT를 보여줍니다 t = 0에서 (T), 스트립 제어 (S), 그리고 internalized DAT (I). 가난한 스트립 효율을 나타내는 스트립 제어 차선에서 보이는 밴드를합니다.

<ol><li>Holton, K. L., Loder, M. K., Melikian, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonclassical+distinct+endocytic+signals+dictate+constitutive+and+PKC-regulated+neurotransmitter+transporter+internalization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Nonclassical distinct endocytic signals dictate constitutive and PKC-regulated neurotransmitter transporter internalization.</a> Nat Neurosci. 8, 881-888 (2005).</li>
<li>Boudanova, E., Navaroli, D. M., Melikian, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amphetamine-induced+decreases+in+dopamine+transporter+surface+expression+are+protein+kinase+C-independent%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Amphetamine-induced decreases in dopamine transporter surface expression are protein kinase C-independent.</a> Neuropharmacology. 54, 605-612 (2008).</li>
<li>Boudanova, E., Navaroli, D. M., Stevens, Z., Melikian, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+transporter+endocytic+determinants%3A+carboxy+terminal+residues+critical+for+basal+and+PKC-stimulated+internalization%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dopamine transporter endocytic determinants: carboxy terminal residues critical for basal and PKC-stimulated internalization.</a> Mol Cell Neurosci. 39, 211-217 (2008).</li>
<li>Loder, M. K., Melikian, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dopamine+transporter+constitutively+internalizes+and+recycles+in+a+protein+kinase+C-regulated+manner+in+stably+transfected+PC12+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The dopamine transporter constitutively internalizes and recycles in a protein kinase C-regulated manner in stably transfected PC12 cell lines.</a> J Biol Chem. 278, 22168-22174 (2003).</li>
</ol>

일반적인 문제 :이 실험에서 발생하는 가장 일반적인 문제는 가난한 스트립의 효율성이다. 스트립의 효율 결과를 해석하는 수있는에 중요합니다. 스트립은 매우 효율적인 게 아니라면, 그것은 국제화 차선에 biotinylated 단백질의 표면에서 internalized 사실에 있다고 결론하는 것은 불가능합니다. 스트립 ≥ 90 % 효율이 최적이며, 스트립이 수준 아래로 떨어지면면 우리는 어떤 결과를 폐기하십시오. 가난한 스트립의 예제는 그림 3에 표시됩니다. 스트립 차선에있는 밴드가 꽤 볼, 34 %의 스트립 효율에 해당합니다. 가난한 스트립 효율이 발생하면, 신선한 TCEP 전에 세포에 추가 바로 만든되지 않았을 수 있습니다. 또는 TCEP가 타락 수와 새로운 시약은 구입해야합니다. TCEP 가루를 사용하면, 오히려 솔루션보다,이 문제를 우회 수 있습니다. 가능한 수정 : 현재 보고서에서, 우리는 국제화의 초기 10 분 과정을 점령 상대 DAT의 국제화 속...

가역 biotinylation에 의해 플라즈마 막 단백질 endocytic 요금 측정

Measuring Plasma Membrane Protein Endocytic Rates by Reversible Biotinylation

플라즈마 막 단백질은 수용체, 이온 채널, 전송기 및 펌프로 구성된 단백질 많은 다양한 그룹입니다. 이 단백질의 활동이 양분 전달, 세포 흥분, 화학 신호를 포함한 주요 세포 행사의 다양한 책임이 있습니다. 대부분의 플라스마 막 단백질은 동적 단백질 표면 표현을 변경하여 단백질 기능을 modulates endocytic 인신 매매에 의해 규제됩니다. 단백질 endocytosis를 촉진 메커니즘은 복잡하며 충분히 많은 막 단백질에 대한 이해되지 않습니다. 완전히 주어진 단백질의 endocytic 밀매를 제어하는​​ 메커니즘을 이해하기 위해서는 단백질의 endocytic 속도가 정확하게 측정하는 것이 중요합니다. 많은 수용체에 대한 직접 endocytic 속도 측정이 자주 표시 수용체 리간드를 활용 달성하고 있습니다. 그러나, 전송기, 펌프와 이온 채널과 같은 막 단백질의 여러 클래스에 대한, endocytic 속도를 측정하는 데 사용할 수있는 편리 리간드가 없습니다. 현재 보고서에서, 우리는 도파민 수송 (DAT) endocytic 속도를 측정하기 위하여 고용 가역 biotinylation 방법을 설명합니다. 이 방법은 국제화 속도를 측정하는 간단한 방법을 제공하며, 쉽게 대부분의 막 단백질의 밀매 연구에 대한 고용 수 있습니다.

규제 endocytosis는 막 단백질의 대부분의 세포 표면 발현 수준을 관리합니다. 여기서 우리는 도파민 전송 (DAT), polytopic 멤브레인 단백질의 endocytic 속도를 측정하는 줄이할 수있는, 멤브레인 impermeant biotinylation의 시약을 사용합니다. 방법은 대부분의 플라즈마 막 단백질의 endocytic 속도를 측정하는 직접적인 접근을 용이하게합니다.

가역 Biotinylation에 의해 플라즈마 막 단백질 Endocytic 요금 측정

세포막 단백질은 수용체, 이온 통로, 운반체 및 펌프로 구성된 방대하고 다양한 단백질 그룹입니다. 이러한 단백질의 활성은...

본 프로토콜은 환원 가능한 막 투과 시약을 사용하여 대부분의 세포막 단백질의 내포 작용 속도를 측정하는 일반적인 방법을 제공합니다. 이 절차에서, 세포 외 라이신을 포함하거나 Sulfo-NHS-SS-biotin(여기서는 녹색으로 표시됨)으로 4 °C에서 공유 결합 표지된 세포 표면 단백질을 처리합니다. 다음으로, 표면 단백질의 내포 작용이 일어날 수 있도록 세포를 37 °C로 가온합니다. 이후 세포를 다시 4 °C로 낮추어 막 수송을 중단시키고, 이황화 결합을 끊어내는 환원제를 사용하여 잔류 표면 비오틴을 제거합니다.따라서 남아 있는 비오틴화 단백질은 세포 표면에서 유래하여 내부로 유입되었으며, 스트리핑 과정으로부터 보호된 단백질뿐입니다. 마지막으로, 세포를 가용화하고 strep avid 및 친화성 크로마토그래피를 통해 비오틴화 단백질을 분리합니다. 안녕하세요, 저는 매사추세츠 대학교 의과대학 정신과 Heli Milk Ian 교수님 연구실의 Luke Gabriel입니다.오늘은 가역적 비오틴 제거 기술을 사용하여 내포 작용 또는 내부화 속도를 측정하는 절차를 보여드리겠습니다. 저희는 도파민 운반체의 내부화 속도를 측정하기 위해 이 절차를 사용합니다. 그럼 시작하겠습니다.실험 하루 전에 다음 날 사용할 세포와 기질을 준비합니다. 세포 유형과 배지는 다양할 수 있으나, 실험 세포의 부착력이 강하지 않은 경우에는 6-웰 플레이트의 각 웰에 폴리리신(polylysine)이 코팅된 조직 배양 플레이트와 같은 적절한 세포 부착 기질을 사용하십시오. 두 개의 별개 플레이트를 사용하여 총 4개의 웰에 라벨을 붙입니다.테스트하는 각 단백질에 대해, 대조군 플레이트의 웰 두 개를 총 표면 단백질 및 스트리핑 대조군용으로 사용합니다. 테스트하려는 각 내재화 조건에 맞게 실험 플레이트의 웰을 준비합니다. 다음 날까지 세포가 약 80% 정도로 융합(confluent)될 수 있도록 2 mL의 세포 배양액에 1 × 10⁶개의 세포를 플레이팅합니다.세포 배양 후, 다음 용액들을 조제하여 4°C에 보관하고 2일 차에 사용하십시오. PBS 2+는 pH 7.4의 인산염 완충 식염수에 1.5 mM magnesium chloride와 0.2 mM calcium chloride를 첨가하여 조제합니다. Tonation quench 용액은 PBS 2+에 100 mM glycine을 첨가하여 조제합니다. NT buffer는 150 mM sodium chloride, 1 mM EDTA, 0.2% BSA, 20 mM triss를 포함하며 pH 8.6으로 조제합니다. Ripa buffer는 pH 7.4의 10 mM triss, 150 mM sodium chloride, 1 mM EDTA, 0.1% SDS, 1% trite x 100, 0.1% sodium deoxy coate를 사용하여 조제합니다.다음으로, SULF N-H-S-S-S biotin 스톡 용액을 SULFOXIDE 또는 DMSO에 녹여 200 mg/mL 농도로 준비합니다. 500 µL씩 소분하여 -20 °C에서 보관하십시오. 소분된 용액은 이후 여러 번의 동결-해동 사이클을 거쳐도 무방합니다.50 mM tris에 용해하여 500 mM 농도로 TCEP(Two carboxy ethyl phosphine hydrochloride) 스톡 용액을 준비하고 pH를 7.4로 조정합니다. TCEP는 강산성이므로 용액의 pH를 7.4로 조정해야 하며, TCEP 용액을 커버와 호일로 감싼 후 -20 °C에서 보관하십시오. 둘째 날에는 0.18% glucose와 0.2% IgG protease-free bovine serum albumin이 첨가된 PBS two plus 또는 PBS two plus GBSA를 준비하여 워터 배스에서 37 °C로 예열하십시오.SFO N-H-S-S-S biotin 스톡 용액을 상온에서 해동합니다. 사용 직전에 신선한 sulfur N-H-S-S-S biotin 용액을 준비합니다. DMSO를 용해시키기 위해 용액을 강하게 볼텍싱합니다.두 플레이트를 냉실의 아이스 배스 위에 놓고, 플레이트를 약간 기울여 버퍼가 완전히 배출되도록 유지하면서 각 웰을 2 mL의 ice cold PBS 2+로 3회 세척합니다. 마지막 세척 후, 각 웰에 신선한 sulfo-NHS-SS-biotin 솔루션을 웰당 0.75 mL씩 분주합니다. 아이스 배스 위 4 °C에서 15분 동안 인큐베이션하며, 인큐베이션 종료 직전에 플랫폼 쉐이커를 사용하여 강하게 흔들어 줍니다.새로운 SUHO N-H-S-S-S biotin 용액을 추가로 준비하고, 15분 후에 기존 용액을 새 용액으로 교체합니다. 2차 배양 후, 플랫폼 셰이커에서 강하게 흔들어주며 4°C에서 15분 더 배양하고, 2 mL의 켄칭 용액으로 세포를 빠르게 3회 세척하여 반응하지 않은 모든 NHS biotin 분자를 켄칭합니다. 그 다음, 2 mL의 켄칭 용액에서 15분 동안 배양합니다.15분 후에 신선한 퀀칭 용액(quenching solution)으로 교체하고 15분 동안 추가로 배양합니다. 각 배양 단계 동안 플레이트를 4 °C에서 플랫폼 쉐이커를 이용해 부드럽게 흔들어주며 유지하고, 대조군 플레이트는 콜드룸 내 벤치탑의 퀀칭 용액에 그대로 둡니다. 이 시점에서 실험군 플레이트를 콜드룸의 아이스 배스에서 꺼냅니다.약물 처리 테스트를 수행하는 경우, 예열된 PBS 2 + GBSA에 적절한 농도의 약물을 첨가합니다. 본 실험에서는 PKC 경로를 활성화하기 위해 에탄올 용매 또는 1 µM PMA(phorbol 12-myristate 13-acetate)를 사용합니다. 실험 플레이트의 각 웰을 예열된 PBS 2 + GBSA 2 mL로 3회 세척하고, 마지막 세척 후 적절한 약물 처리를 수행합니다.해당하는 PBS 2 + GBSA 용액 2 mL를 첨가하고, 플레이트 전체의 온도를 균일하게 유지하기 위해 비어 있는 웰은 미리 데운 배지로 채웁니다. 배양 종료 직전에 세포를 37 °C 인큐베이터로 옮겨 10분 동안 둡니다. NT 버퍼 내의 50 mM TCEP 용액을 사용하여 신선한 스트리핑 용액을 준비하고 얼음 위에 보관합니다.웰당 1 mL에 해당하는 충분한 양을 준비합니다. 10분간 배양한 후, 실험 플레이트를 빠르게 얼음 수조로 옮겨 냉장실로 다시 이동시킵니다. 내포 작용(endocytosis)을 중단시키기 위해 얼음처럼 차가운 NT buffer를 웰당 2 mL씩 사용하여 실험 웰을 세 번 신속하게 세척합니다.그런 다음 stripping control well을 2 mL의 ice cold NT buffer로 3회 세척합니다. total control well은 quench solution에 그대로 둡니다. 각 experimental well과 strip control well에 1 mL의 stripping solution을 첨가하고 얼음 위에서 15분 동안 배양합니다.배양 종료 전 4 °C에서 부드럽게 흔들어 줍니다. 다시 이전과 동일한 부피의 신선한 스트리핑 용액을 준비하십시오. 15분 후, 기존의 스트리핑 용액을 신선한 용액으로 교체하고, 세포를 먼저 용해시키기 위해 4 °C에서 부드럽게 흔들며 15분 동안 추가로 배양합니다.스트리핑 용액에 노출된 모든 웰을 2 mL의 NT buffer로 3회 세척합니다. 그다음, 토털 컨트롤을 포함한 모든 웰을 2 mL의 차가운 pbs로 3회 세척합니다. 마지막 세척 후, 신선한 프로테아제 억제제가 포함된 RIPPA buffer 300 µL를 각 웰에 첨가하고 4 °C에서 20분 동안 흔들어 세포를 용해합니다.용해물을 1.5 milliliter 마이크로 튜브로 옮기고, 4 °C에서 18,000 GS로 10분 동안 원심분리하여 세포 파편을 제거합니다. 용해 조건과 호환되는 단백질 분석법(예: Pierce사의 BCA protein assay)을 사용하여 표준 bovine serum albumin 곡선과 비교함으로써 용해물의 단백질 농도를 측정합니다. 그 후, strep 및 친화성 크로마토그래피를 위해 용해물을 준비합니다.각 샘플에서 동일한 양의 단백질을 1.5 milliliter 마이크로 원심분리 튜브에 채웁니다. 본 실험에서는 50 microgram의 세포 용해물에서 비오틴화 단백질을 분리합니다. 각 샘플의 최종 부피가 200 microliters가 되도록 프로테아제 억제제가 포함된 RIPA 버퍼를 첨가합니다.다음으로, 사용 전 strep avid 및 agro beads를 격렬하게 볼텍싱합니다. 팁 끝을 자른 200 µL 피펫을 사용하여 각 튜브에 stripped avid 및 beads 20 µL를 분주합니다. 튜브를 볼텍싱한 후, 튜브 로테이터를 사용하여 4 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 상온에서 18,000 ×g로 2분간 원심분리하여 beads를 수집합니다. 흡입기로 beads 펠렛에 닿지 않도록 주의하며 용해물을 제거한 후, 상온의 용액 0.75 mL를 추가합니다.각 튜브에 Rip buffer를 넣고 최고 속도로 vortexing 하여 비드를 세척합니다. 18,000 GS에서 2분 동안 원심분리합니다. 상온에서 비드를 모으고, 이 세척-vortexing-원심분리 사이클을 두 번 더 반복하여 최종 세척까지 총 3회 세척합니다.비드 펠렛이 흐트러지지 않게 주의하며 완충액을 최대한 흡입하여 제거합니다. 다음으로 각 튜브에 2x 환원 라멜리 완충액(reducing lamely buffer) 20 to 25 µL를 첨가합니다. 환원제는 N-H-S-S-S 비오틴 이황화 결합을 끊어 분리된 단백질을 용액 속으로 방출시킵니다.대부분의 막 단백질은 가열 처리를 견딜 수 없으므로, 환원 및 변성 후 회전 혼합기(rotator)를 사용하여 상온에서 30분 동안 배양하여 단백질을 분리합니다. 표준 SDS-PAGE를 사용하여 단백질을 막으로 전이시킨 후 면역 블로팅을 수행하며, 적절한 항체로 반응시킵니다. 본 실험에서는 Checon 사의 rat anti-DAT 항체(제품 번호 360 9)를 1:2000으로 희석하여 사용하며, 포화된 픽셀이 없음을 확인하며 CCD 카메라 겔 문서화 시스템을 사용하여 면역 반응 밴드를 캡처합니다. 본 실험에서는 Bio-Rad VersaDoc 이미징 시스템과 Quantity One 소프트웨어를 사용하여 각 밴드의 밀도를 정량화합니다.도파민 운반체에 대한 가역적 표지 절차의 대표적인 면역 블록 결과가 여기에 제시되어 있습니다. 가장 강한 신호는 총(total) 레인 또는 T에서 확인되는 내재화 전 표면 단백질의 총량입니다. 스트립 대조군(strip control) 또는 S는 이상적으로 공백에 가까워야 하며 높은 스트립 효율을 나타내야 합니다. 스트립 효율은 다음 공식에 밴드 밀도 측정값을 사용하여 계산합니다.본 실험에서 이 스트립의 효율은 99.8%였습니다. 효율이 90% 이상인 스트립이 최적이며, 이 수준 미만의 결과는 폐기해야 합니다. 이 포어 스트립(pore strip)의 예시는 스트립 효율이 34%인 스트립 레인에 가시적인 밴드를 보여줍니다. 여기서 강도가 더 낮은 밴드들은 실험 플레이트에서 얻은 내재화 레인입니다. 세포를 vehicle 용액 또는 1 µM PMA로 10분 동안 내재화 처리한 후, 도파민 운반체 내재화 속도를 측정하였습니다.내입화 속도는 밴드 밀도 측정값을 사용하여 다음과 같이 계산합니다. 이 그래프에서 볼 수 있듯이, vehicle 처리 조건에서는 10분 동안 표면 DAT의 10.4%가 내입화되었습니다. 하지만 PMA 처리는 DAT 내입화 속도를 전체 표면 DAT의 23.2%까지 증가시켰습니다. 지금까지 가역적 바이오티닐화 기술을 사용하여 세포막 단백질의 내입화 속도를 측정하는 방법을 살펴보았습니다.바이오 토네이션(bio tonation) 시약과 TCP를 사용 직전에 신선하게 준비해야 한다는 두 가지 사항을 기억하는 것이 중요합니다. 프로토콜 진행 중 세포 손실이 많이 발생한다면, 플레이트에 세포 부착 기질을 사용하십시오. 이것으로 모든 과정을 마칩니다.시청해 주셔서 감사합니다. 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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