효소 복제 DNA의 직접 관찰 어세을 스트레칭 단일 분자 DNA를 사용하여

이 동영상은 광시야 광학 현미경 및 선형화 및 화학적으로 변형된 람다에 의한 DNA 복제를 시각화하기 위한 프로토콜을 보여줍니다. DNA는 기능화된 유리 커버 슬립에 부착되어 있습니다. DNA의 자유 끝은 비드 라벨링되고 DNA는 층류에 의해 늘어납니다.

복제가 시작되면 선행 가닥이 길어지기 시작하고 코일링으로 인해 지연 가닥이 짧아집니다. 낮은 힘에서 이중 가닥 DNA와 단일 가닥 DNA의 길이 차이가 크기 때문에 복제 중 DNA 변환을 직접 관찰할 수 있습니다. DNA 구조체의 길이는 비드의 위치를 추적하여 모니터링되며, 이를 통해 DNA 복제의 속도와 과정을 정확하게 결정할 수 있습니다.

안녕하세요, 저는 하버드 의과대학 생물화학 및 분자 약리학과의 Anto one Vanian 연구소의 Ari Ulrich와 Charles Richardson입니다. 오늘 우리는 단일 분자 수준에서 DNA 복제를 이미징하는 절차를 보여 드리겠습니다. 우리는 DNA 합성 중에 발생하는 효소 활동을 연구하기 위해 실험실에서 이 절차를 사용합니다.

이 절차의 시작 부분에서 시작하겠습니다. 선형화된 박테리아 파지 Lambda DNA는 무릎을 꿇은 올리고뉴클레오티드에 의해 변형되어 복제 포크, 람다 상보적 포크 암, 비오틴화 포크 암 및 포크 프라이머를 형성합니다. 비오틴화된 포크 팔뚝에는 5개의 프라임 말단에 부착된 비오틴 t가 포함되어 있어 DNA 주형을 플로우 셀 표면에 테더링할 수 있습니다.

람다 DNA는 비드 부착을 위한 친화성이 높은 면역 태그 역할을 하는 diggen과 moiety를 포함하는 또 다른 올리고뉴클레오티드인 annealing에 의해 추가로 변형됩니다. 복제 포크를 생성하려면 이 비디오와 함께 제공되는 서면 프로토콜에서 염기서열을 찾을 수 있는 여러 올리고뉴클레오티드 외에 람다 DNA를 얻으십시오. 이러한 올리고뉴클레오티드는 비오틴화된 포크 암, 람다 상보적 포크 암, 포크 프라이머, 람다 상보적 디겐 및 말단 인산화를 포함하며, T 4개의 폴리뉴클레오티드 키나아제를 사용하는 람다 상보적 포크 암 및 람다 상보적 디고 게닌 말단의 5개 프라임 말단을 인산화합니다.

다음으로 인산화된 lambda complementary fork arm, biotinylated fork arm, fork primer 및 lambda DNA를 10 대 10 - 100 대 1의 몰 비율로 혼합합니다. T4 DNA 리가아제 완충액에서 혼합물을 섭씨 65도에서 5분 동안 가열하고 올리고뉴클레오티드와 T4 DNA 리가아제를 혼합물에 적절하게 어닐링할 수 있도록 가열 블록을 꺼서 실온으로 서서히 냉각하고 2시간 동안 배양합니다. 실온에서 T 4 DNA 리가아제는 올리고뉴클레오티드와 람다 사이의 틈새를 밀봉

DNA는 최종적으로 인산화된 람다 상보적인 diggen을 추가함으로써 DNA 복제 주형에 람다 상보적 굴착 및 끝을 anil하고, T 4 리가제 완충액에서 30분 동안 혼합물을 배양하고, 다시 열 블록을 꺼서 실온으로 천천히 냉각시키고, 인산화된 람다 상보적 굴착 산소를 가열하고, 혼합물에 T 4 DNA 리가제를 첨가함으로써 DNA 복제 주형에 끝냅니다 실온에서 2시간 동안 배양합니다. 이제 최종 DNA 복제 템플릿을 사용할 준비가 되었습니다. 태슬 활성화 마그네틱 비드를 DNA 복제 주형에 부착하기 위해서는 digo genin에 특이적인 FAB 단편으로 기능화되어야 합니다.

이 과정을 시작하려면 비드의 원액을 다시 현탁시키고 400마이크로리터를 einor 튜브로 옮깁니다. 튜브를 자기 분리기에 넣고 용액이 제거될 때까지 배양합니다. 그런 다음 피펫팅으로 상층액을 제거합니다.항체 결합을 위해 toal 그룹을 활성화하려면 1ml의 boid buffer를 추가하고 피펫팅으로 부드럽게 혼합합니다.

다시 말하지만, 자기 분리기를 사용하여 상등액을 제거하십시오. 다음으로, 240마이크로리터의 FAB 단편을 추가하고 400마이크로리터의 붕산염 완충액에 비드를 재현탁합니다. 완전히 섞어 섭씨 37도에서 16-24시간 동안 회전체에서 배양합니다.

배양 후 자기 분리기를 사용하여 비드를 분리하고 상층액을 제거합니다. 1ml의 세척 버퍼로 비드를 세척하고 섭씨 4도에서 5분 동안 배양한 후 자기 분리기를 사용하여 버퍼를 제거합니다. 이 세척은 두 번 반복됩니다.

유리 토실 그룹을 차단하려면 트리스 버퍼가 포함된 BSA 1ml를 추가하고 섭씨 37도에서 4시간 동안 배양합니다. 배양 후, 자기 분리기를 사용하여 비드에서 완충액을 제거하고 완충액과 분취량으로 두 번 세척합니다. 사용을 위해 복제할 DNA는 Amil lane으로 기능화된 유리 커버 슬립에 부착됩니다.

Amil lane의 옥시 그룹은 유리에 결합하여 아민이 biotinylated peg 분자에 결합할 수 있도록 합니다. 이 코팅은 표면에 대한 비특이적 결합을 줄이는 데 도움이 됩니다. 유리 커버 슬립을 철저히 청소하려면 염색 항아리에 넣고 항아리에 에탄올 초음파 산염을 채 웁니다.

30 분 동안 항아리를 헹구고 1 몰 수산화 칼륨을 30 분 동안 초음파 처리 한 다음 두 번 세척을 반복합니다. 첫 번째 기능화 반응을 위해서는 물의 모든 흔적을 제거해야 합니다. 염색 용기에 아세톤을 채우고 10분 동안 초음파 처리합니다.

항아리를 비우고 아세톤으로 다시 채웁니다. 항아리에 사인 시약을 넣고 2분 동안 교반합니다. 그런 다음 많은 양의 물로 담금질하십시오.

그런 다음 섭씨 110도의 오븐에서 30분 동안 구워 커버 슬립을 건조시킵니다. 다음으로, 페그 혼합물을 부피당 약 0.2%중량으로 준비합니다. 유리 커버 슬립 스페이서를 포함한 비오틴화 페그는 커버 슬립, 피펫 100 마이크로 리터를 건조 사일로화 된 커버 슬립에 분리 할 수 있습니다.

그 위에 두 번째 커버 슬립을 놓습니다. PEG 용액에서 커버 슬립을 3시간 동안 배양합니다. 그런 다음 각 커버 슬립 쌍을 분리하고 물로 광범위하게 씻으십시오.

커버 슬립의 기능화된 면이 위로 향하게 하려면 한쪽 면만 페그로 코팅되므로 주의하십시오. 마지막으로, 커버 슬립을 압축 공기로 건조시키고 진공 상태에서 보관하십시오 건조제에서 표면은 최소 한 달 동안 안정적으로 유지됩니다. 따라서 수십 개의 커버 슬립을 한 번에 만들어 필요에 따라 사용할 수 있습니다.

이제 커버 슬립이 준비되었으므로 단일 분자 실험을 위한 플로우 챔버를 조립할 수 있습니다. 단일 분자 실험은 기능화된 커버 슬립, 양면 테이프, 쿼트 슬라이드 및 튜브로 구성된 간단한 플로우 챔버를 사용하여 수행됩니다. 각 단일 분자 실험에 대해 하나의 플로우 챔버가 준비됩니다.

먼저 5ml의 블로킹 버퍼와 20ml의 작업 버퍼를 혼합하고 혼합물을 건조제에 넣어 이후 단계를 위해 기포를 제거합니다. 다음으로, 페그 기능화된 커버 슬립 인큐베이트 표면에 PBS의 strp din 작업 용액 100마이크로리터를 펴 바르고 strp din이 표면 비오틴과 결합할 수 있도록 실온에서 20분 동안 배양합니다. 한편, 석영 슬라이드의 크기에 맞게 양면 테이프 조각을 자르고 테이프의 튜브 구멍 위치를 표시합니다.

3mm 너비의 중앙 채널과 두 구멍을 모두 포함하는 직사각형을 그려 흐름 챔버의 윤곽을 그립니다. 플로우 챔버는 2개의 입구와 2개의 출구 y자형 채널로 설계할 수 있습니다. 이제 그려진 윤곽을 따라 표시된 테이프를 자르고 접착제가 채널로 튀어 나오지 않도록 직선으로 깨끗하게 자릅니다.

이전 실험에 사용된 플로우 셀 구조에서 접착제를 제거하기 위해 아세톤을 사용하여 석영 슬라이드를 철저히 청소합니다. 채널 윤곽선의 최적 정렬을 찾습니다. 접착 뒷면의 한쪽 면을 제거하고 테이프를 코트 슬라이드에 조심스럽게 놓습니다.

입구와 출구 구멍이 막히지 않은 상태로 유지되어야 하므로 테이프를 올바르게 정렬하도록 주의하십시오. 다음으로, 플로우 셀(flow cell)의 입구와 출구를 위한 0.76mm 내경 튜브의 튜브 절단 길이를 준비합니다. 튜브가 챔버 바닥에 평평하게 눌리지 않도록 튜브의 끝을 약 30도 각도로 자릅니다.

다음 단계에서 플로우 셀에 쉽게 부착할 수 있도록 시험관 랙에 튜브를 매달아 놓습니다. 지금쯤이면 커버 슬립 배양이 완료되어야 합니다. 덮개를 헹구고 물로 완전히 미끄러진 다음 압축 공기를 사용하여 건조시킵니다.

커버 슬립이 뒤집히지 않도록 주의하면 한쪽 면만 페그로 기능화되어 있습니다. 테이프 뒷면의 다른 쪽을 제거하고 석영 슬라이드를 커버 슬립에 올려 놓고 커버 슬립을 가볍게 눌러 접착제에 갇힌 공기를 밀어내어 플로우 챔버의 조립을 완료합니다. 이렇게 하면 기포가 흐름 채널로 들어가는 것을 방지하는 데 도움이 됩니다.

챔버의 측면을 에폭시로 밀봉하십시오. 절단된 튜브를 석영의 구멍에 삽입하고 에폭시로 제자리에 밀봉합니다. 몇 분 동안 말리십시오.

건조되면 21 게이지 니들을 사용하여 챔버 표면을 막기 위해 튜브 중 하나를 통해 완충액을 차단하는 일부 DGA를 당깁니다. 몇 번 플러시하여 기포를 제거하고 단일 분자 복제 실험으로 이동하기 전에 챔버를 최소 30분 동안 배양합니다. DNA 주형이 기능화된 비드와 플로우 챔버가 준비되면 단일 분자 실험을 수행할 수 있습니다.

시작하려면 플로우 셀을 현미경 스테이지에 놓습니다. 스테이지 클립으로 챔버를 제자리에 고정하고 흐름 채널이 CCD 카메라와 정렬되어 배치되었는지 확인합니다. 이전에 구성된 공기가 주사기 펌프와 플로우 셀(flow cell)의 배출 튜브로 분사되는 것에 연결합니다.

더 큰 직경의 커넥터 튜브를 사용하여 플로우 셀의 주입 튜브를 차단 버퍼에 놓고 주사기를 뒤로 당겨 튜브에서 기포를 제거한 다음 배출 튜브를 부드럽게 튕겨 플로우 셀에 갇힌 기포를 제거합니다. 모든 기포가 제거되면 주입 튜브 중 하나를 바늘로 막고 배출 튜브 중 하나를 180도 구부리고 접착 테이프로 고정하여 밀봉합니다.세포에 DNA를 추가하기 전에 스톡 DNA 템플릿을 1밀리리터의 DGA 1 x 차단 완충액에 10피코몰로 희석합니다. DNA의 우수한 표면 커버리지를 허용하기 위해 적당한 유속으로 템플릿을 챔버로 흐르게 합니다.

스톡 비드 용액을 밀리리터당 여섯 번째 비드의 2배에서 4배 사이로 희석합니다. DGA 1밀리리터에서 1개의 블로킹 버퍼. 그런 다음 혼합물을 소용돌이치고 20 초 동안 초음파 처리합니다.

희석된 비드 용액을 챔버로 흘려보냅니다. 비드가 추가되면 흐름을 끄고 챔버가 평형에 도달하도록 합니다. 그런 다음 두 배출 튜브를 모두 닫습니다.

챔버가 닫히지 않은 상태에서 튜브를 변경하면 압력 변동이 발생하여 비드에 강한 힘을 가하고 테더링된 DNA 분자를 전단합니다. 두 번째 입구 튜브를 사용하여 바늘로 비드를 로드하는 데 사용된 입구 튜브를 꽂습니다. DGAs one x solution of blocking buffer wash(블로킹 버퍼 세척)로 플로우 셀(flow cell)을 세척하기 시작합니다.

스테이지를 교반하여 표면에 특별히 붙어 있지 않은 구슬을 탭하여 확인하여 확인합니다. 구슬은 DNA에 묶여 있습니다. 흐름의 방향을 변경해 보십시오.

자유 비드가 충분히 제거되면 흐름을 끄고 챔버가 평형에 도달하도록 합니다. 텍스트 프로토콜에 표시된 대로 복제 단백질을 포함하는 새로운 반응 혼합물을 준비합니다. 열려 있는 배출 튜브를 닫고 주입구 저장소를 새로 준비된 반응 혼합물로 전환합니다.

효소 반응을 진행하기 위해 급격한 압력 변화를 피하기 위해 배출구를 천천히 엽니다. 먼저, DNA에 효율적으로 결합할 수 있도록 단백질 용액을 적당한 유속으로 챔버 내로 흘려보냅니다. 흐름을 끄고 챔버가 평형에 도달하도록 합니다.

배출 튜브를 닫고 반응 혼합물이 들어 있는 튜브를 교체합니다. DGA 세척 완충액으로 구성된 튜브를 사용하여 세척 후 유리 단백질을 제거하기 위해 챔버를 세척합니다. 다시 말하지만, 흐름을 끄고 챔버가 평형에 도달하도록 합니다.

배출 튜브를 닫고 세척 버퍼가 들어 있는 튜브를 교체합니다. T 7 복제 완충액이 포함된 튜브와 함께 T 7 복제 완충액에는 복제 반응의 시작을 유발하는 염화마그네슘이 포함되어 있습니다. 이 프로토콜에 설명된 조건을 사용하여 DNA 테더에 대한 3피코 뉴인 드래그 포스에 해당하는 분당 0.012밀리리터의 유속을 사용합니다.

이미징 전에 flow cell 위에 희토류 영구 자석을 배치하여 비드와 표면 간의 비특이적 상호 작용을 방지합니다. 10 x 대물렌즈 및 CCD 카메라가 있는 현미경 시야 근처의 현미경 스테이지와 평행한 입사각으로 파이버 조명기를 배치합니다. 암시야 조명은 테더링된 비드를 사용하여 비드 이미징 초점의 대비를 높이는 데 사용됩니다.

느린 프레임 속도로 20-30분 동안 데이터 수집 수집을 시작합니다. 성공적인 실험에서는 100개의 구슬을 동시에 관찰할 수 있습니다. 이 실험은 선행 가닥 DNA 합성을 나타내는 수많은 흔적을 산출해야 합니다.

DNA 풀림 및 중합 속도(rate and processive)를 측정하기 위해서는 이를 달성하기 위해 비드의 정확한 위치를 결정해야 합니다. 이러한 위치를 2차원 가우스 함수로 피팅합니다. 추적 소프트웨어를 사용하여 각 프레임의 비드 위치를 추적하여 궤적을 시각화합니다.

그런 다음 속도 데이터를 얻기 위해 그래픽 소프트웨어를 사용하여 시간의 함수로 비드 위치를 플롯합니다. 선형 회귀를 사용하여 플롯을 피팅하고 processive에 대한 기울기를 계산합니다. 단축 이벤트의 시작부터 끝까지 DNA의 총 길이를 결정합니다.

모든 단일 측정값을 결합하고, 가우스 함수와 단일 지수 함수를 각각 사용하여 데이터를 피팅하고, 율 분포와 생산성 분포를 표시합니다. 지금까지 단일 분자 수준에서 DNA 복제 속도와 진행 과정을 측정하는 방법을 보여드렸습니다. 이 절차를 수행할 때 층류에 의한 힘과 특정 베팅이 복제 단백질의 효소 활성에 영향을 미치지 않는지 확인하는 것이 중요합니다.

그게 다야. 시청해 주셔서 감사드리며 실험을 재미있게 진행해 주세요.