Name: 에서 듀얼 레코딩 체세포 생식 샘 자극 호르몬 - 방출 Hypothalamic 조각에 녹색 형광 단백질 (GFP)에 의해 확인된 호르몬 (GnRH) 신경을 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-02-23T17:20:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: 배우세요 하시타 뇌절편에서 GFP로 식별된 GnRH 뉴런의 이중 세포부착 기록법을. 이 방법은 생식 호르몬 조절 메커니즘을 연구하는 데 활용됩니다.

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나는 로날드 L. 카라 브 레즈, 디터 예거 (에모리 대학)과 유용한 기술 토론 구청 Yuhas (액슨 인 스트 루먼트)에 감사드립니다.

<ol><li> Hypothalamic 뇌 슬라이스는 준비 incubated 및 그의 GnRH 뉴런 GnRH 펩티드 발기인 (10)의 통제하에 녹색 형광 단백질 (GFP)을 표현하는 동물 이전에 세부로 기록 챔버 (9)으로 전송됩니다. 동물의 두뇌의 제거 후, ​​두뇌는 관심이없는 영역을 제거하기 위해 면도날을 사용하여 차단됩니다. 시상 하부는 시각 수 있도록 제거하는 영역을 결정하기 위해서는 두뇌가 그 등의 표면에 위치합니다. 코로나와 화살 슬라이스 방향 모두에 대해, 소뇌가 제거됩니다. 코로나 슬라이스 준비, 피질의 주동이의 부분이 제거됩니다. 이 슬라이스 방향에서 피질의 측면 지역은 머리를 깔끔히에 대한 지원을 제공하고 녹음 챔버의 뇌를 보호하는 실버 와이어의 위치에 대한 두뇌의 충분한 공간을 제공합니다. 화살 슬라이스 준비, 두뇌의 측면 영역이 제거되고 피질의 주동이의 부분이 깔끔히 뇌를 잘 녹음의 뇌를 보호하는 실버 와이어의 배치에 대한 지원을 제공하고 있습니다. 차단 절차를 통해, 두뇌가 지속적으로 유리 피펫을 사용하여 차가운 인공 뇌척수 (ACSF)와 moistened 있습니다. </li><li> Superglue의 작은 금액은 절삭 플랫폼에 배치됩니다. 두뇌는 주걱과 함께 해제됩니다. 초과 ACSF는 주걱의 표면에 Kimwipe 가지고와 뇌의 가까이 초과 ACSF를 그림으로써 제거됩니다. 머리가 부드럽게 접착제에 앞으로 하락이다. 그것을 확보하기 위해 머리를 만지거나 그것에 아래로 밀어하지 않는 것이 중요합니다. 뇌 자체의 무게는 대개 안전 보장하기 위해 충분합니다. </li><li> 두뇌와 절삭 플랫폼은 다음 진동 마이크로톰을 확보하고 절단 잘 감기 ACSF으로 가득합니다. 추위 솔루션은 두 회사 두뇌와 절단 절차를 수행하는 동안 손상으로부터 보호할 수 있습니다. 다른 뇌 영역은 품질 조각을 최적화 추위의 정도에 따라 다릅니다. hypothalamic 조각의 준비를위한 ACSF의 온도는 일반적으로 0 ° C.입니다 </li><li> 조각은 천천히 절단되어야하며 각각의 슬라이스는 두뇌에서 멀리 자유롭게 부유한다. 슬라이스가 절단하는 동안 침묵 시작하면 날개가 발전하는 속도가 느려해야합니다. 하나는 작은 페인트 조각을 펴다 브러시 그러나 이것은 위험 조각 손상 않으며 따라서 피해야한다을 사용할 수 있습니다. 천천히 블레이드 사전의 속도는 페인트 브러쉬를 사용하여보다 선호됩니다. </li><li> 각 슬라이스는 두뇌에서 해고되면서, 그것은 절단 챔버에서 철회하고 온수 욕조 (약 32 ° C)에서 슬라이스 배양 챔버에 배치됩니다. 슬라이스 인큐베이터는 지속적으로 95% O 2 5% CO 2의 혼합물을 사용하여 산소와 함께 제공됩니다. 30 분 거리에 2 시간 일반적으로, 사전 녹화 슬라이스 배양 범위. </li><li> 앞에서 설명한 것처럼 유리 pipettes (MΩ 3-6)은 세로 풀러를 사용하여 (9) 가공하고 있습니다. 당기의 온도와 기간은 피펫 끌어당기는 한 사용, 유리 하나 사용하고 풀러의 가열 필라멘트의 수명의 종류의 유형에 따라 다릅니다. 피펫 팁의 모양도 사용자의 취향에 따라 달라질 수 있습니다. 우리는 0.1 mm의 개방과 균일하게 테이퍼 팁 잘 성공을 달성했습니다. 피펫에 큰 구멍이 작아 채용 오랜 기간 녹음의 결과에 실패하면서 신경을 손상하는 경향이 있습니다. </li><li> Pipettes은 용량을 줄이기 위해 Sylgard와 코팅. 아이고, 피펫 팁은 가볍게 Sylgard 184 두 번째 피펫을 이용하여 코팅하고 있습니다. Sylgarded 팁 열 총을 사용하여 열 치료 후 수 있습니다. 이러한 pipettes은 다음 목욕탕 perfusate 가득합니다. 피펫 팁의 시각화를 향상시키기 위해 알렉사 - 568의 작은 금액은 pipettes를 작성하기 전에 피펫 솔루션으로 사용할 목욕 솔루션의 부분에 추가됩니다. 우리는 알렉사 - 568의 무게가 아니라 눈으로 솔루션 분홍색을 설정하는 정도로 사용하지 마십시오. 피펫 팁 다음 텍사스 빨간색 필터 시각하실 수 있습니다. </li><li> 우리는 낮은 저항 바다표범을 (토론 참조)를 사용하여 액션 잠재력의 감지 전류 클램프 녹음을 얻는 방법을 개발했습니다. 녹음없이 적용 현재 사용 액슨 악기의 2B Axoclamp와 세포의 내생적인 휴식 가능성에서 수행됩니다. 그러나, 때문에 낮은 저항 도장을 한 단지 2B 앰프와 행동 잠재력을 감지하지 못했습니다. 신호를 높이려면 두 번째 앰프 (AM 시스템 3000) Axoclamp의 2B와 시리즈에서 사용됩니다. 이 방법은 장기 레코딩 느슨한 바다표범과 유틸리티의 용이성이 있습니다. 기술적으로, 하나는 직접함으로써 (토론 참조) 전압 - 클램프 녹음 모드에서 접근의 문제점을 우회, 액션 잠재력을 측정할 수 있습니다. </li><li> 하나는 전체 세포 기록 구성에 대한 접근 방식과 비슷한 방식으로, 동시에 두 사람 이전에 선택한 뉴런의 표면에 두 pipettes 걸립니다. NE 모두 접근동시에 urons 독자 쌍 각 뉴런을 시도보다 듀얼 레코딩을 얻기에 더 많은 성공을 거두었습니다. 전체 셀 레코딩을위한 접근하는 동안 수행으로이 기간 동안, 현재 분사 펄스는 2B 앰프에서 전달됩니다. </li><li> 긍정적인 압력이 팁을 막히는 것을 방지하기 위해 두 pipettes에서 유지 관리해야합니다. 듀얼 레코딩에 대한 긍정적인 압력이 최고의 튜브의 조각의 길이로 피펫 홀더에 부착된 unfilled 3 ML 빈 주사기를 사용하여 생성됩니다. 주사기를 사용하면 한 두 pipettes 압력을 유지할 수 있습니다. 긍정적인 압력이 즉시 피펫이 녹화 챔버의 목욕 솔루션에 배치되었습니다으로 적용되어야합니다. 하나는 순차적으로 pipettes로 선택한 뉴런 접근. 신경 세포의 가장 큰 표면에 직접 첫 번째 피펫을 위치하면, 한 장소에서 주사기를 떠나하여 긍정적인 유지하고이 위치에 피펫을 떠납니다. 하나는 다음 녹화 챔버의 상단에 반환하고 위치로 두 번째 녹화 피펫을 절감. 선택된 뉴런은 조각의 다른 수준에서 종종 있습니다. 첫 번째 피펫은 더 많은 외면적인 신경 세포에서 슬라이스와 위치를 두 번째 피펫에 깊은하는 신경 세포를 통해 위치해야합니다. 이것은 pipettes은 슬라이스를 입력으로 슬라이스가 수직 비행기에서 약간 이동합니다 두번째 피펫의 위치를​​ 이동에서 두 번째 피펫의 위치를​​ 방지할 수 있습니다. </li><li> 루쓰 물개 (MΩ 18-30)이 사용됩니다. 긍정적인 압력은 각 세포의 표면에 작은 보조개를 유도합니다. 하나는 긍정적인 압력을 해제하고 아주 약간의 부정적인 압력을 적용하여 최초의 신경 세포를 밀봉을 시도합니다. 긍정적인 압력은 주사기를 제거하여 발표합니다. 입으로 흡입은 다음 튜브의 끝에 자유에 적용됩니다. 건강한 신경 세포의 막이 신속하게 긍정적인 압력의 출시에 대응하고 피펫을 준수합니다. 약간 흡입은 건강한 신경 세포에 적절한 저항과 인감을 형성합니다. </li> <li> 점막은 매우 유리를 청소하기 위해 인감 이후 하나는 신경 세포와 실패를 봉인하려고 시도하면, 피펫은 다시 사용할 수 없습니다. 대신, 하나, 잘 재관류의 상단에 떨어진 조각의 표면에서 피펫 (그리고 현미경 목표)을 제기 목욕에서 피펫을 제거, 깨끗한 피펫을 변경하고 다른 전지를 밀봉을 시도할 수있는 조각으로 돌아갑니다 . 이러한 이유로, 레코딩에 대해 여러 가능성이 뉴런을 선택하는 것이 중요합니다. 선택할 수있는보다 4-6 녹화 품질 뉴​​런과 슬라이스 들어, 듀얼 레코딩을 얻기에있는 성공은 제한됩니다. </li><li> 저항에 따라 느슨한 도장을 설립 후, 2B 앰프에서 현재 분사 펄스가 종료됩니다. 2B의 amplifer는 3000 시리즈 amplifer와 시리즈에 배치됩니다. 이 구성에서, 2B의 amplifer의 출력은 3000 시리즈 amplifer에 대한 입력으로 제공하고 있습니다. 후자 amplifer는 데이터 수집을위한 신호를 제공합니다. </li><li> 인감 (4 단계)와 amplifers의 재구성 (5 단계)은 다음 두 번째 신경 세포에 대해 반복됩니다. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1678/1678fig1tmb.jpg" alt="그림 1" border="0" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1.의 기간은 화살 슬라이스 준비에 느슨한 인감 첨부 녹음 구성을 사용하여 두 GnRH 뉴런에서 발사 증가했습니다. 슬라이스는 거세 남성에서 파생되었다. 각각 상향 편향은 행동 잠재력을 나타냅니다. 두 번째 GnRH 신경 세포는 간헐적인 파열을 전시하면서 한 GnRH 신경 세포 (상단 흔적)이 거의 지속적인 시행을 전시합니다. 단일 GnRH 뉴런의 활동이 패턴은 생체내 (7)의 호르몬 분비 중에 멀티 유닛 녹음에서 추출된 단일 단위의 비슷합니다. 하시기 바랍니다 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1678/1678fig1.jpg">여기를 클릭</a> 그림 1의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.

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</ol>

GnRH 뉴런 (호르몬 분비에 따라)를 포함한 일부 뉴런에 대한 관심의 활동은 시간의 시간 단위 (5-7)에 발생합니다. 따라서, 전체 셀 구성은 전체 세포 녹음 모드에서 세포내 메신저의 투석으로 인해 일부 실험 목표를위한 최선의 선택이 아닐 것입니다. Secondarily, 전체 셀 녹음은 일반적으로 나이 약 12​​0 일 이상 적은 동물로 제한됩니다. 나이, 세포막의 연결은 높은 저항 바다표범 달성하기 어려운 만들기, 등귀하다로 나타납니다. 또한, 경우 하나는 패치가 피펫과 막 사이에 구멍을 떠나, 인감 방해 rupturing, 높은 저항 인감을 얻습니다. 이것은 사용할 수 없게 녹화 빠르게 이온 불균형으로 인해 죽게 될 신경 세포로 안내합니다. 한 합리적인 전체 셀 녹음을 얻기 예상할 수있을 때 세 이상; 일반 난소주기, 그리고 따라서 GnRH 펄스 생성기의 안정적인 활동 (11, 12 C57Bl6 여성의 나이 70~10개월) 나중에까지 발생하지 않습니다 안정. 마지막으로, 전체 셀 녹음은 내부 및 외부 이온 농도의 내생적인 비율을 파괴. 전체 세포 기록과 함께, 어떤 이온의 내부 농도는 피펫 솔루션에있는 이온의 농도 같습니다. /이 세포의 비교적 적은 내생 볼륨을 대체와 피펫 솔루션의 비교적 큰 볼륨이 빠르게 평형에 도달하기 때문입니다. 느슨한 세포 부착 방법은 전체 세포 녹음의 한계 많은 circumvents. 첫째, 낮은 저항 인감 (MΩ 15-30)을 사용할 수 있습니다. 이들은 심지어 나이가 동물에서 뉴런의 형태로 상대적으로 쉽습니다. 둘째, 하나는 막 파열의 밀봉 패치를하지 않습니다. 따라서 느슨한 세포 부착 녹음은 전체 세포 녹음보다 기술적으로 훨씬 용이합니다. 또한 세포막은 그대로이기 때문에, 세포 내 구성 요소의 투석가 발생하지 않으며 내생 이온 비율은 보존되어 있습니다. 하나는 시냅스 전류를 공부에 대한 느슨한 세포 부착 방법을 사용할 수 있지만 그것은 상대적으로 비침습적인 방법으로 뉴런에서 장기 녹음에 이상적입니다. 셀 - 첨부된 녹음도 피펫으로 표준 세포 솔루션을 사용하여 수행할 수 있습니다. 이것은 장기적인 녹음이 완료되면 막 패치를 rupturing하고 세포 마커와 신경 세포를 라벨의 추가 혜택을 제공합니다. 느슨한 세포 부착 방식은 전압 클램프 녹음 모드에서 사용되고 있습니다. 그러나, 느슨하게 연결된 세포 구성에 전압 클램프 녹음이 몇 가지 방법론 문제가있다. 첫째, 녹음 신호가 활동의 간접적인 측정하기위한 한 방법입니다. (소위 동작 전류)를 측정 신호는 멤브레인 (13) 청구 용량성 전류입니다. 이것은 매우 중요한 방법 론적 문제입니다. 기록 피펫의 용량과 저항이 기록된 신호를 필터링할 수 있습니다. 그것은 작은 동작 전류가 제대로 headstage의 높은 저항으로 인해 대부분의 앰프와 보상 수 없습니다 피펫의 커패시턴스를 충전에 손실 가능성이 높습니다. 이러한 신호가 나오지 않을 때, 신경 세포의 명백한 해고 패턴은 진정한 발사 패턴을 반영하지 않습니다. 마찬가지로, uncompensated 피펫 및 인감 resistances는 동작 전류를 표현하는 경우로 변경 (13) 동안 측정에 큰 오류의 원인이됩니다. 어떤 앰프는 커패시턴스와 신호 손실을 제한 피펫 날인에 대한 저항 &quot;보상&quot;을 제공하고 있지만, 대부분의 앰프의 높은 저항 헤드 단계가 최적의 보상을 방해. 둘째, 인공 상황은 세포에 부과됩니다. 전압 클램프 모드에서 세포막 주변 이러한 연구, 0 뮤직 비디오에 고정 가능성에 개최됩니다. 이것은 세포막에 적용도 현재이 없다는 뜻은 아닙니다. 전압 클램프로 측정 신호는 실제로 고정 가능성을 유지하기 위해 막에 적용되는 현재의 금액입니다. 따라서이 적용된 현재는 세포 활동을 변경할 수 있습니다. GnRH 시스템에 듀얼 레코딩 특히 GnRH 뉴런과 확산 유통의 수는 제한되어 있기 때문에 도전하고 있습니다. 듀얼 레코딩이 성공하기 위해서는, 조작하는 사람은 매우 안정되어야합니다. 전극의도 약간의 움직임 신경 세포를 실수로 녹음을 종료하기 위해 피펫가 발생할 수 있습니다. 또한, 세포에 피펫의 움직임 (예를 들어, 움직임 보상에 다시 위치)는 발사 패턴을 변경할 수 있습니다. 일부 이온 채널과 같은 N - 타입 칼슘 채널은 기계식 구분 : 멤브레인 스트레치는 전체 세포와 세포에 연결된 모두 녹음 구성 (14) 반복적인 활동을 발생합니다. 마지막으로, 조작하는 사람의 시스템은 매우 좋은 부드러운 모션 수 있어야합니다. 듀얼 레코딩과 함께, 위에서 바와 같이, 하나는 같은 시간과 인감 시도에서 두 이전에 선택한 뉴런의 표면에 두 pipettes 걸립니다한 신경 세포. 성공한다면, 시도가 두 번째 세포를 밀봉합니다. 일반적으로, 하나는 모든 시도와 고품질 레코딩을 밀봉하고이 기​​대 수 없습니다. 이것은, 그러나, 듀얼 레코딩과 함께 특정 문제를 만듭니다. 하나는 최초의 신경 세포로 성공하지만 두 번째로 실패하면, 하나는 피펫을 변경하고 다른 세포를 시도해야합니다. 따라서, 하나는 성공적으로 밀봉 신경을 방해하지 않고 잘 재관류의 상단 (피펫을 변경할 수)에 현미경의 침지 목적과 피펫을 모두 이동시킬 수 있어야합니다. 듀얼 레코딩에 대한 느슨한 세포 부착 방식 우리의 개발 및 사용 GnRH 뉴런을 연구의 주요 기술 발전이다. 이 메커니즘은 조정 활동을 기초 어떤 중요한 질문의 맥락에서 앞으로 필드를 이동 타악기 호르몬의 분비로 이어지는. 도움이 될 것입니다 유용한 결과를 얻을 가능성이

에서 듀얼 레코딩 체세포 생식 샘 자극 호르몬 - 방출 hypothalamic 조각에 녹색 형광 단백질 (gfp)에 의해 확인된 호르몬 (gnrh) 신경을

Dual Somatic Recordings from Gonadotropin-Releasing Hormone (GnRH) Neurons Identified by Green Fluorescent Protein (GFP) in Hypothalamic Slices

생식 샘 자극 호르몬 - 방출 호르몬 (GnRH)는 luteinizing 호르몬 (LH)과 소낭 자극 호르몬 - (FSH)의 뇌하수체 릴리스를 조절 작은 neuropeptide입니다. 이러한 gonadotropins은 생식 기능의 조절에 필수입니다. 그들이 hypophysiotropic 포털 시스템 (1)에 자신의 축삭 터미널에서 GnRH을 해제 어디 GnRH 함유 뉴런은 평균 예하에 시상 하부 및 프로젝트 전반에 걸쳐 diffusely 배포됩니다. 포털 모세 혈관에서 GnRH은 조직의 순환에 gonadotropins의 릴리스를 자극하기 위해 앞쪽에 뇌하수체에 여행​​. GnRH 릴리스는 지속적인 것은 아니지만 오히려 에피소드 펄스에서 발생합니다. 그것은 잘 GnRH 릴리스의 간헐적인 방식으로 재생산 (2, 3)을 위해 필수적임을 ​​설정됩니다. 여러 아마도 GnRH 뉴런의 underlies의 GnRH 펄스의 활동을 조정. GnRH 뉴런의 총 펩타이드 내용은 약 1.0 PG / 30 % 가능성 releasable 수영장 구성되어있는 셀 (4).입니다 펄스 동안 GnRH (5, 6)의 수준은 여러 GnRH 뉴런은 아마도 neurosecretion에 참여하시기 바랍니다. 마찬가지로 하나의 단위 활동 여러 뉴런 (7)의 활동의 변화를 나타냅니다 LH 릴리스 중 hypothalamic 멀티 유닛 녹음에서 추출한. LH 펄스 동안에 기록된 활동 전극은 GnRH somata 또는 섬유 (8) 중 하나와 연결됩니다. 따라서, 적어도이 활동 중 일부는 GnRH 뉴런에서 발생한다. 메커니즘은 hypothalamic GnRH의 뉴런의 동기화 해고의 결과는 알 수있다. GnRH 뉴런의 해고 조정 메커니즘을 Elucidating하는 것은 복잡한 문제입니다. 첫째, GnRH 뉴런은 수가 상대적으로 적은 수 있습니다. 설치류에서 800-2500 GnRH 뉴런가 없습니다. 다 GnRH 뉴런이 에피소드 GnRH 릴리스에 관련된 것이 분명하지 않습니다. 또한, GnRH의 뉴런은 diffusely (1) 배포됩니다. 이것은 사격의 조정에 대한 우리의 이해를 복잡하고 많은 기술 접근​​이 어​​려운되었다. 우리는 행동 잠재력의 직접 검출을위한 전류 클램프 모드에서 느슨한 세포 연결된 녹음을 최적화하고 GnRH 뉴런의 쌍의 동시 녹음을 허용 녹음 방식을 개발했습니다.

의 연결 시스템의 활동은 종종 특정 인구 내에서 뉴런에서 동기 조치 가능성 배출이 필요합니다. 예를 들어,의 펄스 호르몬 (GnRH)를 생식 샘 자극 호르몬은 - 발표하는 것은 가능성이 GnRH 뉴런 사이의 조정 활동을 필요로합니다. 우리는 안정 diffusely 배포 GnRH 뉴런에서 동시 electrophysiological 레코딩을 얻기위한 우리의 방법론 접근법을 제시한다.

에서 듀얼 레코딩 체세포 생식 샘 자극 호르몬 - 방출 Hypothalamic 조각에 녹색 형광 단백질 (GFP)에 의해 확인된 호르몬 (GnRH) 신경을

생식샘자극호르몬 방출호르몬(Gonadotropin-Releasing Hormone, GnRH)은 황체형성호르몬(LH)과 여포자극호르몬(FSH)의 뇌하수체 방출을 조절하는 작은 신경펩타이드입니다.

본 영상에서는 성선자극호르몬 방출호르몬 뉴런으로부터 이중 세포 부착 기록을 수행하는 절차를 설명합니다. 시상하부 뇌 절편을 관상면 또는 시상면 방향으로 준비합니다. 그런 다음 침수 렌즈를 사용하여 절편을 시각화하고, 두 개의 뉴런 위에 피펫을 배치합니다.양압을 해제한 후 체세포 막세포에 음압을 가하여 저저항 씰(low resistant seals)을 형성합니다. 그러면 부착 기록을 수행할 수 있습니다. 안녕하세요, Kelly Suiter입니다.텍사스 대학교 샌안토니오 캠퍼스 생물학과 내 저의 연구실에 오신 것을 환영합니다. 저는 Suitor Lab의 Peter Heman입니다. 오늘은 마우스의 시상하부 절편 내 성선자극호르몬 방출호르몬 뉴런으로부터 이중 체세포 기록(dual somatic recordings)을 얻는 절차를 보여드리겠습니다.저희 실험실에서는 GNH 뉴런의 협응 발화(coordinated firing)를 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다. 이제 시작해 보겠습니다. 이소플루란(isof fluorine) 마취 후 안락사(참수)시킨 마우스에서 뇌를 적출하는 것으로 절차를 시작하십시오.오늘의 실험 절차에 사용된 마우스는 GNRH 뉴런에서만 특이적으로 발현되는 GNRH 펩타이드 프로모터의 조절 하에 녹색 형광 단백질을 발현합니다. 뇌를 적출한 후, 차가운 인공 뇌척수액(A CSF)에 넣으십시오. 차단 절차 전반에 걸쳐 시상하부가 노출되도록 뇌의 배측 표면이 위로 오게 놓으십시오.유리 피펫을 사용하여 차가운 A CSF로 뇌를 지속적으로 적셔줍니다. 시상면 절편을 준비하려면 면도날을 사용하여 소뇌를 제거합니다. 그런 다음 뇌의 외측 부위를 제거합니다.피질의 앞부분(rostral portions)은 뇌 슬라이싱과 뇌를 고정하기 위한 은선(silver wires) 배치 시 지지대 역할을 합니다. 기록 과정에서는 먼저 절단 플랫폼 위에 소량의 순간접착제를 도포합니다. 스패튤라를 사용하여 뇌를 들어 올린 다음, 킴와이프스(Kim wipe)를 스패튤라 표면에 접촉시켜 뇌 표면의 과도한 A CSF를 제거합니다.그런 다음 면도날을 사용하여 뇌를 접착제 위로 조심스럽게 앞으로 밀어 이동시킵니다. 이동 과정에서 뇌를 만지거나 누르지 않는 것이 중요합니다. 뇌 자체의 무게만으로도 충분히 고정될 것입니다.뇌와 절단 플랫폼을 진동 마이크로톰에 고정하고, 절단 웰을 차가운 A CSF로 채웁니다. 차가운 용액은 뇌를 단단하게 만들어 절단 과정 중 손상으로부터 보호합니다. 슬라이스를 천천히 절단합니다. 각 슬라이스는 뇌로부터 자유롭게 떠올라야 합니다.절단실에서 절편이 절단되는 대로 즉시 꺼내어, 95% oxygen과 5% carbon dioxide 혼합 가스가 지속적으로 공급되는 절편 배양실에 넣고 약 32 °C의 온수조에서 1~2시간 동안 배양합니다. 계속해서 절편을 절단하여 배양실에 넣습니다. 절단 과정 중 절편이 말리기 시작하면 칼날의 전진 속도를 늦춥니다.수직 풀러(vertical puller)를 사용하여 유리 피펫을 제작합니다. 개구부가 0.1 millimeters인 균일한 테이퍼 팁을 권장합니다. 그다음, 두 번째 피펫을 사용하여 피펫을 Sard 180 4로 코팅함으로써 커패시턴스를 감소시킵니다.그런 다음 히트건을 사용하여 실 가드 처리된 팁을 경화시킵니다. 해동된 0.5 milliliter 분량의 세포 내 용액에 소량의 Lucifer yellow를 첨가하고 초음파 처리합니다. 용액은 노란색으로 보여야 합니다.피펫을 노란색 세포 내 용액으로 채웁니다. 이렇게 하면 클램프 기록 과정 중에 GFP 필터를 사용하여 팁을 시각화할 수 있습니다. 슬라이스를 1~2시간 동안 배양한 후, 배양 챔버에서 하나를 꺼내 기록 챔버로 옮깁니다.Lucifer yellow로 세포 내를 채운 피펫을 각 헤드 스테이지의 피펫 홀더에 장착합니다. 그 다음, 튜브를 사용하여 각 피펫 홀더에 비어 있는 3 mL 주사기를 연결합니다. 이는 실험 과정 중 피펫이 막히는 것을 방지하기 위해 양압을 가하는 용도로 사용됩니다.GFP 필터를 사용하여 피펫 팁을 시각화하십시오. 슬라이스 내에 기록 품질이 우수한 뉴런이 4개 이상 있는지 확인하십시오. 품질이 좋은 뉴런은 다소 배 모양을 띱니다.매우 둥근 뉴런과 위축된 뉴런은 일반적으로 사멸 과정에 있는 상태입니다. 기록을 위해 두 개의 뉴런을 선택하십시오. 선택된 뉴런들은 종종 슬라이스의 서로 다른 층에 위치합니다. 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여, Axo clamp 증폭기가 전류 주입 펄스를 통과시키도록 설정하십시오.그런 다음 마이크로 조작기를 사용하여 첫 번째 피펫을 슬라이스에서 가장 깊은 곳에 위치한 뉴런의 가장 넓은 표면에 배치하고, 두 번째 피펫을 더 표면에 있는 뉴런에 배치합니다. 이렇게 하면 두 번째 피펫을 배치할 때 첫 번째 피펫의 위치가 밀리는 것을 방지할 수 있습니다. 피펫이 슬라이스에 진입할 때 슬라이스가 수직 평면에서 약간 움직이므로, 이어서 첫 번째 피펫을 첫 번째 뉴런 위로 내린 다음 즉시 시린지를 사용하여 양압을 가합니다.양압을 가하면 세포 표면에 작은 함몰 부위가 생깁니다. 첫 번째 피펫을 배치한 후, 기록 챔버 상단으로 돌아가 다시 두 번째 기록 피펫을 위치시키고 시린지를 사용하여 양압을 가합니다. 두 피펫이 모두 배치되면 시린지를 제거하여 양압을 해제함으로써 첫 번째 뉴런을 밀봉합니다.건강한 뉴런의 세포막은 피펫에 부착될 것입니다. 그런 다음 소량의 구강 흡입을 사용하여 적절한 저항을 가진 밀폐(seal)가 형성되도록 음압을 가합니다. 피펫과 뉴런 사이에 밀폐가 성공적으로 이루어지지 않은 경우, 현미경 대물렌즈와 피펫을 슬라이스 표면에서 떼어 관류액 상단까지 들어 올리십시오.사용한 피펫을 깨끗한 피펫으로 교체합니다. 피펫을 교체한 후, 다시 슬라이스로 돌아가 새 피펫을 사용하여 씰(seal)을 형성합니다. 저항 값을 통해 루즈 씰(loose seal)이 형성된 것이 확인되면, Axo clamp amplifier에서 출력되는 현재의 주입 펄스를 중단하십시오.Axo clamp 2B 증폭기를 AM systems 3000 증폭기와 직렬로 연결하여, Axo clamp 2B 증폭기의 출력이 AM systems 3000 증폭기의 입력으로 들어가게 합니다. 후자의 증폭기는 데이터 수집을 위한 신호를 제공합니다. 다음으로, 두 번째 뉴런의 씰(seal)을 형성하고 증폭기 설정을 재구성합니다.두 피펫 모두 실링(seal)이 형성되면, 데이터 수집을 통해 활동 전위 측정을 즉시 시작합니다. Lucifer yellow는 이중 기록 기술을 시연하기 위해 시각화를 높이는 용도로만 사용되었습니다. 그러나 Lucifer yellow는 뉴런에 독성이 있으며, 뉴런을 채우기 위해 실링을 파열시킬 경우 활동 전위의 기초가 되는 나트륨 전류의 불활성화를 변화시킵니다.따라서 본 방법에서는, 기록 후 Alexa 5 68을 사용하여 실험을 진행하며, 씰을 파열시켜 뉴런에 Alexa 5 68이 채워지도록 함으로써 이후의 조직학적 분석이 가능하게 합니다. 이 영상에서 제시된 cell-attached 기록법은 성선자극호르몬 방출호르몬(gonadotropin releasing hormone) 뉴런의 전통적인 whole-cell 기록과 cell-attached 기록을 동시에 수행함으로써 검증되었습니다. 여기에서 보시는 바와 같이, 느린 자발적 발화와 반복적 발화 모두에서 cell-attached 기록의 활동전위와 whole-cell 기록의 활동전위가 완전히 일치함을 알 수 있습니다.왼쪽 패널에는 저주파의 모사 AMPA 타입 수용체 활성화를 적용했을 때, cell attached 및 whole cell 기록 구성 모두에서의 반응이 나타나 있습니다. cell attached 기록 구성의 각 활동 전위가 whole cell 기록의 대응하는 활동 전위와 연관되어 있음에 유의하십시오. 오른쪽 패널은 점선으로 표시된 고주파의 모사 AMPA 타입 수용체 활성화 버스트에 대한 뉴런의 반응을 보여줍니다.자극된 입력 버스트에 반응하여 cell-attached 기록 구성과 whole-cell 기록 구성 모두에서 활동 전위 빈도가 증가하는 것에 주목하십시오. 트레이스 G는 시뮬레이션된 AMPA 타입 수용체의 활성화 빈도가 증가했을 때, 점선 아래에 표시된 D의 기록 부분의 시간 척도를 확장하여 보여줍니다. 마지막으로, cell-attached 기록과 whole-cell 기록 사이에 일치성이 나타납니다. 뉴런이 활동 전위를 방출하도록 탈분극 전류 주입 펄스를 가했을 때 그러합니다.이 패널은 cell-attached 기록 구성과 whole-cell 기록에서 전류 주입 펄스에 대한 A-G-N-R-H 뉴런의 반응을 보여줍니다. 중간 트레이스의 삽입도는 검출된 활동 전위의 파형을 확대한 것입니다. cell-attached 구성에서 검출된 각 활동 전위에 대응하는 활동 전위가 whole-cell 기록 구성에서도 검출되었음에 유의하십시오.지금까지 시상하부 절편에서 이중 세포체 기록(dual somatic recordings)을 수행하는 방법을 보여드렸습니다. 이 과정은 숙련이 필요하다는 점을 기억하시기 바랍니다. 이것으로 모든 설명을 마치겠습니다.시청해주셔서 감사합니다. 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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