Name: 라이트 현미경과 연구 Presynaptically 사일런트 시냅스 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-01-04T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 2 s
Description: 학습하세요 중추신경계의 기능하지 않는 시냅스 전말단을 식별하는 방법을. 활성 및 비활성 시냅스를 구분하기 위해 활성 염료 표지와 면역염색을 결합한 이 프로토콜은 신경과학 연구에서 시냅스 가소성과 기능을 이해하는 데 중요한 도구입니다.

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이 작품은 워싱턴 대학에 NIH 보조금 DA018109과 MH78823, 그리고 NIH 신경 과학 청사진 코어 부여 P30NS057105에 의해 지원되었다.

문화 준비 <ol><li> 출생 후의 일 0-3 동물에게 1에서 쥐가 드나 마우스 hippocampal 세포의 세포 dissociated 문화를 준비합니다. 우리의 뉴런은에 숫자 0이 두께 coverslip에 보급 콜라겐 층을 준수 돌려 기본 astrocyte monolayer에 준수. cm2 당 약 500 세포의 밀도에 신경 플레이트. </li><li> 문화가 시냅스 개발과 성숙을 할 수 10~14일위한 성장을 허용합니다. 더 glial 성장을 체포하기 위해 antimitotic의 AraC과 함께 체외 4 일에있는 문화를 처리합니다. 의 연결을 생존을 향상시키기 위해 Neurobasal 중간 플러스 B27 보충과 반 중간 교환과 체외 5 일에서 그들을 먹여 살리지. </li><li> 문화 기간 동안 기능 침묵 시냅스의 숫자를 변경하기위한 트리 트먼트를 소개합니다. 우리는 글루 탐 산염 시냅스의 큰 비율 (~ 80 %) 침묵 한 편리한 방법 30 MM의 칼륨과 함께 4 시간 치료는 것을 발견했습니다. 약한 depolarizing 자극과 함께 더 이상 incubations 유사한 입을 2를 유발. 50 μm의 forskolin, adenylyl의 cyclases의 활성과 4 시간 자극은 기본 3 무성 터미널의 인구를 각성하는 데 사용할 수 있습니다. </li></ol> 자동 시냅스를 떠올리 <ol><li> 세포는 형광 현미경을 사용하여 개별 시냅스 터미널의 시각화를 촉진을 줄 수있는만큼 체외 10-14에서 하루 잘 분리 neuritic 프로세스와 상대적으로 낮은 밀도를 가지고해야합니다. </li><li> 증류수 5 MM FM1 -​​ 43FX의 주식 솔루션을 준비합니다. 주식은 4 어둠 속에서 유지되어야 ° C. FM1 -​​ 43FX를 사용하여 모든 실험도 어둠 속에서 수행되어야합니다. </li><li> 100 MM 나트륨 염화물, 2 MM의 염화칼슘, 1 MM 마그네슘 염화물, 10 MM 포도당 및 10 μm의 FM1 -​​ 43FX를 포함하는 HEPES - 버퍼 생리 식염수 45 MM 염화칼륨 2 분 동안 문화를 도전한다. 이 솔루션은 또한 postsynaptic 수용체를 차단하고 반복 신호를 방지하기 위해 1 μm의 NBQX 25 μm의 D - APV를 포함해야합니다. 이 과제는 exocytosis와 endocytosis 능력이 시냅스 터미널 레이블을 것입니다. 도전의 시간과 강도는 재활용 풀 4 사용 가능한 모든 vesicles의 exocytosis 중 적어도 한 라운드를 일으킬 수 있도록 설계되었습니다. 그러나, 문제는 단말기의 추가 입을를 일으킬 수있는 충분한되지 않습니다. </li><li> 염화칼륨없이 생리 HEPES - 버퍼지만, 500 μm의와 Advasep - 7 특이 현상이 염료, 5를 제거하는 똑같은를 사용하여, 오직 3-5초에 대한 문화를 씻으십시오. 이 단계의 타이밍이 모든 FM1 -​​ 43FX 라벨의 손실됩니다 Advasep - 7의 장기간 응용 프로그램으로 중요합니다. 에서 다음 세척 오 2 분 간격을위한 Advasep - 7 않고 생리 HEPES는 버퍼. </li><li> 10 분 4 % paraformaldehyde와 PBS, pH를 7.4에서 0.2 % 글루 타 알데히드와 세포를 수정. 일단 간단히 PBS로 세포를 씻어 후 PBS에 4% 정상 염소 혈청과 0.04 % 트리톤 X - 100을 포함 차단 솔루션에서 15 분 동안 품어. FM1 -​​ 43FX 또한 트리톤은 X - 100 여기 이상의 단계에서 사용의 양을 매우 민감합니다. 일반적으로, FM1 -​​ 43FX 라벨은 트리톤 Triton X - 100의 부재에서 최고이지만, 일부 세제는 다음 immunostaining에 대한 세포를 permeabilize 필요합니다. 우리는 0.04 % 트리톤 X - 100 presynaptically 침묵 시냅스의 시험에 최적입니다 경험적으로 결정했습니다. </li><li> 1:2500의 농도에 솔루션을 차단의 기본 vGluT - 1 항체를 희석. 상온에서 3 시간 동안 vGluT - 1 항체 희석의 부드러운 흔들림 / 회전 세포를 품어. FM1 -​​ 43FX 색소의 표백 방지하기 위해 호일와 문화 요리를 커버해야합니다. </li><li> 두 번 PBS로 세포를 세척 후 두 얼룩을 구분하는 FM1 -​​ 43FX 다른 스펙트럼 특성 형광단에 복합 방지 실험용 돼지 항체와 세포를 품어. 우리의 실험을 위해, 우리는 솔루션을 차단에 1:500에서 555 - 복합 백신 실험용 돼지 항체 알렉사을 사용합니다. 실온에서 30 분 동안 흔들림 보조 항체와 세포를 품어. </li><li> 세포에게 PBS에서 네번 번 이상 씻으 후 Fluoromount - G의 작은 방울을 사용하여 유리 슬라이드에 커버 슬립을 탑재합니다. 세포 슬라이드를 얼굴 있도록 방향 coverslip해야합니다. 슬라이드가 밤새 건조하도록 허용합니다. </li><li> 우리는 지금 활성 및 비활성 시냅스의 이미지를 얻기위한 준비가되어 있습니다. 공촛점 레이저 스캐닝 현미경에 1.4 조리개 수치와 60 X 오일 목표를 준비합니다. coverslip 측면이 목적에 직면 있도록, 무대에 슬라이드를 삽입합니다. 슬라이드를 집중하면, 지나치게 밀도되지 neurites의 필드를 찾으십시오. 잔여 FM1 -​​ 43FX의 염색도 광범위한 세척 후 남아 수 있으므로 이것은 또한, 셀 소마 근처 이미징을 방지하는 것이 좋습니다. 우리의 실험 이미지의 경우, 우리는 일반적으로 51 51 미크론의 필드 크기에 확대. </li><li> 수집27 0.3 - 마이크론 단계로 7.8 미크론의 깊이에 걸쳐 해당 분야의 Z - 스택. 이 범위는 우리 문화의 neurites의 두께를 충당하기 위해 충분하다. Z - 스택의 각 단계에, 현미경 분야의 모든 glutamatergic 시냅스를 식별하는 vGluT - 1 항체의 immunofluorescence 자극 레이저 빛을 처음에 스캔. 동일한 필드가 FM1 -​​ 43FX의 형광 각 단계에서 다시 스캔합니다. 신호의 채도를 피할 수 있지만, 주어진 실험에 대한 모든 coverslips 중에서 지속적으로 중립적인 밀도 필터링 및 photomultiplier 향상을 설정합니다. 우리는 일반적으로 각 실험 조건마다 ≥ 5 필드를 취득. </li><li> 분석 소프트웨어를 사용하여 복합 단일 평면 이미지로 Z - 스택을 변환합니다. 우리가이 변환에 사용 과정은 각 픽셀에 어떤 비행기에서 최대 강도에 따라 이미지를 생성합니다. 합성 이미지 thresholded하고 vGluT - 1 터미널은 FM1 -​​ 43FX 참조 얼룩없이 분석 식별됩니다. puncta로 불리는 스테인드 영역, 흥미 영역으로 표시됩니다. 우리는 일반적으로 현장 지당 10 puncta을 선택합니다. 다음 FM1 -​​ 43FX 채널이 thresholded하고 관심의 영역은 겹쳐 있습니다. 분석 소프트웨어는 각 신호의 형광 강도뿐만 아니라 각 punctum의 영역을 계량하는 데 사용됩니다. 절대 픽셀 기준 또는 퍼센트 픽셀 기준 비활성 시냅스에서 활성화 구별하는 데 사용할 수 있습니다. </li></ol> 대표 결과 <ol><li> 우리 문화, 우리는 vGluT - 1 염색법에 의해 정의된 글루 탐 산염 시냅스의 70~80%은, 감지 FM1 - 43 얼룩이, 6-8을 전시 것을 발견했습니다. 의 중첩 이미지 녹색 FM1 -​​ 43 형광 붉은 vGluT - 1이이 노란색 puncta 풍부한으로 반영되어 얼룩 : 공동화된 마커와 시냅스. 이들은 화살표로 표시됩니다. </li><li> (적색) vGluT - 1 양성 puncta의 약 20-30%은 기본 위 (녹색) FM1 -​​ 43 형광을 가지고 실패합니다. 이들은 비활성 presynaptic 터미널이며, 예제는 화살촉으로 표시됩니다. </li><li> 시냅스의 3 분의 1 인구도 관찰됩니다. 이들에 대한 (녹색) FM1 -​​ 43 형광하지만 (적색) vGluT - 1 얼룩는 없음. 양수 이들은 활성 GABAergic 시냅스이며, 예제는 별표로 표시됩니다. 이들은 우리의 분석의 대부분에서 제외되지만 명시적으로 vGluT - 1 항체의 자리에 기공을 갖는 GABA의 전송 항체를 사용하여 공부하실 수 있습니다. </li></ol>

<ol><li>Mennerick, S., Que, J., Benz, A., Zorumski, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passive+and+synaptic+properties+of+hippocampal+neurons+grown+in+microcultures+and+in+mass+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Passive and synaptic properties of hippocampal neurons grown in microcultures and in mass cultures.</a> J. Neurophysiol. 73, 320-332 (1995).</li>
<li>Moulder, K. L., Jiang, X., Taylor, A. A., Olney, J. W., Mennerick, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+activity+depresses+synaptic+function+through+an+effect+on+vesicle+priming%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Physiological activity depresses synaptic function through an effect on vesicle priming.</a> J. Neurosci. 26, 6618-6626 (2006).</li>
<li>Moulder, K. L., Jiang, X., Chang, C., Taylor, A. A., Benz, A. M., Conti, A. C., Muglia, L. J., Mennerick, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+specific+role+for+Ca2%2B-dependent+adenylyl+cyclases+in+recovery+from+adaptive+presynaptic+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A specific role for Ca2+-dependent adenylyl cyclases in recovery from adaptive presynaptic silencing.</a> J. Neurosci. 28, 5159-5168 (2008).</li>
<li>Sara, Y., Mozhayeva, M. G., Liu, X., Kavalali, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+vesicle+recycling+supports+neurotransmission+during+sustained+stimulation+at+hippocampal+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Fast vesicle recycling supports neurotransmission during sustained stimulation at hippocampal synapses.</a> J. Neurosci. 22, 1608-1617 (2002).</li>
<li>Kay, A. R., Alfonso, A., Alford, S., Cline, H. T., Holgado, A. M., Sakmann, B., Snitsarev, V. A., Stricker, T. P., Takahashi, M., Wu, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+synaptic+activity+in+intact+brain+and+slices+with+FM1-43+in+C.+elegans%2C+lamprey%2C+and+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging synaptic activity in intact brain and slices with FM1-43 in C. elegans, lamprey, and rat.</a> Neuron. 24, 809-817 (1999).</li>
<li>Rosenmund, C., Sigler, A., Augustin, I., Reim, K., Brose, N., Rhee, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+control+of+vesicle+priming+and+short-term+plasticity+by+Munc13+isoforms%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Differential control of vesicle priming and short-term plasticity by Munc13 isoforms.</a> Neuron. 33, 411-424 (2002).</li>
<li>Altrock, W. D., tom Dieck, S., Sokolov, M., Meyer, A. C., Sigler, A., Brakebusch, C., Fassler, R., Richter, K., Boeckers, T. M., Potschka, H., Brandt, C., Loscher, W., Grimberg, D., Dresbach, T., Hempelmann, A., Hassan, H., Balschun, D., Frey, J. U., Brandstatter, J. H., Garner, C. C., Rosenmund, C., Gundelfinger, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+inactivation+of+a+fraction+of+excitatory+synapses+in+mice+deficient+for+the+active+zone+protein+bassoon%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Functional inactivation of a fraction of excitatory synapses in mice deficient for the active zone protein bassoon.</a> Neuron. 37, 787-800 (2003).</li>
<li>Ting, J. T., Kelley, B. G., Lambert, T. J., Cook, D. G., Sullivan, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+precursor+protein+overexpression+depresses+excitatory+transmission+through+both+presynaptic+and+postsynaptic+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Amyloid precursor protein overexpression depresses excitatory transmission through both presynaptic and postsynaptic mechanisms.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 353-348 (2007).</li>
</ol>

의미 <ol><li> 일반적으로 시냅스는 측정 확률과 송신기를 출시하여 작동하는 생각되고 있습니다. 자신과 다른 사람이 작업은 기공을 갖는 신경 전달 물질의 수송과 다른 주요 presynaptic 마커 2, 6-8의 전체 보완에도 불구하고, 일부 시냅스가 신경 전달 물질을 방출하는 내화물하는 그것이 분명합니다. 우리는 뉴런의 기초 네트워크 활동이 비활성 시냅스의 인구를 유지하는 것이 중요합니다 그 이전에 보여주었다. </li></ol> 중요 단계 <ol><li> 500 μm의 Advasep - 7과 함께 간단한 세척을 포함 상당히 FM1 -​​ 43FX 얼룩의 품질을 향상시킵니다. 그러나, 오초 이상이 세척의 타이밍도 약간 증가 FM1 -​​ 43FX 라벨의 손실을 초래합니다. </li><li> FM1 -​​ 43FX는 Triton X - 100 프로토콜의 immunostaining 부분에 사용되는 양을 매우 민감합니다. FM1 -​​ 43FX 상표는 트리톤...

<table><tbody><tr><td>FM1-43FX</td><td>Invitrogen</td><td>F-35355</td><td>적색 편이된 FM4-64FX도 사용 가능하지만, 시냅스 전 억제 분석에는 적합하지 않은 것으로 밝혀졌다.</td></tr><tr><td>Advasep-7</td><td>CyDex</td><td>AR-0A7-001</td><td></td></tr><tr><td>vGluT-1</td><td>EMD Millipore</td><td>AB5905</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 647-결합 anti-GP</td><td>Invitrogen</td><td>A-21450</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr></tbody></table>

라이트 현미경과 연구 presynaptically 사일런트 시냅스

Presynaptically Silent Synapses Studied with Light Microscopy

시냅스 소성 가능성 underlies 학습과 기억 또한 neurotoxic되는 것을 달리 손상 모욕을 방지 적응력을 나타내는 5 신경계의 능력. 그것이 신경 전달 물질의 글루 탐 산염을 포함한 vesicles 발표 presynaptic 터미널의 능력의 디지털 전환 및 해제로 표현되기 때문에 우리는 부분적으로 흥미로운 presynaptic 소성의 형태를 공부하고 있습니다. 여기서 우리는 설치류의 해마에서 준비 dissociated 셀 문화에 presynaptic 터미널의 활동 상태를 시각화를위한 프로토콜을 보여줍니다. 이 메서드는 일반적으로 시냅스 vesicles 레이블을하는 데 사용되는 styryl 염료의 고칠수 형태 FM1 -​​ 43와 얼룩을 사용하여 활성 시냅스를 감지에 의존합니다. 이 얼룩 프로필은 기공을 갖는 글루 탐 산염 수송 1 (vGluT - 1)에 관계없이 정품 인증 상태의 라벨 모두 글루 탐 산염 시냅스를위한 얼룩에 대한 감독 항체와 같은 단말기의 immunostaining와 비교됩니다. 우리는 depolarizing 자극이 presynaptic 입을를 유도 것을 발견했습니다. 기준 조건 하에서 침묵 시냅스의 인구는 장시간 전기 입을 또는 CAMP 신호 통로의 활성화에 의해 활성화할 수 있습니다.

Glutamatergic 시냅스는 자동 모드로 활성 모드에서 전환할 수 있습니다. 우리는 쥐 뉴런의 dissociated 문화에 presynaptic 활동 상태를 보여주는 것은 적극적인 시냅스를 시각화하는 FM1 -​​ 43 염료의 고칠수 양식을 사용하여 모든 글루 탐 산염 시냅스를 시각화하는 vGluT - 1 항체와 immunostaining 시각이다.

라이트 현미경과 연구 Presynaptically 사일런트 시냅스

시냅스 가소성은 신경계의 학습 및 기억 능력의 근간이 될 가능성이 높으며, 또한 그렇지 않은 경우 발생할 수 있는...을 방지하는 적응력을 나타낼 수 있습니다.

중추 신경계의 일부 시냅스 전 말단은 기능이 없거나 침묵 상태인 것으로 보입니다. 본 연구에서는 침묵 상태의 시냅스 전 말단을 식별하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 말단을 침묵시키거나 깨우는 것으로 의심되는 처리 및 조작을 식별하는 데 적용될 수 있습니다.이 프로토콜은 뉴런 탈분극 과정 중 시냅스 소포의 생체 염색과, 이후 고정된 세포를 대상으로 활성 및 비활성 상태의 모든 시냅스 전 말단을 염색하는 항체 라벨링을 결합한 방법입니다. 염료와 항체가 모두 라벨링된 시냅스는 활성 상태입니다. 항체로만 라벨링된 시냅스는 비활성(silent) 상태입니다.안녕하세요, 저는 워싱턴 대학교 의과대학 정신의학과의 Steve Minick 박사 연구실 소속 Amanda Taylor입니다. 저는 Manic Lab의 Shahin입니다. 오늘은 배양된 해마 뉴런을 이용하여 침묵성 시냅스 전 단자를 시각화하는 절차를 보여드리고자 합니다.저희 실험실에서는 전기적 활성과 기타 단일 신호 경로가 신경전달물질 방출을 어떻게 조절하는지 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다. 그럼 시작하겠습니다. 멸균 라미나 플로우 후드 내에서, 생후 0~3일 된 쥐(rats 또는 mice)로부터 HIPA can't buy를 사용하여 해리된 세포 배양물을 준비하십시오.발표된 프로토콜에 따라, 동일한 해부 세포에서 유래한 혼합 글리아 배양물을 멸균된 35 millimeter 디쉬에 분주합니다. 각 디쉬에는 5 mg/mL의 콜라겐으로 코팅된 0번 커버슬립이 포함되어 있습니다. 뉴런을 약 500 cells/cm²의 밀도로 분주합니다.일반적으로 12마리의 쥐 새끼로 30~35mm 디쉬를 만들 수 있습니다. 배양물을 배양 인큐베이터에서 10~14일 동안 성장시키십시오. 시냅스 발달과 성숙을 위해, in vitro 4일 차에 글리아 세포의 성장을 억제하는 항분열제인 ara-C를 첨가하십시오.또한 배양 5일 차에, 이 성숙 기간 동안 신경세포의 생존율을 높이기 위해 B 27 보충제가 첨가된 neuro basal medium으로 배지의 절반을 교체합니다. 시냅스 전 무동작 시냅스(presynaptically silent synapses)의 수를 변화시키는 처리를 도입합니다. 글루타메이트 시냅스의 상당 부분을 무동작 상태로 만드는 편리한 방법의 하나로 30 millimolar potassium을 이용한 4시간 처리가 유용함을 확인하였습니다.배양이 성숙되면 뉴런은 서로 잘 분리된 광범위한 신경 돌기를 가지며 상대적으로 낮은 밀도를 나타내어야 합니다. 배양물을 인큐베이터에서 꺼내 벤치로 옮깁니다. 배양액을 45 millimolar potassium chloride와 10 micromolar FM 1 43 FX dye가 포함된 완충 식염수로 교체합니다.이 용액에는 재귀적 신호 전달을 방지하기 위해 NBQX와 APV가 포함되어야 합니다. 광퇴색을 방지하기 위해 FM 1 43 FX 스톡 용액과 실험 과정은 암실 상태를 유지하는 것이 중요합니다. 따라서 이후의 모든 배양 단계에서 배양 접시를 알루미늄 호일로 덮어주십시오.실온에서 정확히 2분 동안 배양하십시오. 염색액을 제거하고, 비특이적 염색을 제거하기 위해 500 $\mu$M AZIDE가 포함된 HEPES buffered saline으로 3~5초 동안만 세척하십시오. 이 단계에서의 시간 조절이 매우 중요합니다.adverse F seven에 장기간 노출되면 모든 FM 43 FX 표지가 제거됩니다. 그런 다음 화학 흄 후드 내에서 adverse seven이 포함되지 않은 인산완충식염수로 세포를 2분 간격으로 5회 세척하십시오.PBS에 4% paraformaldehyde와 0.2% glutaraldehyde를 혼합한 용액으로 10분 동안 배양물을 고정합니다. PBS로 세포를 짧게 세척합니다. 이제 세포를 흄후드 밖으로 옮길 수 있습니다.배경 신호를 줄이고 면역 염색을 위해 세포를 투과시키고자 4% normal goat serum과 0.04% tritton X가 포함된 블로킹 용액을 첨가합니다. 15분 동안 배양합니다. 블로킹 용액으로 1:2000으로 희석한 vlu T one 항체로 세포를 염색합니다.항체가 포함된 배양액에서 부드럽게 흔들어주며 3시간 동안 배양합니다. PBS로 세포를 4회 세척합니다. Alexa와 함께 세포를 배양합니다.블로킹 용액에 1:500으로 희석한 6 47 접합 항 Guinea pig 항체를 준비합니다. 2차 항체가 들어있는 배양물을 가볍게 흔들어주며 30분 동안 유지합니다. PBS로 세포를 4회 더 세척합니다.포셉을 사용하여 깨끗한 유리 슬라이드 위에 소량의 도말액을 한 방울 떨어뜨립니다. 커버 슬립을 집어 도말액 방울 위에 세포가 슬라이드를 향하도록 조심스럽게 덮습니다. 슬라이드를 하룻밤 동안 건조시킵니다.공초점 레이저 주사 현미경에 60x 오일 렌즈를 준비합니다. 커버 슬립이 대물렌즈를 향하도록 슬라이드를 스테이지 위에 놓습니다. 잔류 염료가 남아 있을 수 있는 세포체(soma)에서 떨어져 있으며, 밀도가 너무 높지 않은 신경돌기(neurite) 영역을 찾습니다.시야 크기를 51 by 51 microns로 확대합니다. 이미지 획득 소프트웨어를 사용하여, 단계당 0.3 microns씩 27단계로 총 7.8 microns의 깊이를 커버하는 ZS 스택을 획득합니다.먼저 VLU T one 항체를 스캔하여 시야 내의 모든 글루타메이트성 시냅스를 식별합니다. 그다음 FM 1 43 FX 형광을 재스캔하여 획득 후 이미지를 분석합니다. 분석 소프트웨어를 사용하여 각 픽셀의 임계값을 설정한 후, 모든 평면에서의 최대 강도 읽기 값을 기반으로 Z 스택을 합성 단일 평면 이미지로 변환합니다.배경 신호를 줄이기 위해, FM 1 43 염색 효과를 참조하지 않고 VG glu T one 말단을 확인합니다. 그리고 이러한 puncta를 관심 영역으로 표시합니다. 일반적으로 시야당 10개의 PUNTA를 선택합니다.FM 1 43 효과 이미지에 대해 임계값 설정과 펀크타 선택 과정을 반복하고, 이미지들을 중첩하여 침묵 시냅스(silent synapses)를 식별합니다. 활성 상태의 FM 1 43 양성 시냅스와 비활성 상태의 FM 1 43 음성 시냅스를 구분하기 위해 절대 픽셀 기준 또는 백분율 픽셀 기준을 사용할 수 있습니다. 본 연구의 배양 세포에서는 초록색 FM 1 43 형광과 빨간색 V glut one 염색의 중첩 이미지에서, V glut one 염색으로 정의된 글루타메이트 시냅스의 70~80%가 검출 가능한 FM 1 43 염색을 나타내는 것을 확인하였습니다.이는 공동 국소화된 마커와 시냅스를 형성하는 수많은 노란색 점으로 분명하게 나타납니다. 이들은 화살표로 표시되어 있습니다. 적색 Vglut1 양성 점의 약 20에서 30%는 기저선 이상의 녹색 FM 1-43 형광을 나타내지 않을 것입니다.이들은 비활성 시냅스 전 말단이며, 화살표 머리로 표시된 것이 그 예시입니다. 세 번째 시냅스 집단 또한 관찰될 것입니다. 이들은 녹색 FM 1 43 형광에는 양성이지만, 적색 B glut one 염색은 나타나지 않습니다.이들은 활성 GABA 작동성 시냅스이며, 별표로 표시된 것이 그 예시입니다. 이들은 대부분의 분석에서 제외되지만, 소포성 GABA 운반체 항체를 사용하여 명시적으로 연구할 수 있습니다. VLU T one 항체 대신, FM 1 43 및 VLU one 면역 염색을 사용하여 시냅스 전 침묵 시냅스를 시각화하는 방법을 방금 보여드렸습니다.이 절차를 수행할 때, FM 1 43 FX가 adver sub seven 세척 시간과 블로킹 용액에 포함된 처리 X 100 농도 모두에 민감하다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이것으로 모든 설명을 마칩니다. 시청해 주셔서 감사합니다. 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 프로토콜은 dissociated의 연결을 문화와 immunocytochemistry를 사용하여 뇌 부분에서 모두 버렸네 번호를 계량하는 방법 세부 사항. 구획 특정 항체를 사용하여, 우리는 presynaptic 터미널뿐만 아니라 postsynaptic 전문 사이트를 라벨. 우리는이 표시에 의해 생성되는 신호 사이에 colocalization 지점으로 시냅스를 정의합니다.

Quantifying 시냅스 : 시냅스 번호를 수치 Immunocytochemistry 기반 어세이

이 보고서는 첨부 presynaptic 부튼스을 유지 가능한 개별 뉴런의 기계적 분리를위한 기술을 보여줍니다. Vibrodissociated 뉴런은 빠른 생산, 뛰어난 약리 제어 및 인접 세포의 영향없이 향상된 공간 클램프의 장점이 있습니다. 이 방법은 시냅스 요소 및 패치 - 클램프 녹화 영상에 사용될 수 있습니다.

쥐 뇌 조각에서 뉴런의 Vibrodissociation는 시냅틱 전송 및 이미지 Presynaptic 터미널 공부

이 비디오는 어둡게 적응된 마우스 망막 조직 절편 제제에서 빛을 유발하는 시냅스 후 반응을 기록하는 것을 보여줍니다. 망막 절편은 기록 챔버에 배치되고, 기록 피펫은 망막 신경절 세포와의 전기적 연속성을 확립하는 데 사용됩니다. 광 펄스(light pulses)는 신경절 세포(ganglion cell)에서 흥분성 시냅스후 전위(excitatory post-synaptic potentials)를 생성하기 위해 적용되며, 이는 피펫에 의해 기록됩니다.

마우스 망막 절편의 뉴런에서 빛을 유발한 시냅스후 반응(Light-Evoked Postsynaptic Responses in Neurons of Mouse Retinal Slices)

우리는 기능적 신경 말단에서 화상 시냅스 소포 재활용 스티 릴 FM 염료의 사용을 설명한다. 이 프로토콜은 없습니다 만 유발하는 것이 아니라 또한 자연과 소형 시냅스 활동에 적용 할 수 있습니다. 프로토콜은 효과적으로 평가할 수 시냅스 이벤트의 다양한 확장한다.

유발, 자발적, 미니어처 시냅틱 활동을하는 동안 FM 염료를 사용하여 시냅틱 소포 재활용의 시험

우리는 쥐의 눈에서 망막 절편을 준비하고 망막 뉴런의 빛 반응을 기록하는 방법을 보여줄 것입니다. 전체 절차는 어두운 환경에서 수행됩니다.

녹화 패치 클램프 기술을 사용하여 어두운 적응 마우스 망막 슬라이스 준비에 신경 세포의 시냅스 응답 빛-유발

이 비디오는 Thy1-GFP 형질전환 라인에서 생체 내 2광자 현미경을 사용하여 마우스 후비장 피질의 뉴런을 만성적으로 이미징할 수 있는 개두술 절차를 보여줍니다. 이 접근법은 mCherry 발현 아데노 관련 바이러스를 배측 해마에 주입하는 것과 결합됩니다. 이러한 기술을 통해 RSC에서 경험 의존적 구조적 가소성을 장기간 모니터링할 수 있습니다.

동시에 두 광자<em&gt; 생체</em&gt; 마우스 Retrosplenial 코어 텍스에서 시냅틱 입력의 이미징 및 시냅스 대상

여기에 우리가 수와 초파리의 광 수용체의 시냅스 활성 영역의 공간적 분포를 정량화하는 방법을 보여, 유전자 인코딩 된 분자 마커 강조하고, 빛에 장시간 노출 후 자신의 변조.

의 시냅틱 변조 분석<em&gt; 노랑 초파리</em&gt; 장시간 빛에 노출 후 광수

이 프로토콜은 1 차적인 신경 배양에서 단백질 공동 국소화를 공부하기 위하여 초해상도 현미경 검사를 채택하는 방법을 보여줍니다.

1차 뉴런에서 단백질과 시냅스 마커의 공동 국소화를 연구하는 초해상도 이미징

시냅스 전달에 필요한 세포하 이벤트를 시각화하기 위해 두 가지 관련 방법이 설명된다. 이들 프로토콜은 시험관내 배양된 뉴런의 라이브 세포 이미징을 사용하여 시냅스 전 칼슘 유입 및 시냅스 소포막 융합의 역학의 실시간 모니터링을 가능하게 한다.

근위축성 측삭 경화증 모델에서 시냅스 기능의 실시간 형광 측정

DetectSyn은 치료 또는 질병 상태에 걸친 상대적 시냅스 (시냅스 전 및 시냅스 후 참여) 수의 변화를 측정하는 편향되지 않은 신속한 형광 분석법입니다. 이 기술은 배양된 뉴런 및 고정 조직 모두에서 사용될 수 있는 근접 라이게이션 기술을 이용한다.

DetectSyn: Synapse 밀도의 변화를 감지하는 빠르고 편향되지 않은 형광 방법

제시된 프로토콜은 주로 시냅스 수와 수지상 척추 형태에 초점을 맞춰 마우스 배럴 피질의 일주기 변화를 정량화하기 위해 투과 전자 현미경(TEM)의 사용을 설명합니다.

마우스 배럴 피질의 일주기 시냅스 가소성 분석을 위한 시각화 기술로서의 투과 전자 현미경

학습하세요 중추신경계의 기능하지 않는 시냅스 전말단을 식별하는 방법을. 활성 및 비활성 시냅스를 구분하기 위해 활성 염료 표지와 면역염색을 결합한 이 프로토콜은 신경과학 연구에서 시냅스 가소성과 기능을 이해하는 데 중요한 도구입니다.

라이트 현미경과 연구 Presynaptically 사일런트 시냅스

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