에서 독소 유도와 단백질 추출 Fusarium 종. 문화

이 비디오는 ome 종에서 독소 synesis를 유도하는 데 사용되는 절차(이 경우)와 우리 실험실에서 단백질체학 연구에 사용되는 전체 단백질 추출을 위한 프로토콜에 대해 설명합니다. 시술 기간은 16일, 곰팡이 성장은 4일, 독소 시네시스는 10일, 단백질 추출은 2일입니다. 4일이 지난 후에도 군체는 여전히 판의 가장자리를 향해 활발하게 성장하고 있습니다.

전형적인 공중 균사체가 형성되고 판 유동 상자 아래의 스테로이드 블레이드를 사용하여 판 표면을 부드럽게 긁어 수집합니다. 균사체는 5개의 작은 조각으로 절단되어 25ml의 독소 유도 매체가 들어 있는 초기 플라스크에 추가됩니다. 독소 유도는 어두운 먼지보다 더 효율적입니다.

플라스크는 알루미늄으로 덮여 있습니다. 그런 다음 배양물을 섭씨 25도에서 분당 150회씩 10일 동안 흔듭니다. 매체는 SAPH이며 고농도 S 열 용액을 포함합니다.

어둠과 함께 침대는 리아에서 독소 공감각을 촉진하는 것으로 알려져 있습니다. 그런 다음 균사체는 MI 폐쇄 조직에서 여과하여 액체를 포함하는 독소에서 분리됩니다. 액체는 독소 함량을 측정하는 데 사용할 수 있으며 균사체는 단백질 추출에 사용됩니다.

매체가 이월되는 것을 방지하기 위해 천장을 멸균수로 세 번 씻습니다. 과도한 물은 제거해야 합니다.그 후 액체 질소와 같은 것을 첨가하고 샘플을 영하 80도로 저장하거나 단백질 추출에 사용할 수 있습니다. 단백질 추출 절차는 SDS 및 TCA의 사용을 기반으로 하며 다양한 용해 단계로 구성됩니다.

그는 여러 작업자를 포괄하는 방법을 제안할 것입니다. 생물학적 복제물의 추출과 동시에 다른 작업자가 각 복제를 수행합니다. 이 절차에서는 반복실험을 처리하는 여러 작업자가 생성할 수 있는 추출 절차의 차이점을 고려합니다.

따라서 생물학적 복제물을 비교할 때 연산자 변수가 복제에 포함되므로 더 높은 견고성을 보여야 합니다. 동시에 여러 연산자를 사용하면 처리 시간이 단축됩니다. 샘플은 균사체가 미세한 분말이 될 때까지 액체 질소를 사용하여 멸균 모르타르에서 분쇄됩니다.

이 단계는 단백질의 질과 양에 매우 중요합니다. 균사체는 10 밀리 테프론 튜브에 튜브 총 부피의 10분의 4의 비율로 수집됩니다. 그런 다음 SDS 및 다른 프로테아제 억제제를 포함하는 용해 완충액을 첨가합니다.

그런 다음 균질한 용액이 얻어질 때까지 튜브를 흔듭니다. 그런 다음 샘플을 코드 챔버에서 30분 동안 흔들어 더 균질화하고 세포벽과 소수성 단백질을 용해하기 위해 샘플을 끓입니다. SDS의 존재는 단백질의 침전을 중단하는 올리고머의 형성을 방지합니다.

원심분리 단계는 3상을 분리합니다. 단백질은 얼음 위에 보관된 새 튜브에 수집된 투명한 용액에 부유합니다. 그런 다음 팔레트는 두 번째 ly 단계를 수행하여 와류, 끓임 및 원심 분리를 반복하는 데 사용됩니다.

두 lysis의 snat는 빙하 침전, 산성, 삼산성 및 DTT를 포함하는 완충액으로 침전을 수행하기 위해 결합됩니다. 그런 다음 샘플을 섭씨 영하 20도에서 16시간 동안 밤새 보관하여 단백질을 허용합니다. 침전 단백질은 침전을 개선하기 위해 튜브 바닥에 위치합니다.

튜브는 45분 동안 고속으로 원심분리됩니다. 이제 입천장이 잘 보입니다. 상층액은 5밀리리터 파이프 패드를 사용하여 폐기할 수 있습니다.

그런 다음 아세톤과 DTT가 포함된 25ml의 빙하 세척 버퍼를 추가하여 TCA를 제거합니다. 그런 다음 철저하고 격렬하게 흔듭니다. 그런 다음 새로운 원심분리 단계가 수행됩니다.

단백질 입천장은 이제 떠 있기 때문에 뾰족한 단백질을 제거하기 위해 장력을 가해야 합니다. 두 번째 세척 단계를 수행하여 세척, 완충액, 진탕 및 원심분리를 추가합니다. SUP 작용제가 제거되고 스피드 백을 사용하여 시료를 건조합니다.

샘플이 건조되면 단백질은 농도와 같은 분말입니다. 보관합니다. 샘플: 플라스틱의 정전기 간섭을 줄이기 위해 튜브에서 단백질을 채취해야 합니다.

정전기 권총을 사용하고 금속 주걱을 사용하여 단백질 분말을 수집합니다. 그런 다음 단백질은 라벨링 버퍼에 직접 부유되어 재생됩니다. 분당 800g으로 30분 2D 대시에 사용됩니다.

가용화에 충분합니다. 고가의 2D 대시 라벨링을 진행하기 전의 단백질. 단백질 품질은 보시다시피 SDS 페이지 1차원 겔에서 테스트됩니다.

차선 가장자리에 유의미한 번짐이 없다는 것은 샘플의 품질이 양호하다는 것을 의미합니다.