라이트 현미경과 연구 Presynaptically 사일런트 시냅스
January 4th, 2010
Glutamatergic 시냅스는 자동 모드로 활성 모드에서 전환할 수 있습니다. 우리는 쥐 뉴런의 dissociated 문화에 presynaptic 활동 상태를 보여주는 것은 적극적인 시냅스를 시각화하는 FM1 - 43 염료의 고칠수 양식을 사용하여 모든 글루 탐 산염 시냅스를 시각화하는 vGluT - 1 항체와 immunostaining 시각이다.
중추 신경계의 일부 시냅스전 말단은 기능이 없거나 침묵하는 것처럼 보입니다. 여기에서는 조용한 시냅스전 말단을 식별하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 말단을 침묵시키거나 깨우는 것으로 의심되는 치료 및 조작을 식별하는 데 적용할 수 있습니다.
이 프로토콜은 신경 세포 탈분극 중 시냅스 소포의 필수 염료 라벨링과 고정 세포의 후속 라벨링을 침묵 및 활성 모두의 모든 시냅스 전 말단을 라벨링하는 항체와 결합합니다. 시냅스. 염료와 항체로 표지된 Co는 활성입니다. 항체에 의해서만 표지된 시냅스는 침묵합니다.
안녕하세요, 저는 워싱턴 대학교 의과대학 정신의학과 스티브 미닉 박사 연구실의 아만다 테일러입니다. 저도 Manic Lab의 Shahin입니다. 오늘 우리는 배양된 해마 뉴런을 사용하여 조용한 시냅스전 말단을 시각화하는 절차를 보여드리고자 합니다.
우리는 실험실에서 이 절차를 사용하여 전기 활동과 다른 단일 노링 경로가 신경 전달 물질 방출을 조절하는 방법을 연구합니다. 시작하겠습니다. 멸균 층류 후드에서 HIPA를 사용하면 해리 된 세포 배양을 준비하기 위해 출생 후 0 일부터 3 마리의 쥐 또는 마우스까지 구입할 수 없습니다.
발표된 프로토콜에 따르면, 당사의 배양액은 혼합 신경교세포입니다.동일한 해부 세포에서 파생된 배양액은 멸균된 35mm 접시에 도금해야 합니다. 각각에는 콜라겐 플레이트의 밀리리터당 5밀리그램으로 코팅된 숫자 0 커버 슬립이 포함되어 있습니다. 제곱센티미터당 500개의 세포의 대략적인 밀도에 있는 뉴런.
12마리의 새끼 쥐는 일반적으로 30개의 35mm 접시를 산출합니다. 배양물이 배양 인큐베이터에서 10-14일 동안 자랄 수 있도록 합니다. 시냅스 발달 및 성숙을 위해 항 유사 분열 a C를 추가하여 시험관 4 일차에 신경교 성장을 저지하십시오.
또한 시험관 5일차에 신경 기저 배지와 B 27 보충제를 반 배지 교환하여 이 성숙 기간 동안 신경 세포의 생존을 향상시킵니다. 시냅스 이전의 침묵 시냅스의 수를 변경하는 치료법을 소개합니다. 우리는 많은 비율의 글루타메이트 시냅스를 침묵시키는 한 가지 편리한 방법은 30밀리몰 칼륨으로 4시간 동안 치료하는 것임을 발견했습니다.
배양이 성숙하면 뉴런은 잘 분리되고 광범위한 신경증적 과정을 가진 상대적으로 낮은 밀도를 가져야 합니다. 인큐베이터에서 배양물을 제거하고 벤치로 가져옵니다. 배양 배지를 45 millimolar 염화칼륨 및 10 micromolar FM 1 43 FX die를 함유한 완충 식염수 용액으로 교체합니다.
이 솔루션에는 반복 신호를 방지하기 위해 NBQX 및 A PV도 포함되어야 합니다. FM 1 43 FX 스톡 용액 및 실험은 광표백을 방지하기 위해 어두운 곳에 보관하는 것이 중요합니다. 따라서 모든 후속 배양 단계를 위해 배양 접시를 호일로 덮으십시오.
실온에서 정확히 2분 동안 배양합니다. 염료 용액을 제거하고 500 마이크로몰 적대작용이 있는 완충 식염수를 3-5초 동안만 세척합니다. 7. 이 단계에서 비특이적 염료 타이밍을 제거하는 것이 중요합니다.
adv adverse F seven에 장기간 노출되면 FM 43 FX 레이블이 모두 제거됩니다. 그런 다음 세포를 세척하고 adv 부작용 없이 완충된 식염수를 쌓습니다. 화학 흄 후드에서 2분 간격으로 5회
7회.PBS에서 4%파라알데히드와 0.2%글루타르알데히드의 배양물을 10분 동안 수정합니다. PBS로 세포를 짧게 씻습니다. 이제 세포를 흄 후드 밖으로 이동할 수 있습니다.
4%의 정상 염소 혈청과 0.04%tritton X를 함유한 차단 용액을 첨가하여 면역 염색을 위한 세포의 배경과 침투를 줄입니다. 15분 동안 배양합니다. 차단 용액에서 1 대 2000으로 희석된 vlu T 1 항체로 세포를 염색합니다.
3시간 동안 부드럽게 흔들어 항체 배양물을 배양합니다. PBS로 세포를 네 번 씻습니다. Alexa로 세포를 배양합니다.
6 47 접합 항 기니피그 항체를 차단 용액에 1 대 500으로 희석했습니다. 30분 동안 부드럽게 흔들어 2차 항체의 배양균을 유지합니다. PBS로 세포를 4번 더 씻습니다.
집게를 사용하여 깨끗한 유리 슬라이드에 바닥 수량을 한 방울 떨어뜨립니다. 커버 슬립을 집어 슬라이드를 마주보고 있는 바닥 금액 셀의 드롭 위로 부드럽게 내립니다. 슬라이드를 밤새 말리십시오.
컨포칼 레이저 스캐닝 현미경에서 60 x 오일 대물렌즈를 준비합니다. 스테이지에 슬라이드를 놓아 커버 슬립이 목표물을 향하도록 합니다. 지나치게 조밀하지 않고 잔류 염료를 유지할 수 있는 소마에서 멀리 떨어져 있는 신경돌기 필드를 찾으십시오.
51 x 51미크론의 필드 크기로 확대/축소합니다. 이미지 획득 소프트웨어를 사용합니다. 각 단계에 대해 0.3미크론의 27개 단계에 걸쳐 7.8미크론의 깊이를 커버하는 ZS 스택을 획득합니다.
먼저 VLU T one 항체를 스캔하여 현장의 모든 글루타메이터성 시냅스를 식별합니다. 그런 다음 FM 1 43 FX 형광을 다시 스캔하여 획득 후 이미지를 분석합니다. 해석 소프트웨어를 사용하여 Z 택을 각 픽셀 세트 임계값에서 모든 평면에서 판독한 최대 강도를 기반으로 하는 복합 단일 평면 이미지로 변환합니다.
배경을 줄이려면 FM 1 43 효과 염색을 참조하지 않고 VG glu T one 단자를 식별하십시오. 그리고 이러한 반점을 관심 영역으로 표시합니다. 일반적으로 필드당 10개의 PUNTA를 선택합니다.
FM 1 43 효과 이미지에서 임계값 및 푼크 선택을 반복하고 이미지를 겹쳐서 조용한 시냅스를 식별합니다. 절대 픽셀 기준 또는 백분율 픽셀 기준을 사용하여 활성 FM 1 43 포지티브와 비활성 FM 1 43 마이너스 시냅스를 구별할 수 있습니다. 우리의 배양에서 V glut one staining에 의해 정의된 글루타메이트 시냅스의 70-80%가 녹색 FM 1 43 형광 및 빨간색 V glut one staining의 중첩된 이미지에서 검출 가능한 FM 1 43 염색을 나타냅니다.
이것은 공동 국소 마커가 있는 노란색 반점 시냅스가 풍부하기 때문에 분명합니다. 이것들은 화살표로 표시됩니다. 약 20-30%의 적색 V 과잉 1개의 양성 반점은 기준선보다 녹색, FM 1, 43, 형광을 갖지 못합니다.
이것들은 비활성 시냅스 전 말단이며 예는 화살촉으로 표시됩니다. 시냅스의 세 번째 집단도 관찰됩니다. 이들은 녹색 FM 1 43 형광에 대해 양성이지만 적색 B glut one 염색은 없습니다.
이것들은 활성 GABAergic 시냅스이며 예는 별표로 표시됩니다. 이는 대부분의 분석에서 제외되지만 소포형 GABA 수송체 항체를 사용하여 명시적으로 연구할 수 있습니다. VLU T one 항체 대신, FM 1 43 및 VLU one immuno staining을 사용하여 presynaptically silent synapse를 시각화하는 방법을 보여드렸습니다.
이 절차를 수행할 때 FM 1 43 FX는 adver sub seven 세척 시간과 차단 용액에 포함된 처리 X 100의 농도 모두에 민감하다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 그게 다야. 시청해 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.
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개요
이 연구는 중추 신경계에서 침묵하는 시냅스전 종말을 식별하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 활성 염료 표지와 면역염색을 결합하여 연구자들은 활성 시냅스와 침묵하는 시냅스를 구분할 수 있습니다.
주요 연구 구성요소
과학 분야
- 신경과학
- 세포 생물학
- 시냅스 기능
배경
- 일부 시냅스전 종말은 비활성 또는 침묵합니다.
- 시냅스 활동 이해는 신경과학 연구에 매우 중요합니다.
- 침묵하는 종말을 식별하면 다양한 치료법 연구에 도움이 될 수 있습니다.
- 시냅스 활동을 시각화하면 신경 세포 간 통신에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다.
연구 목적
- 침묵하는 시냅스전 종말을 식별하기 위한 신뢰할 수 있는 방법을 개발합니다.
- 치료가 시냅스 활동에 미치는 영향을 탐구합니다.
- 신경 네트워크에서 시냅스 역학에 대한 이해를 향상시킵니다.
사용된 방법
- 뉴런 탈분극 중 시냅스 소포의 활성 염료 표지.
- 모든 시냅스전 종말을 표지하는 항체를 사용한 면역염색.
- 활성 시냅스와 침묵하는 시냅스를 구분하기 위한 공동 표지 기술.
- FM1-43 염료를 사용하여 활성 시냅스를 시각화합니다.
주요 결과
- FM1-43 염료를 사용하여 활성 시냅스를 시각화할 수 있습니다.
- 면역염색은 침묵하는 것을 포함한 모든 시냅스전 종말을 보여줍니다.
- 이 프로토콜은 활성 시냅스와 침묵하는 시냅스를 효과적으로 구분합니다.
- 연구 결과는 시냅스 가소성과 기능 이해에 기여합니다.
결론
- 개발된 프로토콜은 신경과학 연구에 귀중한 도구입니다.
- 침묵하는 종말을 식별하면 치료 전략에 정보를 제공할 수 있습니다.
- 이 방법은 시냅스 행동 이해를 향상시킵니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Identifying presynaptically silent synapses enables mechanistic de-risking in target validation by revealing functional heterogeneity in neuronal networks. This method supports predictive confidence in screening assays by distinguishing active from inactive glutamate release sites. It informs portfolio triage by linking synaptic plasticity mechanisms to disease-relevant systems in preclinical models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by quantifying presynaptic silencing or activation states.
- Operational Value: Enables biological de-risking through direct visualization of vesicle release competence.
- Predictive Value: Supports target confidence by correlating cAMP signaling or electrical silencing with functional outcomes.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for compound evaluation using co-localization of FM1-43 FX and vGluT-1 signals.
- Quantitative Output: Enables standardized measurement of active synapse percentage via threshold-based image analysis.
- Reproducibility: Supports platform reuse through standardized fixation, staining, and imaging protocols.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Connects presynaptic plasticity to hippocampal-dependent learning and memory pathways.
- Translational Continuity: Bridges discovery through preclinical validation by monitoring synaptic adaptation to treatments.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by quantifying silent synapse populations under baseline and modulated conditions.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing a functional readout of presynaptic terminal activity prior to lead identification.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of treatments that alter presynaptic silencing via potassium depolarization or cAMP activation.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible quantification of glutamate release competence in dissociated hippocampal cultures.
- Analytics: Generates quantitative dependent variable measurements (e.g., % FM1-43+/vGluT-1+ puncta) enabling condition comparison.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by modeling synaptic adaptation relevant to neuropsychiatric disorder mechanisms.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for screening modulators of presynaptic function across neuronal models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through direct assessment of vesicle release probability.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via fixed-cell imaging and co-staining protocol.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity in synaptic drug effects.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization based on functional synaptic modulation data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neuronal culture, confocal microscopy, and fluorescence image analysis.
- Needs instrumentation including laser scanning microscope with 60x oil objective and Z-stack acquisition.
- Demands cross-team standardization of staining timing, dye concentration, and wash stringency.
- Involves adaptation considerations for non-hippocampal neuronal systems or alternative vesicle transporters.
- Includes practical limitations such as FM1-43 FX sensitivity to ascorbic acid wash duration and blocking solution composition.
