라이트 현미경과 연구 Presynaptically 사일런트 시냅스

중추신경계의 일부 시냅스 전 단말은 기능이 없거나 정지된 상태(silent)인 것으로 보입니다. 본 논문에서는 이러한 정지된 시냅스 전 단말을 식별하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 단말을 정지시키거나 다시 활성화시키는 것으로 추정되는 처리 및 조작법을 식별하는 데 적용될 수 있습니다.

본 프로토콜은 뉴런 탈분극 동안의 시냅스 소포 활성 염색과, 이후 고정된 세포에서 활성 및 불활성 시냅스 전 말단을 모두 염색하는 항체 표지를 결합한 방법입니다. 염료와 항체가 모두 표지된 시냅스는 활성 상태이며, 항체만으로 표지된 시냅스는 불활성 상태입니다.

안녕하세요, 저는 워싱턴 대학교 의과대학 정신과 스티브 미닉(Steve Minick) 박사 연구실의 아만다 테일러(Amanda Taylor)입니다. 저는 매닉(Manic) 연구실의 샤힌(Shahin)입니다. 오늘은 배양된 해마 뉴런을 사용하여 침묵성 시냅스 전 말단을 시각화하는 절차를 보여드리고자 합니다.

본 실험실에서는 전기적 활성 및 기타 단일 신호 경로가 신경전달물질 방출을 어떻게 조절하는지 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다. 이제 시작해 보겠습니다. 멸균 라미나 플로우 후드 내에서, 생후 0~3일 된 쥐(rat) 또는 생쥐(mouse)로부터 HIPA를 사용하여 해리된 세포 배양물을 준비합니다.

공개된 프로토콜에 따라, 동일한 박리 세포에서 유래한 혼합 glia 배양물을 멸균된 35 mm 디시에 분주합니다. 각 디시에는 5 mg/mL의 collagen으로 코팅된 0번 커버슬립이 포함되어 있습니다. 뉴런을 약 500 cells/cm²의 밀도로 도말합니다.

보통 쥐 새끼 12마리로 30~35mm 디쉬 30개를 얻을 수 있습니다. 배양물을 배양 인큐베이터에서 10~14일 동안 성장시킵니다. 시냅스 발달 및 성숙을 위해, 배양 4일 차(day in vitro four)에 항분열제인 ara-C를 첨가하여 글리아 세포의 성장을 억제합니다.

또한 배양 5일 차에, 이 성숙 기간 동안 신경세포의 생존을 높이기 위해 neuro basal medium과 B 27 보충제가 포함된 배지로 배지의 절반을 교체합니다. 시냅스 전 비활성 시냅스(presynaptically silent synapses)의 수를 변화시키는 처리를 도입합니다. 글루타메이트 시냅스의 상당 부분을 비활성화하는 편리한 방법 중 하나는 30 mM 칼륨으로 4시간 동안 처리하는 것임을 확인하였습니다.

배양이 성숙되면, 뉴런은 서로 잘 분리된 광범위한 신경突起와 함께 상대적으로 낮은 밀도를 가져야 합니다. 배양물을 인큐베이터에서 꺼내 벤치로 옮깁니다. 배양액을 45 millimolar KCl과 10 micromolar FM 1 43 FX 염료가 포함된 완충 식염수로 교체합니다.

이 용액에는 재발성 신호 전달을 방지하기 위해 NBQX와 APV가 포함되어야 합니다. 광퇴색을 방지하기 위해 FM 1 43 FX 스톡 솔루션과 실험 과정은 반드시 암실 상태로 유지해야 합니다. 따라서 이후의 모든 배양 단계에서 배양 접시를 알루미늄 호일로 덮어주십시오.

실온에서 정확히 2분 동안 배양합니다. 염색액을 제거하고, 비특이적 염색을 제거하기 위해 500 µM Azide가 포함된 HEPES 완충 식염수로 3~5초 동안만 세척합니다. 이 단계에서 세척 시간을 정확히 지키는 것이 매우 중요합니다.

Adverse F seven에 장시간 노출되면 모든 FM 43 FX 라벨링이 제거됩니다. 그다음 화학 흄 후드 내에서 adverse seven이 없는 인산완충생리식염수로 세포를 2분 간격으로 5회 세척하십시오.

4% 파라알데히드와 0.2% 글루타알데히드가 포함된 PBS에서 10분 동안 배양물을 고정합니다. PBS로 세포를 짧게 세척합니다. 이제 세포를 흄 후드 밖으로 옮길 수 있습니다.

배경 신호를 감소시키고 면역 염색을 위해 세포의 투과성을 높이기 위해 4% 일반 염소 혈청과 0.04% Triton X가 포함된 블로킹 용액을 첨가합니다. 15분 동안 배양합니다. 블로킹 용액에 1:2000 비율로 희석한 vlu T one 항체로 세포를 염색합니다.

항체가 포함된 배양액에서 완만한 쉐이킹(rocking)과 함께 3시간 동안 배양합니다. PBS로 세포를 4회 세척합니다. Alexa와 함께 세포를 배양합니다.

블로킹 용액으로 1:500까지 희석한 6 47 접합 anti Guinea pig 항체를 사용합니다. 2차 항체가 포함된 상태에서 배양물을 부드럽게 흔들어 30분 동안 유지합니다. PBS로 세포를 4회 더 세척합니다.

포셉을 사용하여 깨끗한 유리 슬라이드 위에 소량의 바닥 침전물을 한 방울 떨어뜨립니다. 커버슬립을 집어 바닥 침전물 방울 위에 세포가 슬라이드를 향하도록 조심스럽게 덮습니다. 슬라이드를 하룻밤 동안 건조시킵니다.

공초점 레이저 주사 현미경에 60배 오일 렌즈를 준비합니다. 커버글라스가 대물렌즈를 향하도록 슬라이드를 스테이지 위에 놓습니다. 잔류 염료가 남아 있을 수 있는 세포체에서 떨어져 있으며, 밀도가 너무 높지 않은 신경돌기 영역을 찾습니다.

시야 크기를 51 by 51 microns로 확대합니다. 이미지 획득 소프트웨어를 사용하여, 단계당 0.3 microns씩 27단계에 걸쳐 총 7.8 microns의 깊이를 포함하는 ZS 스택을 획득합니다.

먼저 VLU T one 항체를 스캔하여 시야 내의 모든 글루타메이트성 시냅스를 식별합니다. 그런 다음 FM 1 43 FX 형광을 재스캔하여 획득 후 이미지를 분석합니다. 분석 소프트웨어를 사용하여 각 픽셀 설정 임계값의 모든 평면에서 측정된 최대 강도 값을 기준으로 Z-stack을 합성된 단일 평면 이미지로 변환합니다.

배경 노이즈를 줄이기 위해, FM 1 43 효과 염색 결과와 상관없이 VG glu T one 터미널을 식별합니다. 그리고 이러한 점상 구조(puncta)를 관심 영역(ROI)으로 표시합니다. 일반적으로 시야당 10개의 puncta를 선택합니다.

FM 1 43 효과 이미지에 대해 임계값 설정과 펀크타(puncta) 선택 과정을 반복하고, 이미지들을 중첩하여 침묵 시냅스(silent synapses)를 식별합니다. 활성 FM 1 43 양성 시냅스와 비활성 FM 1 43 음성 시냅스를 구분하기 위해 절대 픽셀 기준 또는 백분율 픽셀 기준을 사용할 수 있습니다. 본 연구의 배양 세포에서는 녹색 FM 1 43 형광과 적색 V glut one 염색이 중첩된 이미지에서, V glut one 염색으로 정의된 글루탐산 시냅스의 70~80%가 검출 가능한 FM 1 43 염색을 나타내는 것을 확인하였습니다.

이는 공동 국소화된 마커들과 함께 시냅스를 형성하는 다수의 노란색 점들이 관찰됨으로써 분명하게 나타납니다. 이들은 화살표로 표시되어 있습니다. 빨간색 V glut one 양성 점의 약 20~30%는 기선 위로 녹색 FM 1 43 형광이 나타나지 않을 것입니다.

이들은 비활성 시냅스 전 말단이며, 화살표 머리가 가리키는 것이 그 예시입니다. 세 번째 시냅스 집단 또한 관찰될 것입니다. 이들은 녹색 FM 1 43 형광에는 양성이지만, 적색 B glut one 염색은 나타나지 않습니다.

이들은 활성 GABA 작동성 시냅스이며, 별표로 표시된 것이 그 예시입니다. 이들은 대부분의 분석에서 제외되지만, 소포성 GABA 운반체 항체를 사용하여 명시적으로 연구할 수 있습니다. VLU T one 항체 대신, FM 1 43 및 VLU one 면역 염색을 사용하여 시냅스 전 정지 상태의 시냅스를 시각화하는 방법을 보여드렸습니다.

이 실험 절차를 수행할 때, FM 1 43 FX는 adver sub seven 세척 시간과 블로킹 용액에 포함된 처리 X 100 농도 모두에 민감하다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이것으로 모든 설명을 마치겠습니다. 시청해주셔서 감사하며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.