가역 Biotinylation에 의해 플라즈마 막 단백질 Endocytic 요금 측정

본 프로토콜은 환원 가능한 막 투과 시약을 사용하여 대부분의 세포막 단백질의 내포 작용 속도를 측정하는 일반적인 방법을 제공합니다. 이 절차에서, 세포 외 라이신을 포함하거나 Sulfo-NHS-SS-biotin(여기서는 녹색으로 표시됨)으로 4 °C에서 공유 결합 표지된 세포 표면 단백질을 처리합니다. 다음으로, 표면 단백질의 내포 작용이 일어날 수 있도록 세포를 37 °C로 가온합니다. 이후 세포를 다시 4 °C로 낮추어 막 수송을 중단시키고, 이황화 결합을 끊어내는 환원제를 사용하여 잔류 표면 비오틴을 제거합니다.

따라서 남아 있는 비오틴화 단백질은 세포 표면에서 유래하여 내부로 유입되었으며, 스트리핑 과정으로부터 보호된 단백질뿐입니다. 마지막으로, 세포를 가용화하고 strep avid 및 친화성 크로마토그래피를 통해 비오틴화 단백질을 분리합니다. 안녕하세요, 저는 매사추세츠 대학교 의과대학 정신과 Heli Milk Ian 교수님 연구실의 Luke Gabriel입니다.

오늘은 가역적 비오틴 제거 기술을 사용하여 내포 작용 또는 내부화 속도를 측정하는 절차를 보여드리겠습니다. 저희는 도파민 운반체의 내부화 속도를 측정하기 위해 이 절차를 사용합니다. 그럼 시작하겠습니다.

실험 하루 전에 다음 날 사용할 세포와 기질을 준비합니다. 세포 유형과 배지는 다양할 수 있으나, 실험 세포의 부착력이 강하지 않은 경우에는 6-웰 플레이트의 각 웰에 폴리리신(polylysine)이 코팅된 조직 배양 플레이트와 같은 적절한 세포 부착 기질을 사용하십시오. 두 개의 별개 플레이트를 사용하여 총 4개의 웰에 라벨을 붙입니다.

테스트하는 각 단백질에 대해, 대조군 플레이트의 웰 두 개를 총 표면 단백질 및 스트리핑 대조군용으로 사용합니다. 테스트하려는 각 내재화 조건에 맞게 실험 플레이트의 웰을 준비합니다. 다음 날까지 세포가 약 80% 정도로 융합(confluent)될 수 있도록 2 mL의 세포 배양액에 1 × 10⁶개의 세포를 플레이팅합니다.

세포 배양 후, 다음 용액들을 조제하여 4°C에 보관하고 2일 차에 사용하십시오. PBS 2+는 pH 7.4의 인산염 완충 식염수에 1.5 mM magnesium chloride와 0.2 mM calcium chloride를 첨가하여 조제합니다. Tonation quench 용액은 PBS 2+에 100 mM glycine을 첨가하여 조제합니다. NT buffer는 150 mM sodium chloride, 1 mM EDTA, 0.2% BSA, 20 mM triss를 포함하며 pH 8.6으로 조제합니다. Ripa buffer는 pH 7.4의 10 mM triss, 150 mM sodium chloride, 1 mM EDTA, 0.1% SDS, 1% trite x 100, 0.1% sodium deoxy coate를 사용하여 조제합니다.

다음으로, SULF N-H-S-S-S biotin 스톡 용액을 SULFOXIDE 또는 DMSO에 녹여 200 mg/mL 농도로 준비합니다. 500 µL씩 소분하여 -20 °C에서 보관하십시오. 소분된 용액은 이후 여러 번의 동결-해동 사이클을 거쳐도 무방합니다.

50 mM tris에 용해하여 500 mM 농도로 TCEP(Two carboxy ethyl phosphine hydrochloride) 스톡 용액을 준비하고 pH를 7.4로 조정합니다. TCEP는 강산성이므로 용액의 pH를 7.4로 조정해야 하며, TCEP 용액을 커버와 호일로 감싼 후 -20 °C에서 보관하십시오. 둘째 날에는 0.18% glucose와 0.2% IgG protease-free bovine serum albumin이 첨가된 PBS two plus 또는 PBS two plus GBSA를 준비하여 워터 배스에서 37 °C로 예열하십시오.

SFO N-H-S-S-S biotin 스톡 용액을 상온에서 해동합니다. 사용 직전에 신선한 sulfur N-H-S-S-S biotin 용액을 준비합니다. DMSO를 용해시키기 위해 용액을 강하게 볼텍싱합니다.

두 플레이트를 냉실의 아이스 배스 위에 놓고, 플레이트를 약간 기울여 버퍼가 완전히 배출되도록 유지하면서 각 웰을 2 mL의 ice cold PBS 2+로 3회 세척합니다. 마지막 세척 후, 각 웰에 신선한 sulfo-NHS-SS-biotin 솔루션을 웰당 0.75 mL씩 분주합니다. 아이스 배스 위 4 °C에서 15분 동안 인큐베이션하며, 인큐베이션 종료 직전에 플랫폼 쉐이커를 사용하여 강하게 흔들어 줍니다.

새로운 SUHO N-H-S-S-S biotin 용액을 추가로 준비하고, 15분 후에 기존 용액을 새 용액으로 교체합니다. 2차 배양 후, 플랫폼 셰이커에서 강하게 흔들어주며 4°C에서 15분 더 배양하고, 2 mL의 켄칭 용액으로 세포를 빠르게 3회 세척하여 반응하지 않은 모든 NHS biotin 분자를 켄칭합니다. 그 다음, 2 mL의 켄칭 용액에서 15분 동안 배양합니다.

15분 후에 신선한 퀀칭 용액(quenching solution)으로 교체하고 15분 동안 추가로 배양합니다. 각 배양 단계 동안 플레이트를 4 °C에서 플랫폼 쉐이커를 이용해 부드럽게 흔들어주며 유지하고, 대조군 플레이트는 콜드룸 내 벤치탑의 퀀칭 용액에 그대로 둡니다. 이 시점에서 실험군 플레이트를 콜드룸의 아이스 배스에서 꺼냅니다.

약물 처리 테스트를 수행하는 경우, 예열된 PBS 2 + GBSA에 적절한 농도의 약물을 첨가합니다. 본 실험에서는 PKC 경로를 활성화하기 위해 에탄올 용매 또는 1 µM PMA(phorbol 12-myristate 13-acetate)를 사용합니다. 실험 플레이트의 각 웰을 예열된 PBS 2 + GBSA 2 mL로 3회 세척하고, 마지막 세척 후 적절한 약물 처리를 수행합니다.

해당하는 PBS 2 + GBSA 용액 2 mL를 첨가하고, 플레이트 전체의 온도를 균일하게 유지하기 위해 비어 있는 웰은 미리 데운 배지로 채웁니다. 배양 종료 직전에 세포를 37 °C 인큐베이터로 옮겨 10분 동안 둡니다. NT 버퍼 내의 50 mM TCEP 용액을 사용하여 신선한 스트리핑 용액을 준비하고 얼음 위에 보관합니다.

웰당 1 mL에 해당하는 충분한 양을 준비합니다. 10분간 배양한 후, 실험 플레이트를 빠르게 얼음 수조로 옮겨 냉장실로 다시 이동시킵니다. 내포 작용(endocytosis)을 중단시키기 위해 얼음처럼 차가운 NT buffer를 웰당 2 mL씩 사용하여 실험 웰을 세 번 신속하게 세척합니다.

그런 다음 stripping control well을 2 mL의 ice cold NT buffer로 3회 세척합니다. total control well은 quench solution에 그대로 둡니다. 각 experimental well과 strip control well에 1 mL의 stripping solution을 첨가하고 얼음 위에서 15분 동안 배양합니다.

배양 종료 전 4 °C에서 부드럽게 흔들어 줍니다. 다시 이전과 동일한 부피의 신선한 스트리핑 용액을 준비하십시오. 15분 후, 기존의 스트리핑 용액을 신선한 용액으로 교체하고, 세포를 먼저 용해시키기 위해 4 °C에서 부드럽게 흔들며 15분 동안 추가로 배양합니다.

스트리핑 용액에 노출된 모든 웰을 2 mL의 NT buffer로 3회 세척합니다. 그다음, 토털 컨트롤을 포함한 모든 웰을 2 mL의 차가운 pbs로 3회 세척합니다. 마지막 세척 후, 신선한 프로테아제 억제제가 포함된 RIPPA buffer 300 µL를 각 웰에 첨가하고 4 °C에서 20분 동안 흔들어 세포를 용해합니다.

용해물을 1.5 milliliter 마이크로 튜브로 옮기고, 4 °C에서 18,000 GS로 10분 동안 원심분리하여 세포 파편을 제거합니다. 용해 조건과 호환되는 단백질 분석법(예: Pierce사의 BCA protein assay)을 사용하여 표준 bovine serum albumin 곡선과 비교함으로써 용해물의 단백질 농도를 측정합니다. 그 후, strep 및 친화성 크로마토그래피를 위해 용해물을 준비합니다.

각 샘플에서 동일한 양의 단백질을 1.5 milliliter 마이크로 원심분리 튜브에 채웁니다. 본 실험에서는 50 microgram의 세포 용해물에서 비오틴화 단백질을 분리합니다. 각 샘플의 최종 부피가 200 microliters가 되도록 프로테아제 억제제가 포함된 RIPA 버퍼를 첨가합니다.

다음으로, 사용 전 strep avid 및 agro beads를 격렬하게 볼텍싱합니다. 팁 끝을 자른 200 µL 피펫을 사용하여 각 튜브에 stripped avid 및 beads 20 µL를 분주합니다. 튜브를 볼텍싱한 후, 튜브 로테이터를 사용하여 4 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 상온에서 18,000 ×g로 2분간 원심분리하여 beads를 수집합니다. 흡입기로 beads 펠렛에 닿지 않도록 주의하며 용해물을 제거한 후, 상온의 용액 0.75 mL를 추가합니다.

각 튜브에 Rip buffer를 넣고 최고 속도로 vortexing 하여 비드를 세척합니다. 18,000 GS에서 2분 동안 원심분리합니다. 상온에서 비드를 모으고, 이 세척-vortexing-원심분리 사이클을 두 번 더 반복하여 최종 세척까지 총 3회 세척합니다.

비드 펠렛이 흐트러지지 않게 주의하며 완충액을 최대한 흡입하여 제거합니다. 다음으로 각 튜브에 2x 환원 라멜리 완충액(reducing lamely buffer) 20 to 25 µL를 첨가합니다. 환원제는 N-H-S-S-S 비오틴 이황화 결합을 끊어 분리된 단백질을 용액 속으로 방출시킵니다.

대부분의 막 단백질은 가열 처리를 견딜 수 없으므로, 환원 및 변성 후 회전 혼합기(rotator)를 사용하여 상온에서 30분 동안 배양하여 단백질을 분리합니다. 표준 SDS-PAGE를 사용하여 단백질을 막으로 전이시킨 후 면역 블로팅을 수행하며, 적절한 항체로 반응시킵니다. 본 실험에서는 Checon 사의 rat anti-DAT 항체(제품 번호 360 9)를 1:2000으로 희석하여 사용하며, 포화된 픽셀이 없음을 확인하며 CCD 카메라 겔 문서화 시스템을 사용하여 면역 반응 밴드를 캡처합니다. 본 실험에서는 Bio-Rad VersaDoc 이미징 시스템과 Quantity One 소프트웨어를 사용하여 각 밴드의 밀도를 정량화합니다.

도파민 운반체에 대한 가역적 표지 절차의 대표적인 면역 블록 결과가 여기에 제시되어 있습니다. 가장 강한 신호는 총(total) 레인 또는 T에서 확인되는 내재화 전 표면 단백질의 총량입니다. 스트립 대조군(strip control) 또는 S는 이상적으로 공백에 가까워야 하며 높은 스트립 효율을 나타내야 합니다. 스트립 효율은 다음 공식에 밴드 밀도 측정값을 사용하여 계산합니다.

본 실험에서 이 스트립의 효율은 99.8%였습니다. 효율이 90% 이상인 스트립이 최적이며, 이 수준 미만의 결과는 폐기해야 합니다. 이 포어 스트립(pore strip)의 예시는 스트립 효율이 34%인 스트립 레인에 가시적인 밴드를 보여줍니다. 여기서 강도가 더 낮은 밴드들은 실험 플레이트에서 얻은 내재화 레인입니다. 세포를 vehicle 용액 또는 1 µM PMA로 10분 동안 내재화 처리한 후, 도파민 운반체 내재화 속도를 측정하였습니다.

내입화 속도는 밴드 밀도 측정값을 사용하여 다음과 같이 계산합니다. 이 그래프에서 볼 수 있듯이, vehicle 처리 조건에서는 10분 동안 표면 DAT의 10.4%가 내입화되었습니다. 하지만 PMA 처리는 DAT 내입화 속도를 전체 표면 DAT의 23.2%까지 증가시켰습니다. 지금까지 가역적 바이오티닐화 기술을 사용하여 세포막 단백질의 내입화 속도를 측정하는 방법을 살펴보았습니다.

바이오 토네이션(bio tonation) 시약과 TCP를 사용 직전에 신선하게 준비해야 한다는 두 가지 사항을 기억하는 것이 중요합니다. 프로토콜 진행 중 세포 손실이 많이 발생한다면, 플레이트에 세포 부착 기질을 사용하십시오. 이것으로 모든 과정을 마칩니다.

시청해 주셔서 감사합니다. 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.